NEFROLOGIA. Vol. XV. Suplemento 2.

1995

Introduccin a la biologa molecular

J. Dez * y J. M. Lpez-Novoa * * * Departamento de Medicina Interna. Centro de Investigaciones Biomdicas. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra. ** Departamento de
Fisiologa y Farmacologa. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca.

RESUMEN
Los acontecimientos fisiolgicos que acontecen en nuestro organismo estn modulados por mltiples factores actuando a distintos niveles biolgicos: molecular, subcelular, celular, de rgano o de tejido y de organismo completo. Hasta hace poco tiempo, el estudio de las enfermedades humanas consista exclusivamente en el estudio de las anomalas que se producan a nivel del organismo completo o a nivel de determinados rganos o tejidos en particular. En los ltimos aos, los procesos patolgicos se estudian tambin en los niveles celular, subcelular y molecular. Para ello, la medicina ha incorporado la Igica y la tecnologa de la biologa molecular. La biologa molecular estudia fundamentalmente el proceso por el que la informacin contenida en el genoma es transmitido a los elementos de los que se valen las clulas para hacer operativa esa informacin: las protenas. De tal incorporacin estn resultando avances que modifican sustancialmente no slo la comprensin de la fisiopatologa de las enfermedades humanas, sino tambin su diagnstico y, probablemente, su profilaxis y su tratamiento. En esta breve revisin sobre la biologa molecular se considerarn brevemente sus bases bioqumicas y fisiolgicas, sus principales instrumentos metodolgicos y sus aplicaciones en nefrologa. Palabras clave: Genes. Acidos nucleicos. ADN. ARN. Protenas. Clulas.

SUMMARY Physiological events are regulated by a number of factors acting at severa/ levels, ie., molecular, subcellular, cellular, organ-tissue, and whole organism. Classically, the study of human diseases was approached at the whole organism and/or organ-tissue level. Lastly, pathologic conditions are also studied at the molecular, subcellular, and cellular levels. This new approach comes from the development and application of molecular biology to medicine. Molecular biology studies the process by which genetic message is translated into final proteins synthesized by techniques to begin to unravel complex biological problems that have direct relevance to undentanding, diagnosis, and treatment of medical problems. The objective of this article is to provide a comprehensive discussion of the biochemical and physiological foundations of molecular biology and its application to clinical medicine. In addition, this brief review is intented to provide a framework within which evaluate research articles in this field of growing importance to clinical nephrology.
Key words: Genes. Nucleic acids. DNA. RNA. Proteins. Cells.

Correspondencia: Dr. Javier Dez. Departamento de Medicina Interna. Centro de Investigaciones Biomdicas Facultad de Medicina. Irunlarrea, s/n. 31080 Pamplona.

BIOLOGIA MOLECULAR

Evolucin histrica El origen de la biologa molecular data de principios de los aos cuarenta. En aquel tiempo, los bioqumicos haban descubierto muchas reacciones qumicas intracelulares fundamentales y haban comprendido la importancia de las reacciones especficas y de ciertas molculas para definir numerosas propiedades de las clulas. Sin embargo, el desarrollo de la biologa molecular tuvo que esperar a los adelantos que se llevaron a cabo estudiando clulas sencillas tales como bacterias y virus bacterianos (organismos procariticos), los cuales proporcionan informacin acerca de los procesos biolgicos bsicos de una forma ms rpida que las clulas animales (organismos eucariticos). La creencia en la uniformidad bsica de los procesos de la vida fue un factor importante en este rpido desarrollo1. Es decir, se pens que los principios biolgicos fundamentales que gobiernan la actividad de los organismos procariticos; podran aplicarse tambin a los organismos eucariticos, solamente variaran los detalles. Esta creencia ha sido posteriormente ratificada por los resultados experimentales. las bacterias y los virus permitieron a los cientficos identificar un cido nucleco, el cido deoxrribonucleco o ADN, como la molcula que contiene la mayora de la informacin gentica de una clula y la que, a travs de otro cido nucleico -el cido rbonucleico o ARN-, controla gran parte de las funciones celulares, regulando la sntesis de otras molculas, las protenas. Despus de este descubrimiento, el nuevo campo de la gentica molecularavanz rpidamente durante las siguientes dcadas (tabla I), proporcionando nuevos conceptos a una velocidad que slo puede compararse con la del desarrollo de la mecnica cuntica en los atios veinte. Los ltimos aos estn conociendo la aplicacin creciente de la metodologa de la biologa molecular -la denominada tecnologa del ADN recombinante- a la investigacin de aspectos muy diversos tanto de la biologa general como de la medicina y de otras ciencias. Concepto

