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ACCIÓN BACTERICIDA DE BACTERIAS ACIDOLACTICAS CONTRA LISTERIA MONOCYTOGENES SEROTIPO 4b.

María Consuelo Vanegas L, Lina María González G, Aida Juliana Martínez, María Carolina Vives H, Stefany Alejandra Arévalo M.

Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos (LEMA), Departamento de Ciencias Biològicas, Universidad de Los Andes, Cra 1 # 18ª 70, J 209 Tel: 3394949 (ext 2792), Fax:

3394949 (ext 3339). Bogotá, Colombia.

RESUMEN Listeria monocytogenes un patógeno emergente transmitido por alimentos, de gran importancia a nivel mundial por su alta mortalidad. En Colombia esta bacteria no es de notificación obligatoria, pero se ha encontrado en una gran variedad de alimentos listos para el consumo. El 98% de los brotes por listeriosis se han asociado al serotipo 4b. Las bacterias acidolácticas han sido utilizadas en la industria como biocontroladores de bacterias causantes de deterioro o de patógenos. En este estudio se evalúo la capacidad listericida de Lactobacillus sp (Lac 185 y Lac 276) y Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 023), aisladas de heces de neonatos y leche materna. Ochenta y cuatro cepas de Listeria monocytgenes grupo 4b aisladas diferentes fuentes como alimentos, muestras clínicas, ambientes y animales.Adicionalmente se evaluó el efecto antagonista sobre tres cepas de referencia (L.monocytogenes ATCC19115, L.inocua ATCC 33090 y L.ivanovii ATCC 19119). Se encontraron zonas de lisis alrededor de los inóculos de las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium en 55 de los 84 ensayos de difusión en placa. Los Lactobacillus presentaron una actividad listericida similar a la de las cepas de Bifidobacterium.

Palabras clave: Bifidobacterium, Lactobacillus, Antagonismo, L.monocytogenes 4b.

ABSTRACT Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen of great importance worldwide for its high mortality rates. In Colombia this bacterium is not notifiable, but it has been found in a wide variety of ready to eat food. 98% of listeriosis outbreaks have been associated with 4b serotype. Lactic acid bacteria (LAB) have been used in industry as a biocontrol of spoilage bacteria or pathogens. In this study we evaluated the ability of Lactobacillus (Lac 185 and Lac 276) and Bifidobacterium sp (Bif 013 and Bif 023) isolated from neonatal feces and breast milk to inhibit L.monocytogenes. Eighty-four strains of L.monocytgenes 4b serotype isolated from different sources such as food, clinical samples, animals, food procesing environments and three reference strains (L.monocytogenes ATCC19115, L. inocua ATCC 33090 and L.ivanovii ATCC19119) were evaluated. Lysis zones were found around the inoculum of Lactobacillus and Bifidobacterium in 55 of 84 plate diffusion tests. Lactobacillus showed similar listericidal activity than Bifidobacterium.

Keywords: Bifidobacterium, Lactobacillus, Antagonistic activity, L.monocytogenes 4b

INTRODUCCIÓN

Las bacterias acidolácticas (BAL) son gram positivos de forma bacilar o cocoide, considerados benéficas para la salud humana, son utilizadas como probióticos o aditivos alimenticios, reconocidas como seguras por la USA Federal Drug Administration (FDA). Son de gran potencial biotecnológico, por lo cual se

utilizan como iniciadores en procesos fermentativos para alimentos destinados al consumo humano, bebidas alcohólicas y productos para animales (Reseña:

Lactobacillus spp.:Importantes promotores de actividad probiótica, antimicrobiana y

bioconservadora).

como cultivos bioprotectores, pueden ser considerados aditivos que además de aumentar la inocuidad microbiológica de los alimentos porque reducen el crecimiento de patógenos y microorganismos deteriorantes, confieren características organolépticas deseables. (Holzapfel et al., 1995).

utilizadas

Las

BAL

Como se mencionó anteriormente, esta clase de bacterias controlan el desarrollo de microorganismos patógenos presentes en materia prima o contaminantes en la línea de producción (Alvarado et al., 2009).La capacidad antimicrobiana de las BAL se atribuye a la producción de metabolitos secundarios como bacteriocinas, ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, acetaldehído y otros compuestos como acetato, etanol, CO 2 , formato y succionato a partir de carbohidratos fermentables (Fernandez et al., 2002, Alvarado et al., 2009).

Otro autores han argumentado que el mecanismo de interacción entre las bacterias acidolácticas y los miembros de la microbiota o patógenos oportunistas en el intestino es muy similar al modelo de exclusión competitiva en mamiferos, en el cual el factor determinante es la adherencia al epitelio intestinal, el

desplazamiento es físico y la competencia es por el espacio (Velraeds et al. 1996).

