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Ctedra de Microbiologa Fernanda Villalobos.

Escuela de Odontologa

Universidad de Valparaso

Laboratorio n1: Tincin Gram Actividades a realizar: 1. Observacin macroscpica con lupa estereoscpica de colonias bacterianas. En placas de exposicin ambiental incubadas a T ambiente. 2. Elaboracin de un frotis 3. Aplicar coloracin Gram 4. Observacin microscopica de la muestra. (MO) objetivo 1000x (con aceite de inmersin). Morfologa bacteriana: estado vegetativo, cada especie microbiana esta conformada por bacterias de una forma determinada que no cambiara nunca en condiciones normales y favorables Formas tpicas: cocos (forma esfrica, ej. estafilococos), bacilos (forma alargada, ej. E. coli), espirilos (forma helicoidal, ej. espiroquetas de la sifilis). Formas intermedias: cocobacilos (bacilos cortos, ej. bacilo haemophilus), vibriones (bacilos con curvatura permanente, ej. vibrion del colera). Formas de resistencia: Esporas (especies microbianas para sobrevivir a condiciones adversas modifican su estructura a esferica u oval y al encontrarse nuevamente en condiciones favorables vuelven a su forma original, ej. bacilo del ttanos, bacilo botulnico). Colonia: desarrollo aislado de un cepa microbiana. Tamao (en mm.) y aspecto caracterstico de cada especie. De acuerdo a la tcnica seguida en la siembra del germen al estado puro, podemos describir su desarrollo: en picadura en pelcula en colonias aisladas en la superficie en colonias aisladas en profundidad la tincin no depende de la membrana, depende de la pared y la fijacin de lugol bacterias fijadas y coloracin: Etapas de la confeccin de un frotis (muestra a examinar sobre un portaobjetos): Extensin: poner la muestra en el portaobjeto. Si la muestra es liquida se pone una gota en el centro y se extiende de forma homognea sin llegar a los bordes con una pipeta de pasteur o con un asa de platino, si es solida se pone una gota de suero y se extiende. Secado: al aire o calentando suavemente con un mechero. Fijado: la muestra se puede adherir al portaobjeto con el calor del secado o con alcohol. Tcnica de coloracin de Gram: (por Gran en 1884) clasifica las bacterias en Gram+ (se tien azul violeta) y Gram- (rojo). 1. rotular 2. - suspender la muestra - muestra directa - secar 3. le colocamos el 1er colorante, Cristal Violeta, por 2 minutos, donde se van a teir todas las bacterias susceptibles. 4. Colocar Lugol (solucin de yodo yodurada) un minuto y decolorar (el lugol decolora) con

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alcohol o acetona y lavar con agua. 5. Coloco colorante, Fucsia Fenicada por 1 minuto, y lavar con agua. 6. Secar con papel absorbente y flamear suavemente. Gram +: bacilos estreptococos estafilococos diplococos gram + laptoelado Gram -: bacillus grandes y pequeos vibrios (no hay en la boca) treponema esputigeno (saliva) estafilococos

notas: las esporas quedan blancas, no se tien. Las nicas espiroquetas que se tien con gram son las bucales. El treponema palidum no se tie con gram. En la boca hay 99% de bacillus gram-. Septicemia: paso de gram- a la sangre. Cndida: levadura bucal (hongo), es por lo menos 10 veces mas grande que un coco. Laboratorio n2: tincin de ziehl- neelsen baar (baciloscopia) Actividades a realizar: 1. Demostracin del profesor de una baciloscopia. 2. Observar las caractersticas de las colonias. 3. Identificar al microscopio la morfologa y coloracin del mycobacterium. Baar: bacilos cido alcohol resistentes (principalmente Mycobacterium). Tienen una pared celular diferente al resto de las bacterias, es muy grande y resistente, no se tie con gram y tiene un alto contenido lipdico (derivados del colesterol) que la hace impermeable a los agentes hidroflicos. Hay que calentar estas bacterias para que los lpidos se licuen y el colorante pueda entrar. La propiedad de cido-alcohol resistencia se manifiesta esencialmente en el genero Mycobacterium (Tambin esporas bacterianas y algunos actinomicetales). Especies de importancia mdica: Formas tuberculosas: tuberculosis: en pulmones, renal, etc. Mycobacterium tuberculosis: bacilo de koch. Mycobacterium bovis

Formas oportunistas: (no tuberculosas) tratamiento emprico (a ojos cerrados). Mycobacterium avium Mycobacterium kansakii Mycobacterium fortuitum Mycobacterium cheloni Mycobacterium leprae lepra: taponea los capilares terminales produciendo necrosis.

Obtencin de muestras y procesamiento Muestras: orina expectoracin (3), LCR, L. pleural.