Tabla I.
1869 1944

Hitos histricos en el desarrollo de la biologa molecular

Miescher aisla por vez primera el ADN. Avery demuestra que durante la transformacin bacteriana es el ADN, y no las protenas, el que contiene la informacin gentica. A partir de los estudios con rayox X efectuados por Franklin y Williams, Watson y Crick proponen que la estructura del ADN se asemeja a la de una doble espiral. Kornberg descubre la ADN polimerasa (enzima que sintetiza ADN). Marmur y Doty desarrollan la tcnica de hibridacin del ADN. Arber descubre las nucleasas de restriccin (enzimas que separan en fragmentos al ADN). Nathans y H. Smith usan esas enzimas para caracterizar la secuencia del ADN. Nirenberg, Ochoa y Khorana descubren el cdigo gentico. Geller descubre la ADN ligasa (que une fragmentos de ADN). Boyer, Cohen y Berg desarrollan las tcnicas de clonacin del ADN.

1953

1957 1961 1962

1966 1967 1972-73

1975.77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert desarrollan mtodos de secuenciacin rpida del ADN. 1981-82 Palmiter y Brinster desarrollan ratones transgnicos.

las funciones desempeadas por las protenas 2 (tabla II), stas son las macromolculas ms importantes de la clula. Pero, al fin y al cabo, las protenas constituyen la expresin molecular de una informacin qumica contenida en y elaborada por los cidos nuclecos ADN ARN. A tenor de todo ello, la biologa molecular podria definirse como aquella rama de la biologa que estudia los mecanismos que regulan la disponibilidad y la actividad de las protenas en las clulas a partir de la informacin gentca contenida en los cidos nucleicos.

Tabla II. Para definir la biologa molecular hay que partir de la consideracin de que una clula contiene entre 10.000 y 100.000 clases de molculas diferentes. Aproximadamente la mitad de estas molculas son pequeas -iones inorgnicos y componentes orgnicos cuyos pesos moleculares generalmente no exceden de algunos cientos-. Las otras molculas son grandes, peso molecular entre10 4 y 1 0 1 2 y se les llama macromolculas. Existen cuatro tipos de macromolculas: protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos, que estn constituidos por polmeros de aminocidos, nucletidos, azcares y cidos grasos, respectivamente. Las macromolculas son esenciales para que acontezcan los distintos procesos que posibilitan la vida de las clulas. En este sentido, y dada la multiplicidad de

Principales funciones de las protenas

Funcin

Tipo de protenas
Enzimas

Regular la transmisin de la informacin gentica Regular el metabolismo de la clula Mantener la configuracin de la clula (citoesqueleto, membrana plasmtica, matriz extracelular) Asegurar la constancia fisicoqumica del medio intracelular Mediar la relacin de la clula con el medio extracelular Transmitir seales entre las clulas

Protenas estructurales

Mecanismos de transporte Receptores, antgenos Hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos

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0+

\p/o

0 Terminacin 5

Terminacin 3

Fig. 1.-Cadena de nucletidos

constituyentes del ADN (G: guanina; C: citosina; T: timina; A: adenina).