La bioconservación, definida como la extensión de la vida útil de los alimentos utilizando su microbiota o metabolitos, es un proceso que aprovecha la capacidad de la microbiota autóctona para inhibir el crecimiento y actividad perjudicial de microorganismos deteriorantes o agentes patógenos. Los procesos de bioconservación utilizados en la industria involucran la utilización de cultivos protectores y sustancias producidas por algunas bacterias. Múltiples ensayos desarrollados a nivel mundial, dan como resultado el uso de consorcios bacterianos, extractos, productos de la fermentación de bacterias acidolácticas (Pediococcus acidilactici, Mezcla de cultivos ácido-lácticos y extracto de especias, Cultivo de Lactobacillus curvatus, Fermentado de Lactobacillus curvatus) y metabolitos como la enterocina AS-48 producida por Enterococcus faecalis (Sanchez et al., 2008), para el biocontrol de patógenos como L.monocytogenes, S. typhimurium y E.coli en productos frescos como vegetales, hortalizas, pescado y productos cárnicos listos para el consumo (Trias et al., 2008; Andersen et al., 1995). El IPLA, Instituto Productos Lácteos de Asturias, ha identificado sustancias enzimáticas bacterianas con acción antimicrobiana sobre S.aureus, a partir de un virus bacteriófago, dichos metabolitos serán probados como bioconservantes para productos lácteos y derivados (Consumer 19 de Marzo de 2009). Alguno reportes indican, que aunque la capacidad antagonista de los organismo bioprotectores depende de la bacteria con la cual compiten (Trias et al., 2007, Stern et al., 2006), se ha documentado una efectividad del 100% en contra de Listeria monocytogenes, un patógeno, transmitido al hombre por el consumo de alimentos contaminados (Schmid et al., 2005;

Unnerstad and Helle.2001), que se considera responsable del 80% de los casos de listeriosis humanas, a este respecto, estudios han documentado que dentro de los serotipos más comúnmente asociados a brotes epidémicos se encuentra el 4b (Doumith et al., 2004), sevorar altamente virulento que actualmente se sabe circula en nuestro país y es ubicuo en plantas de procesamiento y alimentos (Doumith et al.,

2004).

En Colombia, se ha reportado una alta frecuencia alimentos contaminados con L.monocytogenes, tales como quesos, leches, alimentos listos para el consumo y cárnicos (Rueda, 2005; Vanegas et al, 2006). Sin embargo son muy pocos los estudios epidemiológicos disponibles, fundamentalmente porque esta enfermedad no es de notificación obligatoria ni a nivel clínico ni en la industria de alimentos (Crespo et al.;

1999)

El objetivo de este estudio, fue la determinación de la capacidad Listericida de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp aislados de microbiota humana, en contra cepas colombianas de Listeria monocytogenes serotipo 4b, los cuales podrían tener aplicación como prebióticos o bioconservantes de alimentos.

MATERIALES Y METODOS

Cepas: Las cepas de Lactobacillus sp (Lac 185, LAC 276) y las cepas de Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 026) empleadas en este estudio, fueron aisladas de leche materna y heces de neonatos, en investigaciones previas. Las acido lácticas fueron recuperadas en caldo Man Rogosa and Sharpe Broth (MRS Broth) (Scharlau, España) y sembradas en agar Man Rogosa y Sharpe (MRS) (Sharlau, España) e incubadas a 30 ºC por 3 días sin agitación y en atmósfera rica en

CO 2 (Gonzales, 2008). Las cepas fueron conservadas a corto plazo en tubos inclinados de MRS y a largo plazo en MRS con 30% de glicerol. Fue empleada la cepa de referencia Bifidobacterium breve ATCC 15700 como cepa control.

Ochenta y un (81) cepas de Listeria monocytogenes serotipo 4b (Tabla 1), aisladas de diferentes fuentes (50 cepas aisladas de alimentos, 21 asilamientos clínicos humanos donados por la Secretaria de Salud de Bogotá D.C., 8 cepas ambientales y 2 cepas de animales (LMO 200, LMO 201), previamente serotipificadas molecularmente por el Laboratorio de Ecolología Microbiana y de Alimentos LEMA (Vanegas et al., 2009), además de L.monocytogenes ATCC19115, L. inocua ATCC 33090 y L.ivanovii ATCC 19119, fueron reconstituidas e incubadas a temperatura permisible por 24 horas en Caldo BHI (Brain Heart Broth Difco) y posteriormente, sembradas en tubos de SPC (Estándar Plate Count Agar- Scharlau) para su mantenimiento a 8°C.