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Tincin: baciloscopia Cultivo: lowenstein- jensen, tg. M. Tuberculosis. =18 horas (colonias cerebriformes, forma de repollo y color amarillo marfil) Informe: baciloscopia: segn el numero de bacilos contados por campo microscpico. La observacin se debe hacer con lente de inmersin en al menos 5 zonas representativas y un mnimo de 100 campos. Pauta de informe semi-cuantitativo: Ausencia de Baar No se observan Baar en 100 campos microscpicos Baar (+) Baar (++) Baar (+++) Menos de 1 Baar promedio por campo, en 100 campos observados 1 a 10 Baar promedio observados, en 50 campos observados Mas de 10 Baar observados, en 20 campos observados

Si el resultado no es claro se hace cultivo. Revisin de los cultivos: lecturas: 1 Observacin: de 48 a 72 si todos los tubos estn contaminados se hace otra muestra. 2 Revisin: a los 30 dias, se informa lo positivo y la contaminacin tarda. 3 Revision: a los 60 dias, se hace el informe definitivo. Explicacin: Debido a que la baciloscopia puede dar falsos positivos o falsos negativos, se debe cultivar el microorganismo a partir de una muestra, aunque la baciloscopia sea negativa. Se hace generalmente en un medio lowenstein- jensen, una vez inoculada (introducir de forma artificial) la muestra en este medio, se debe incubar a 35C dado que el M. Tuberculosis tiene una Tg de 18 horas, el cultivo se debe incubar por 60 dias, si tras ese tiempo no hay crecimiento la muestra es negativa. Tcnica de coloracin de Ziehl- neelsen: (las Baar se tien rojo) 1. verter sobre el frotis fijado unas 10 a 15 gotas de fucsia ziehl 2. calentar hasta la emisin de vapores. Repetir 1 a 4 veces la misma operacin. 3. Decolorar con alcohol clorhdrico y lavar con agua. 4. Teir con azul de metileno por 1 min. Y lavar con agua. 5. Secar y examinar al microscopio con aceite de inmersin. Notas: Hay que calentar el Baar para que la coloracin penetre, la coloracin en forma de vapor tiene mayor penetracin y el carbol fucsia tie los cido micolicos propios de la pared celular de las micobacterias. Los Baar pueden resistir en el estomago. Para que puede servir una baciloscopia? R: para detectar el Mycobacterium tuberculosis que Baar produce lesin bucal? R: el bacilo de koch Bk: baciloscopia tg: tasa de crecimiento. Es exponencial. En bacterias Aerobias son 20 min., en anaerobios 4 horas. Laboratorio n3: medios de cultivo y siembra. Actividades a realizar: 1. Demostracin de diferentes medios de cultivo. 2. Demostracin de las tcnicas de siembra.

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3. Demostracin de la incubacin de las muestras sembradas. UFC: unidades formadoras de colonias. Aerobias: 24 horas (crecen de ayer a hoy). Anaerobias: 4 horas (crecen maana) Medios de cultivo: preparados estriles nutritivos para crecimiento de microorganismos. Deben tener un pH apropiado a la especie, ser estriles y protegidos del ambiente. Clasificacin segn estado fsico: Liquido: (primeros medios usados, 1857 Pasteur). animal, vegetal, sinttico. solido: (desplazaron a los lquidos, introducidos por Roberto Koch en 1881),agar-agar, albumina animal, vegetal. Semi-solido: con base de agar-agar. Clasificacin: segn complejidad de preparacin y aporte nutricio. Medios corrientes o bsicos: lquidos: caldo corriente, agua peptonada. solidos: agar corriente, gelatina. Medios especiales: mejorados: (se le adicionan sustancias nutritivas) agar sangre (AS), caldo glucosa, mullerhinton (los medios mejorados son para bacterias que necesitan mas aporte nutricio, o sea, son mas exigentes) selectivos o diagnsticos: (se le adicionan inhibidores) A110 (medio para el estafilococo agar 110), loeffler (para el bacilo diftrico), sal-manitol (para el estafilococo aerius (en nariz y piel contaminan heridas)), lowenstein-jensen, macConkey, SS (solo frigera o salmonela), rogosa. diferenciales o indicadores: (se le adicionan indicadores qumicos) TSI, urea, citrato. Siembras. Obtencin de cultivos: siembra: consiste en depositar aspticamente un germen en un medio de cultivo. La finalidad mas importante de la tcnica bacteriolgica es la obtener las especies microbianas en cultivos puros. Toda siembra debe ser en medios de cultivo favorables, esterilizados, con instrumental asptico, sin contaminar o destruir la semilla, depositarla aspticamente en el medio y esterilizar todo el instrumental utilizado inmediatamente despus. Instrumental: alambre de platino (resistencias electricas), pipetas pasteur, pipetas graduadas (siembra), medios de cultivo solidos o liquidos (en tubos, matraces, placas o frascos), mechero. Notas: La operacin se realiza en distinta forma, teniendo en cuenta el material que contiene a la bacteria en estudio y el medio de cultivo. primero toma de muestra, no puede haber sales turbio la mayora de las enfermedades mdicas son monobacteriales. el bacilo antraxis pegan las otras no. el ntrax entra en forma de esporas.