El ADN y la sntesis de protenas Estructura del ADN Cada molcula de ADN est constituida por dos polmeros lineales de nucletidos en forma de cadena 3,4 . Cada nucletido consta de una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina) y un azcar (deoxiribosa). Los nucletidos estn unidos entre s por enlaces covalentes fosfodister que unen el carbono en posicin 5 de una deoxiribosa con el carbono 3 de la deoxiribosa siguiente (fig. 1). Watson y Crick 5 avanzaron hace cuarenta aos que las dos cadenas que constituyen cada molcula de ADN se enrollan entre s adquiriendo una configuracin final de doble hlice (fig. 2). Ello es posible porque entre las bases de cada polmero se forman parejas de bases complementarias. Cada pareja est constituida por la unin, a

travs de puentes de hidrgeno, de la adenina de un polmero con la timina del otro y de la guanina de un polmero con la citosina del otro (fig. 2). La distribucin de las bases a lo largo de cada polmero tambin est sometida a unas determinadas normas 6. Concretamente, en ciertas partes de la molcula, que constituyen las secuencias codificantes, ha bases ordenadas en grupos de tres o tripletes, de ta manera que cada uno de estos tripletes constituye una palabra clave o codn que codificar un aminocido determinado. Los codones se hallan presentes slo en ciertos segmentos del ADN, los llamados exones o regiones codificadoras, que constituyen alrededor del 10 % del total de ADN. En otros segmentos, las bases no estn dispuestas formando codones. Entre estos segmentos se cuentan los denominados intrones o regiones intercalares. Los intrones se hallan intercalados entre los exones a lo largo de la molcula de ADN. Tambin hay secuencias repetitvas de ba-

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ses y otros segmentos cuyas funciones se conocen en unos casos y se desconocen en otros. Un gen representa la secuencia completa de bases de ADN que especifica la secuencia de aminocidos de una nica cadena polipeptdica o de una molcula proteica. Ello significa que en el ADN un gen consiste en un nmero vana le de exones y de los intrones entre ellos intercalados. Se ha calculado que el genoma humano (constituido por el conjunto del ADN localizado en los 23 cromosomas de cada clula) consta de 3.000 millones de bases y que codifica entre 30.000 y 100.000 productos gnicos. Transmisin de la informacin gentica: Expresin del ADN en las protenas Que la informacin gentica contenida en el ADN se transmite quiere decir que los genes se expresan en forma de protenas Ello implica que una secuencia lineal de nucletidos ha de ser convertida en una secuencia colineal de aminocidos, lo que acontece a lo largo de una serie de pasos (fig. 3). El primer paso consiste en que el ADN de los cromosomas se transcribe en el ncleo celular a una copia de ARN 4,7. El ARN es otro polmero lineal de nucletidos que se distingue del ADN porque su azcar es la ribosa (en lugar de la deoxiribosa) y porque la timina est sustituida por la uridina o uracilo (otra base capaz de formar una pareja de bases complementarias con la adenina). Durante la transcripcin, los nucletidos del ARN se van alineando a lo largo de uno de los polmeros del ADN -que sirve como molde> del ARN- siguiendo las reglas

ADN .----- Transcripcin 1 NUCLEO ARN c---- Procesamiento I ARN mensajero c---- Transporte I ARN mensajero CITOPLASMA I Polipptido/Protena c---- Transferencia

