AISLAMIENTO DE SUSTANCIAS POR CROMATOGRAFA Liliana V. Monsalve Z, Wilmar Agudelo S, David A. Tobn M.

Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia Medelln, Colombia.

INTRODUCCIN La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los mismos. En los dos artculos seleccionados se usaron diversos mtodos cromatogrficos para aislar algunas sustancias qumicas contenidas en seres vivos como plantas y animales. El primer artculo se bas en una investigacin cuyo fin era inhibir la simbiosis existente entre la hormiga cortadora de hojas (Atta sexdens rubropilosa) y el hongo (Leucoagaricus gongylophorus especie de hormiga es considerada el herbvoro dominante en los trpicos, esto se ve evidenciado en la masiva destruccin de plantas ocasionada por la hormiga, ya que estas utilizan las hojas de diversas plantas para el cultivo del hongo que luego ser utilizado como alimento, propagando as la reproduccin de este. El trabajo realizado en el segundo artculo tena como objetivo aislar dos aminocidos libres, presentes en la hemolinfa de dos especies de insectos: gusano de seda y polilla de la madera del roble japons (Bombyxs mori y Antheraea pernyi, respectivamente). EXPERIMENTO Para el aislamiento, purificacin y preparacin de Xanthyletin por HSCCC (Cromatografa a contracorriente de alta velocidad) se utiliz un PC Inc. (Potomac, MD, EE.UU). Un instrumento equipado con una bobina cudruple de 1,68 mL I.D. politetrafluoroetileno (PTFE) tubular y la capacidad total de 443 mL. Este aparato genera una velocidad de revolucin que puede ser controlada con un regulador de velocidad en el intervalo entre 0 y 1000 rpm. El flujo de la sustancia fue controlado con un FMI-50-O QD SSY, BS/BS (Medidor de fluidos, Nueva York,

EE.UU) las porciones de las muestras se obtuvieron con un colector de fracciones automtico DC-1200(Eyela, Sunnyvale, CA, EE.UU). La cromatografa de gases y espectrometra de masas (GC-MS) se realizaron en un Shimadzu GC-17A (Tokio, Japn) acoplada a un instrumento QP5000 tambin Shimadzu (EIMS) del sistema. La cromatografa lquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC) se realiz mediante dos bombas de Shimadzu (LC-10AD y ADUVP LC10) y un detector de UV SPD-M10Avp fijado en 205 nm. El grado HPLC de solvente fue obtenido de Mallingckrodt y el agua se purific en un sistema Milli-Q. Los datos del espectro de masas se adquirieron en modo de iones positivos en un triple cudrupolo Micromass cuattro LC espectrmetro (Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente Z- Spray API de iones y unas sondas de electrospary MegaFlow. Para el aislamiento de los aminocidos Lantionina y Cistationina todos los reactivos utilizados fueron de grado analtico y los disolventes para la cromatografa se purificaron por destilacin fraccionada. Se utilizaron las siguientes resinas de intercambio inico: Dowex 500W-X4, forma H+ (10C-200 malla); Dowex 500W-X4NH, forma H+ (100-200 malla); y ArnberliterCG-120(tipo I), forma H+ (1W200 malla). Antes de utilizar todas las resinas se recicla repetidamente por el paso a travs de las formas Na+ y H+ o NH 4+ y H+ y se lav exhaustivamente con agua. Preparacin de extractos sin protenas Las hemolinfas de B.mori y A.pernyi fueron desproteinizadas mediante la adicin de un volumen = 0.5N de cido perclrico. Otros especmenes se desintegraron en un Nalco homogenizador en presencia de un volumen= 0.5N de cido perclrico o molidos a un polvo fino en nitrgeno lquido y suspendidos en un volumen aproximadamente igual de cido perclrico 0.5N. La protena precipitada se separarn por centrifugacin y los Despus de su enfriamiento a 2C, se ajustaron a pH 7.0 por adicin de 5N de KOH. El KClO4 precipitado se separ y los extractos se adsorbieron sobre columnas de Dowex 50-H+. Las columnas se lavaron luego con agua hasta que el

efluente era neutral despus de lo cual, el material adsorbido fue eluido con 2.5N de NH4OH. Los eluidos se evaporaron a sequedad en vaco a 40C y los residuos se disolvieron en un pequeo volumen de agua. Estas soluciones se almacenaron a 10C y fueron los materiales base para todos los experimentos cromatogrficos y el aislamiento. RESULTADOS Y DISCUSIN Para el aislamiento del metabolito Xanthyletin contenido en plantas del gnero Citrus, se utilizaron varios mtodos cromatogrficos, primero se aisl y purific por HSCCC

obteniendo un total de cien fracciones de diez mililitros cada uno con un colector de fracciones automatizadas. En el anlisis de estas fracciones

REFERENCIAS http://www.sciencedirect.com/science/art icle/pii/S0021967309002179 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi0 0856a03