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Laboratorio n4: observacin y estudio de cultivos. Actividades a realizar: 1. aplicacin de una pauta de observacin de los cultivos inoculados. (macroscpica y microscpica). 2. Aplicacin de la tcnica de observacin al fresco con un cultivo en caldo nutritivo inoculado con pseudomonas. Identificacin de especie bacteriana: entre las caractersticas de los cultivos que debemos tomar en cuenta para la identificacin: cualidad del germen aerbico o anaerbico (en relacin a la respiracin microbiana). La rapidez del desarrollo (se toma en cuenta el tiempo desde que se siembra hasta el desarrollo evidente). la T ptima. (segn el mximo desarrollo del germen) caractersticas del desarrollo en un medio liquido o solido. - liquido: enturbiamiento, sedimento, desarrollo en superficie (anillo o velo), Olor, color (produccin de pigmentos), produccin de gas. - solido: desarrollo de colonias a simple vista ( desarrollo en picadura, en pelcula, colonias aisladas en superficie, o en profundidad) su capacidad para desarrollarse en medios corrientes o especiales. Notas: La identificacin de una placa de cultivo puro tambin se puede hacer con ltex (serologa). Colonia: conjunto circunscrito de clulas bacterianas detectables a simple vista, que se desarrolla a partir de un germen en un medio de cultivo solido. Su aspecto es caracterstico de la especie. laboratorio n5: bacterias cocaceas Gram + Estafilococos: importante en piel y nariz, patologas piogenas, exigente. sembrados en agar sangre, sal manitol. * observar en las colonias el cambio de color en el sal manitol y hemolisis en el agar sangre. Estreptococos: sembrados en agar sangre y agar mitis salivarius *observar hemolisis. (streptococcus pneumoniac= & hemoltico; streptococcus pyogenes). laboratorio n6: prueba de sensibilidad a los antimicrobianos (contra bacterias). Antibiograma: las pruebas de sensibilidad evalan la capacidad de un antibitico u otro frmaco antimicrobiano para inhibir in vitro el desarrollo bacteriano. Las pruebas de sensibilidad solo deben efectuarse en cultivos puros previamente identificados. No esta indicado realizar estas pruebas si: a) si se conoce la resistencia del microorganismo, y si hay sospecha clnica de resistencia se debe enviar el cultivo a laboratorios de referencia. b) si el microorganismo es de crecimiento lento o difcil o si requiere de medios enriquecidos (las pruebas de difusin darn resultados poco fiables). c) no es necesario en infecciones intestinales no complicadas, ya que no reportan beneficios para el paciente.

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Hay 2 metodologas: Dilucin: se toman 10 tubos con concentraciones ascendentes y se les coloca una gota de bacteria y se ve en que concentraron (CIM: concentracin inhibitoria mnima) se inhibe el crecimiento de la bacteria, el primer tubo es control y tiene la concentracin mnima de antimicrobiano. Difusin en agar: (sensidiscos) mtodo de kirby-bauer, es el mas practico y el mas realizado en laboratorio, 10 discos impregnados en antibiticos. Mtodo: 1. preparar agar muller-hinton (sin sobrecalentar) 2. enfriar hasta 45C, colocar 4mm de altura en placa petri, dejar en superficie plana. 3. al solidificar el agar deje secar por 30 min a 35C. 4. preparar suspensin de inoculo del cultivo primario en suero salino, ajustar a patrn de turbiedad para obtener una buena capa de desarrollo microbiano. 5. sembrar placas petri: introducir el hisopo estril en el tubo del inoculo y eliminar el sobradante presionando el algodn contra el vidrio de forma rotatoria. Por encima del nivel del liquido. 6. sembrar en estrias apretadas, 3 veces, girando en 60 cada vez. Tapar. 7. colocar los sensidiscos sobre la placa sembrada con pinzas estriles o dispensador. (6-7 sensidiscos por placa) apretar discos con delicadeza para contacto uniforme, dejar a 35C por 18 horas. Despus de la incubacin medir los aros de inhibicin. Principales factores que influyen en el tamao de los halos: 1. densidad del inocuo 2. momento en que se colocan los sensidiscos 3. temperatura de incubacin (no debe ser: >35C o <35C) 4. tiempo de incubacin (de 16-18 horas) 5. tamao de la placa, espesor del agar y separacin de los sensidiscos. 6. Composicin del medio. notas: Se hace la mayora de los antibiogramas en caldo o agar muller-hinton (agar selectivos) Aro amarillo: aro de inhibicin. Dependiendo del dimetro (en mm.) mas efectiva es la bacteria. Mientras mas pequeo mas resistente y menos efectivo. CIM: es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de 10 en 1 ml de medio de cultivo tras 18 hrs. De incubacin, se expresa en ug/ml o mg/ml. CBM: concentracin bactericida mnima. Es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de matar o destruir el crecimiento de 10 bacterias en 1 ml de cultivo as 18 hrs. De incubacin, se expresa en ug/ml o mg/ml.