del emparejamiento de las bases 8. As, la adenina del ADN se empareja con la uridina del ARN, la citosina se empareja con la guanina, la timina con la adenina y la guanina con la citosina. Los nucletidos se unen entre s por accin de una enzima con varios componentes: la ARN polimerasa de tipo ll 8.Un componente inicia la transcripcin cuando reconoce en el ADN una secuencia especfica de nucletidos (denominada seal de iniciacin), otro componente realiza la adicin sucesiva de nucletidos (elongacin de la cadena de ARN) y otro componente finaliza la transcripcin cuando reconoce otra secuencia especfica en el ADN (denominada seal de terminacin). Finalmente, el ARN transcrito y la ARN polimerasa se separan del ADN. Hay que sealar que la transcripcin del ADN da lugar a una copia fiel de toda la secuencia gnica; as, en el ARN transcrito tambin alternan los exones y los intrones Pero el ARN transcrito, antes de salir al citoplasma es sometido en el ncleo a un procesamiento que elimina los intrones y posibilita que los exones se agrupen para formar un solo gen continuo 9. De esta manera, el ARN transcrito resultante constituye el molde necesario para la traduccin en forma de secuencia de aminocidos de una protena. Este es el ARN denominado ARN mensajero. El ARN mensajero abandona el ncleo y penetra en el citoplasma, donde se asocia a los rbosomas, que son grandes complejos de ARN (ARN ribosmico) y protenas. Una vez en ellos, la sntesis tiene lugar mediante la participacn de otro tipo de ARN (denominado ARN de transferencia o translacin) unido especficamente a cada uno de los 20 aminocidos existentes en las clulas. Cada ARN de transferencia contiene un triplete de bases complementarias de las existentes en un codn especfico del ARN mensajero. Las molculas del ARN de transferencia, con su aminocido correspondiente, se alinean a lo largo de la molcula del ARN mensajero en el orden preciso dictado por la secuencia de codones de ste. Por la accin de ciertas enzimas ctoplsmicas (aminoacl transferasas) se forman enlaces peptdicos entre los diversos aminocidos, y la cadena polipeptdica o la protena completa as formadas se desprenden del ribosoma 10. Regulacin de la expresin gnica Los distintos tipos de clulas existentes en los organismos pluricelulares deben su diversidad al hecho de que expresan distintos genes. Ello es debido a que en cada clula la expresin de sus genes est regulada. La regulacin de la expresin gnica puede hacerse a tres niveles11,12: 1) Nivel transcripcional, en el que se regula cmo es transcrito el ADN en el ARN de transcripcin. 2) Nivel postranscripcional, en el que se regulan el procesamiento del ARN transcrito hasta su conversin en ARN mensajero, el transporte del ARN mensajero desde el ncleo hasta el citoplasma y la o transferencia translacin de los codones del ARN mensajero a los aminocidos del ARN de trans7

Fig. 3.-Proceso de transmsin de la informacin gentica del ADN

las protenas.

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lacin. 3) Nivel de protena, en el que se regula la estructura y la actividad de las protenas sintetizadas. La regulacin a nivel transcripcional es la ms importante de las tres 13 . Esta regulacin es ejercida por las Ilamadas protenas reguladoras de genes o factores de transcripcin. Se trata de unas protenas existentes en el ncleo que reconocen en el ADN secuencias especficas de nucletidos a las que se unen. Esta unin hace que en unos casos se faciclite la transcripcin de un gen adyacente o alejado y que en otros casos se inhiba. A las secuencias de ADN que facilitan la transcripcin se las denomina promotoras o intensificadoras segn que faciliten el inicio o la continuacin de la transcripcin, respectivamente. Se sabe actualmente que la transcripcin de un gen est regulada por una combinacin de protenas reguladoras facilitadoras y de protenas reguladoras inhibidoras. Asimismo, se sabe que existen protenas reguladoras, llamadas maestras, cada una de las cuales regula la transcripcin de grupos grandes de genes. Hay genes que son transcritos siempre de una manera constante. La regulacin de su expresin se efecta entonces a nivel postranscripcional 14. Este tipo de control es ejercido por protenas reguladoras o por molculas reguladoras de ARN que reconocen secuencias especficas del ARN a regular. Hay que sealar que uno de los puntos importantes de este tipo de control es el que afecta tanto a la formacin como a la degradacin del ARN mensajero. Finalmente, la regulacin del producto ltimo del gen, la protena, tambin forma parte del control de la expresin gnica 15 . Ello supone que se regula la degradacin de las mismas, su localizacin y funciones en la clula y las modificaciones que pueda experimentar su estructura.
Papel de

la expresin gnica en las interacciones

celulares Las clulas de un organismo multicelular se comunican entre s con el triple fin de regular su desarrollo y organizacin en tejidos, controlar su crecimiento y divisin y

coordinar sus funciones. Esa comunicacin se puede establecer a travs de tres mecanismos distintos 16: 1) Secretando molculas que actan en clulas localizadas a distancia variable de la clula secretora (molculas de seal). 2) Sirvindose de molculas unidas a la membrana plasmtica y que contactan fsicamente con la membrana de clulas adyacentes. 3) Intercambiando pequeas molculas a travs de las uniones abiertas (gap junctions) que existen entre las membranas de clulas adyacentes ya travs de las que se unen los citoplasmas de dichas clulas. Aunque los tres mecanismos son importantes para las interacciones celulares, el primero es el mejor conocido actualmente. Las molculas de seal secretadas por ciertas clulas pueden comunicar a stas con clulas muy alejadas de ellas (comunicacin endocrina mediada por hormonas transportadas por la sangre), con clulas de su entorno 8