Determinación de la capacidad antagonista: El efecto de inhibición de cada una de las cepas de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp aisladas contra cada una de las Listerias serovar 4b y las 3 cepas de referencia de Listeria (ATCC), se llevó a cabo con la metodología de la gota y difusión en doble capa, descrito por Botina., 2008 brevemente, 5 µL de cada uno de los cultivos overnight de las cuatro cepas (2 cepas de Lactobacillus sp y 2 cepas de Bifidobacterium sp) crecidas en caldo Man Rogosa and Sharpe (MRS) (Sharlau, España) por 3 días, fueron fijadas por 3 horas sobre placas de petri con 10 mL de Plate Count Agar (SPC) (Scharlau, España). Posteriormente, se adicionaron 9 mL del mismo medio de cultivo inoculado con 10 µL de cada una de las 87 cepas de Listeria crecidas en

caldo BHI (Difco, USA) por 24 horas. Cada ensayo fue incubado a temperatura óptima durante 48 horas. El efecto inhibitorio fue medido acorde con la presencia de halos de inhibición alrededor de los inóculos de las cepas de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

El efecto inhibitorio de las cepas de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp, fue determinado de acuerdo a la presencia de halos de inhibición alrededor de los inóculos bacterianos (Fernandez et al.,

2003).

Los Lactobacillus presentaron una actividad listericida similar a la de las Bifidobacteras. La actividad bactericida de Lac 185 y Lac 276 fue del 51.2% (43 cepas) y 53.6% (45 cepas) de las Listerias monocytogenes grupo 4b respectivamente, resultados que concuerdan con los obtenidos por Gilliland

y Speck (1997) quienes reportaron las

propiedades antibacteriales de Lactobacillus en contra de bacterias Gram positivas como L.monocytogenes, lo anterior también fue reportado por Hechard y colaboradores quienes aislaron cepas de leche de cabra y evidenciaron que éstas también eran capaces de inhibir bacterias como Listeria y S.aureus, dicha capacidad listericida ha sido atribuida a la producción de compuestos como ácidos orgánicos, peróxidos, bacteriocinas o a la sinergia entre ellos. (Gilliland et al., 1997, Hechard et al., 1990)

El comportamiento presentado por las dos

cepas de Lactobacillus sp aisladas de leche materna es muy parecido, pues en

términos generales Lac185 y Lac276 inhibieron a las mismas cepas de L.monocytogenes (Tabla 1).

Los porcentajes obtenidos con las cepas de Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 023) aislados de heces de neonatos, fueron del 46.4% (39 cepas) y 44.0% (37 cepas), esto puede ser atribuido a la capacidad antimicrobial del acido láctico y acético derivado del metalismo de la glucosa en bacterias de este género (Klein et al; 1998). El 18.0% de las Listerias serotipo 4b (15 cepas: 7 de alimentos, 5 de clínica, 1 de animales y 1 de ambientes) fueron inhibidas por todas las cepas de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp, resultados que concuerdan con los datos existentes acerca de la actividad listericida de algunas géneros bacterianos como Leuconostoc sp (Harding and Shaw 1990), Carnobacterium sp (Jack et al. 1995, Enterococcus sp (Kawamoto et al. 2002, Ennahar et al. 1999) y Lactobacillus sp (Katla et al. 2002) este último, muy estudiado por su uso como agente antilisterial debido a la producción de bacteriocinas (Nielsen et al., 1990; Berry et al., 1991; Vignolo et al., 1996; Bredholt et al.,1999; Matagaras et al., 2002; Juven et al., 1998; Devlieghere et al., 2004). No hubo inhibición para 33 cepas de Listeria monocytogenes 4b, lo que implica que están circulando cepas resistentes de este patógeno a la acción de los antimicrobianos producidos por estas BAL. Respecto al comportamiento de las cepas de referencia, se obtuvo que Listeria monocytogenes (LMO 369,) y Listeria ivanovii (LMO 368), fueron sensibles a las 4 cepas de BAL probadas, mientras que L.innocua (LMO 367) solo fue inhibida por Lac 185 (Tabla 2.), llama la atención el hecho de que la cepa de B. breve ATCC 15700, no inhibió a ninguna de las 3 cepas de referencia (LMO367, LMO368 y LMO369 (Tabla 2).

Tabla 1. Resultados del ensayo de antagonismo entre las cepas de Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp y Listeria monocytogenes serotipo 4b de aislamientos colombianos.