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prximo (comunicacin paracrina mediada por mediadores qumicos locales) y con clulas adyacentes (comunicacin sinptica mediada por neurotransmisores). La norepinefrina y las encefalinas constituyen excepciones a esta clasificacin, pues tratndose de neurotransmisores median un tipo de comunicacin paracrina-autocrina. Las molculas de seal que median cualquiera de estos tres tipos de comunicacin son de dos clases, segn sea la solubilidad que presentan en el agua, el tiempo que permanecen intactas en el medio extracelular, el mecanismo por el que transmiten la informacin a las clulas diana y la respuesta que provocan en stas17: 1) Molculas hidrofbicas (las hormonas esteroideas y las hormonas tiroideas) que persisten en el medio extracelular por largo tiempo y que, tras atravesar la membrana de la clula diana, activan receptores localizados en el citoplasma o en el ncleo, dando lugar a respuestas lentas y de larga duracin. 2) Molculas hidroflicas (la gran mayora de las hormonas, los mediadores qumicos locales y los neurotransmisores) que, tras permanecer corto tiempo en el medio extracelular, interaccionan con receptores de la membrana de las clulas diana, originando respuestas rpidas y de corta duracin. Una excepcin a esta doble discriminacin la constituyen las prostaglandinas y el factor activador de las plaquetas, molculas hidrofbicas que actan como mediadores qumicos locales unindose a receptores de la membrana celular y provocando una respuesta rpida y de corta duracin. La respuesta de las clulas diana a estas dos clases de molculas implica siempre una modificacin de la expresin gnica, resultado fundamentalmente de cambios en la transcripcin del ADN. Mientras que las molculas hidrofbicas de seal influencian la expresin gnica directamente 18, las molculas hidroflicas de seal lo hacen a travs de mediadores intracelulares, los segundos mensajeros 19,20 . As, la unin de las molculas hidrofbicas de seal a su receptor intracelular forma un complejo molcula-receptor que se une a secuencias del ADN que son secuencias intensificadoras de la transcripcin de ciertos genes prximos (fig. 4). La respuesta primaria inmediata de la clula a esas molculas consiste, pues, en facilitar la expresin de ciertos genes, conocidos como genes de respuesta inmediata. Pero, a su vez, el producto de algunos de estos genes puede facilitar la transcripcin de otros genes (genes de respuesta tarda); es la llamada respuesta secundaria diferida, que sirve para amplificar la respuesta de la clula a las molculas hidrofbicas de seal. Es interesante mencionar que los receptores para estas molculas estn constituidos por una familia de protenas homlogas en la que cada protena reconoce una sola molcula hidrofbica de seal y secuencias intensificadoras de ms de un gen, segn el tipo de clula que se considere21. Ello da una idea de la multiplicidad de respuestas a las que puede dar lugar en distintas clulas una msma molcula hidrofbica de seal. Las molculas hidroflicas de seal inciden sobre el ge10

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Molcula hidrofbica de seal

1 Receptor intracelular

I Complejo molcula-receptor

I Secuencia intensificadora del ADN

I Transcripcin gen (s) Fig. 4.-Eventos implicados en la modificacin de la expresin gnica

por las molculas hidrofbicas de seal.

noma a travs de una cascada de eventos (fig. 5). Esta cascada se inicia con la interaccin de esas molculas con sus receptores especficos de la membrana celular. Existen tres tipos de receptores: receptores ligados a canales inicos, receptores ligados a tirosin cinasas especficas y receptores ligados a las protenas G22. La unin de una molcula de seal con un receptor ligado a protenas G da lugar a la modificacin, mediada por el guanosintrifosfato o GTP, de la actividad de tres enzimas de la membrana: La adenilatociclasa, la guanilatociclasa y la fosfolipasa C. La adenilatociclasa activada hidroliza e adenosintrifosfato o ATP yda lugar al AMP cclico 23. La guanilatociclasa activada Hidroliza el fosfatidilinositol-bifosfato y da lugar al inositoltrifosfato y al diacilglicerol 24 . El AMP cclico induce la activacin de ciertas proteincinasas dependientes de AMP cclico, que a su vez fosforilarn determinadas protenas. El CMP cclico tambin modifica la actividad de proteincinasas y de fosforilasas, y afecta por tanto a la fosforilacin proteica, aunque puede ser en un sentido distinto a como lo hace el AMP cclico. El nositoltrifosfato eleva la concentracin citoslica de calcio, facilitando su salida desde sus reservorios citoplasmticos. A partir de una cierta concentracin, el calcio se une a la calmodulina y a otras protenas citoplasmticas, creando complejos que activan ciertas proteincinasas dependientes de calcio, capaces entonces de fosforilar protenas. El diacilglicerol tambin induce la fosforilacin de protenas, previa activacin de la proteincinasa C. Como se observa, el resultado final de la interaccin entre la molcula hidroflica de seal y su receptor es la fosforilacin de numerosas protenas celulares 25. Estas protenas fosforiladas pueden influir sobre la transcripcin del ADN, bien
12

Fig. 5.-Eventos implicados en la modificacin de la expresin gnica por las molculas hidrofilicas de seal.

a travs de la activacin de factores de transcripcin (protenas reguladoras de genes) o bien a travs de la accin directa sobre las secuencias de ADN que promueven y que intensifican la transcripcin. Es de inters mencionar que ciertas protenas fosforiladas pueden estimular la expresin de unos genes especiales, los protooncogenes, que son genes de respuesta rpida que dan lugar a tres tipos de protenas fundamentalmente: protenas G, proteincinasas y protenas reguladoras de genes 26 . Ello significa que a travs de este mecanismo se puede amplificar la respuesta gnica inicial de la clula a las molculas hidroflicas de seal. Tecnologa del ADN recombinante Clsicamente, la nica manera de estudiar la informacin contenida en el ADN consista en deducir las funciones de los genes a partir del anlisis de los fenotipos de

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organismos mutantes y de su progenie. Aunque este enfoque metodolgico propio de la gentica clsica sigue siendo de utilidad, la biologa molecular ha aportado otro enfoque sustentado por un grupo de tcnicas que en su conjunto constituyen la denominada tecnologa del ADN recombinante 27-29 (tabla III). Esta tecnologa ha revolucionado el estudio de la clula en general y de los genes en particular. Cualquier regin del ADN de una clula puede ser escindida enzimticamente (con nucleasas de restriccin) e insertada en un elemento autorreplicativo (un plsmido bacteriano o un virus) para producir ADN por clonacin; as se obtiene el llamado ADN genmico. Por otra parte, el ADN puede sintetizarse a partir de un ARN mensajero .utilizando la enzima transcriptasa reversa, y as se obtiene el llamado ADN complementario (cADN). La cantidad de este ADN puede aumentarse tambin mediante el procedimiento de clonacin anteriormente descrito. La secuencia de nucletidos de un cADN purificado puede precisarse y a partir de ella puede delimitarse incluso la secuencia de aminocidos de la protena que codifica. Un fragmento de ADN obtenido por cualquier mtodo puede marcarse (por ejemplo, con istopos del tipo del 32P) y puede ser usado como sonda. Con el ADN sonda y utilizando tcnicas de blotting se puede determinar si un gen se expresa en un tejido (southern blotting), as como su localizacin en los cromosomas (hibridacin in situ). Anlogamente se puede proceder para detectar y lo-

Tabla III.