 

PRESENCIA DE HALO DE INHIBICIÓN

 
 

LAC

LAC

BIF

BIF

ATCC

TOTAL

CEPAS

185

276

013

023

15700

CEPAS

LMO 037, LMO 038, LMO 042, LMO 094, LMO 135, LMO 176, LMO 177, LMO 179, LMO 186, LMO 188, LMO189, LMO 200, LMO 357, LMO 364, LMO 365

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

 

15

LMO 06, LMO 026, LMO 027, LMO 133, LMO 134, LMO 181, LMO 191, LMO 193, LMO195, LMO 356, LMO 360, LMO 362, LMO

           

(+)

(+)

(+)

(+)

(-)

13

 

363

LMO 035, LMO 036, LMO 049, LMO 069, LMO 164

(-)

(+)

(+)

(+)

(+)

 

5

LMO 07

(+)

(-)

(+)

(-)

(-)

1

LMO 190

(+)

(+)

(-)

(+)

(-)

1

LMO 172

(+)

(-)

(+)

(+)

(-)

1

LMO 077

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

1

LMO 063, LMO 175, LMO 178, LMO 361,

(+)

(+)

(-)

(-)

(-)

 

4

LMO 355

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

1

LMO 359

(+)

(+)

(+)

(-)

(+)

1

LMO 362

(+)

(+)

(-)

(+)

(+)

1

LMO 206

(-)

(-)

(+)

(-)

(-)

1

LMO 031

(-)

(-)

(-)

(+)

(-)

1

LMO 182, LMO 183, LMO 201, LMO 358

(+)

(+)

(+)

(-)

(-)

 

4

LMO 202

(-)

(+)

(+)

(-)

(-)

1

LMO 010, LMO 011, LMO 018, LMO 019, LMO 039, LMO 040, LMO 043, LMO 044, LMO 052, LMO 055, LMO 067, LMO 076, LMO 079, LMO 095, LMO 111, LMO 113, LMO 117, LMO 162, LMO 184, LMO 185, LMO187, LMO 192, LMO 194, LMO 204, LMO 307,

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

 

33

LMO 312, LMO 315, LMO 319, LMO 323, LMO 327, LMO 351, LMO 352, LMO

           

354,

TOTAL

43

45

39

37

22

84

% Cepas inhibidas

51,2

53,6

46,4

44,0

26.2

 

y solo tuviera el potencial para inhibir al 26.2% (22 cepas) de las Listerias serovar 4b colombianas, lo anterior puede ser explicado por qué las bacteriocinas de clase II, son muy eficientes eliminando las cepas bacterianas pero usualmente no dejan marcas visibles de inhibición (Ennahar et al., 1999). A nivel comparativo, vale mencionar que los aislamientos colombianos (LAC185, LAC 276, BIF 013 y BIF 023) presentaron

mayor capacidad listericida que la cepa de referencia pues esta ultima solo fue capaz

de inhibir al 26.2% (22 de las 84) de

Listerias serovar 4b, resultado que evidencia la presencia de características

diferenciales entre las cepas colombianas

y la referencia. Se debe continuar

estudiando y caracterizando la genética y fisiología de de estas cepas para que puedan ser utilizadas como agentes

antimicrobianos a gran escala.

Tabla 2. Resultados del ensayo de antagonismo entre las cepas de Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp y las Listerias de referencia ATCC.

 

PRESENCIA DE HALO DE INHIBICIÓN

 

LAC

LAC

BIF

BIF

ATCC

 

CEPAS

185

276

013

023

15700

 

L.

monocytogenes

(+)

(+)

(+)

(+)

(-)

ATCC19115

L.

ivanovii ATCC 19119

(+)

(+)

(+)

(+)

(-)

L.

innocua ATCC 33090

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

CONCLUSIONES

Se determinó que el efecto antagónico de las cepas aisladas de leche materna (LAC 185 y LAC276) es mayor que el de las Bifidobacterias (BIF 013 y BIF 023) aisladas de neonatos lactantes. Adicionalmente las Listerias serotipo 4b aisladas de alimentos procesados y origen clínico son altamente sensibles a los agentes antibacteriales segregados por las bacterias lácticas.

Todas las cepas evaluadas en este estudio tiene potencial como agentes bioprotectores, sin embargo, LAC 185 presentó una actividad listericida superior a la de las demás cepas probadas y tuvo la capacidad inhibir cepas de Listeria 4b aisladas tanto de alimentos, como animales y ambientes.

AGRADECIMIENTOS

Doctor Cotrino por la donación de las cepas de L.monocytogenes aisladas de animales (LMO 200 y LMO 201) empleadas en este estudio.

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