Tcnicas utilizadas en biologa molecular

Mtodo Nucleasas de restriccin Mtodo qumico Mtodo enzimtico (ADN polimerasa Ij

Fundamento Separar en fragmentos el ADN Analizar la secuencia del ADN

calizar la presencia del ARN mensajero (northern blotting). Una tcnica de gran impacto en el campo de la biologa molecular es la de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Esta tcnica se basa en conocer la secuencia de una cierta regin del ADN para poder reproducirla en gran cantidad -amplificarla- por un mtodo enzimtico. A tal fin se preparan oligonucletidos complementarios de ciertas secuencias de un gen, cadenas opuestas de ADN (oligonucletidos cebadores) que se incuban con el ADN cuya secuencia se quiere amplificar y con ADN polimerasa. La reaccin, que tiene tres fases (desnaturalizacin para separar las cadenas con la secuencia problema, hibridacin de la misma con los oligonucletidos cebadores y polimerizacin con la enzima), se repite a lo largo de un nmero determinado de ciclos, tras los que se obtienen cientos de miles de copias de la secuencia original El disponer de ADN aislado (intacto o mutado, previa su manipulacin) permite su insercin ulterior en el cromosoma de una clula, tal que se convierta en parte permanente del genoma de sta. Si la clula diana de este procedimiento de traslado del ADN es una clula germinal de un animal, entonces el gen insertado se transmitir a su progenie. As pueden estudiarse los efectos en la clula y en el organismo de un gen concreto, lo que permite eliminar sus funciones y su trascendencia para la biologa de la clula y para la fisiologa del organismo entero. Las consecuencias de la aplicacin de la tecnologa del ADN recombinante en medicina empiezan a ser evidentes. As, para entender mejor la etiopatogenia de ciertos procesos o para enfocar ms adecuadamente su diagnstico y su tratamiento, actualmente es preciso contar con las aportaciones de algunas de las tcnicas mencionadas (tabla IV).

Producir ADN Por sntesis a partir de ARN men- Transcriptasa reversa sajero Por reproduccin de fragmentos Clonacin de ADN Por duplicacin de cadenas de Hibridacin ADN Por amplificacin de secuencias Reaccin en cadena de la polimerade ADN sa (PCR) Detectar ADN especfico Detectar ARN mensajero especfico Southem blot Northem blot Ensayo de proteccin con ARNasa Sntesis de cADN + PCR

Tabla IV.

Aplicaciones de la metodologa de la biologa molecular a la investigacin en medicina

Creacin de modelos experimentales de enfermedad: Utilizacin de ratones transgnicos. Utilizacin de ratones mutantes. Estudio genmico de enfermedades diversas (metablicas, microbiolgicas, oncolgicas etc.): Estudios de clonacin de ADN. Estudios de deteccin y localizacin de cidos nucleicos. Estudios de transfeccin celular. Diagnstico de enfermedades genticas: Identificacin de marcadores (polimorfismo de los fragmentos de restriccin). Anlisis de ligamiento gentico. Tratamiento: Produccin de protenas con aplicacin teraputica a partir de clulas transfectadas. Terapia de reposicin gnica.

Localizar ARN mensajero especfi- Hibridacin in situ co en un tejido Trasladar el ADN A clulas A animales Transfeccin Modelos transgnicos

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Aplicaciones de la biologa molecular a la nefrologa La biologa molecular ha tenido cuatro efectos fundamentales sobre la nefrologa 30 (tabla V): 1) La caracterizacin de la secuencia y la clonacin de fragmentos de ADN codificadores de ciertas protenas crticamente relacionadas con la funcin renal o con la interaccin de las clulas renales con su entorno y con el resto del organismo. 2) la creacin de modelos animales de enfermedades renales con trastornos genticos aislados. 3) La obtencin del mapa cromosmico y de los marcadores genticos de algunas enfermedades hereditarias del rin. 4) El conocimiento de los mecanismos implicados en el desarrollo renal y en la respuesta del rin ante las agresiones. La tecnologa del ADN recombinante ha permitido analizar la estructura y la expresin de los genes que codifican muchas de las protenas directa o indirectamente relacionadas con la funcin renal. Algunas de estas protenas estn implicadas en los procesos de transporte transmembranario de iones y de otras sustancias, otras funcionan como molculas de seal con actividad endocrina o paracrina y otras son importantes para la regulacin del tono vascular. Tambin se conocen ya los genes codificadores de protenas relacionadas con la capacidad de las clulas renales para interaccionar con el medio extracelular, tanto en condiciones normales (protenas de la matriz extracelular, receptores para molculas de seal) como en condiciones patolgicas (antgenos). Junto al conocimiento de todos estos genes, la manipulacin de su secuencia de nucletidos y, consiguientemente, la modificacin de la secuencia de aminocidos de la protena final est Tabla V. Efectos de la biologa molecular sobre la nefrologa

Caracterizacin gentico-funcional de protenas relacionadas con las funciones y las interacciones de las clulas renales: l Protenas de transporte (ATPasas, intercambiador de aniones, intercambiador Na+/H+, canales de K+, otros transportadores). l Molculas de seal (sistema renina-angotensna-aldosterona, factor natriurtico auricular, endotelina, vasopresina, eritropoyetna, vitamina D, hormona paratiroidea). Protenas de interaccin (protena del proteoglicano, fibronectina, laminina, receptores para hormonas, receptores para factores de crecimiento, receptores para linfoquinas, antgenos y autoantgenos diversos). Creacin de modelos transgnicos de enfermedad renal: l Glomerulosclerosis (gen de la hormona de crecimiento, oncogen viral T grande SV40, gen de la protena de superficie Thy-1). l Glomerulonefritis proliferativa (ADN de retrovirus). l Aplasia-hipoplasia renal (protooncogen c-myc). Localizacin del mapa cromosmico y del ligamiento gentico de enfermedades renales: l Enfermedad poliqustica autosmica dominante del adulto. l Carcinoma renal. l Tumor de Wlms. l Enfermedad de Alport. l Diabetes inspida nefrognica. l Acidosis tubular renal proximal. l otras.

permitiendo establecer relaciones estructura-actividad que mejoran el conocimiento de los procesos moleculares que acontecen en el rin. La capacidad de introducir genes extraos en las lneas celulares germinales de los ratones ha hecho posible construir modelos animales de diversas nefropatas, principalmente glomerulopatas. la mayora de las mismas traducen la expresin inadecuada del gen extrao que se insert (es el caso de las glomerulopatas resultantes tras insertar el gen de la hormona del crecimiento, el gen viral T grande SV40, el gen de la protena de superficie Thy-1 y el protooncogen c-myc). Pero otras glomerulopatas pueden ser el resultado de la interrupcin de un gen endgeno por el gen extrao insertado (as se originara la glomerulopata resultante tras la insercin de los retrovirus). De todo ello se desprende que algunas enfermedades renales pueden ser el resultado de la expresin de genes anormales, mientras que otras pueden ser consecuencia de la represin de genes nativos. La secuencia de nucletidos del ADN vara entre los individuos de una poblacin. Ello se puede detectar fcilmente midiendo la longitud (en miles de bases o kilobases) de los fragmentos de restriccin resultantes tras tratar el ADN con nucleasas de restriccin. Por lo tanto, en una poblacin existir polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin. Si el ADN de estos fragmentos se relaciona con el ligamiento familiar que presenta una determinada enfermedad, se puede construir el mapa gentico de dicha enfermedad en aquella familia. As es como se ha localado en el brazo corto del cromosoma 16 el locus gentico cuya mutacin produce la enfermedad hereditaria renal ms estudiada: la enfermedad poliqustica autosmica dominante del adulto. Hay que sealar que en esta enfermedad renal, y en otras cuyo locus tambin se ha identificado ya, an se desconoce cul es el producto gnico afectado y responsable ltimo de la lesin renal. Actualmente se empiezan a caracterizar los genes que regulan el momento y el lugar en que las clulas renales se desarrollan y se diferencian. Evidentemente, el conoci. miento de estos genes puede ayudar a entender el desarrollo anormal del rin en situaciones de hipoplasiaaplasia, hipertrofia y cncer. Tambin es mucho lo que se investiga hoy en da con tcnicas de ADN recombinante sobre el posible papel desempeado por los factores de crecimiento, las citoquinas y los autocoides en la induccin y/o el mantenimiento de l a respuesta renal a agresiones diversas. Menos nvestigado est todava el papel de los protooncogenes y de las protenas por ellos inducidas en la mediacin de esas respuestas. Pero donde ms trabajo queda an por hacer es en el estudio de la participacin de las llamadas protenas de estrs en la respuesta renal a la agresin. Es probable que, como ha sucedido en otras reas de la medicina -neurologa, cardiologa-, del estudio de estas protenas tan singulares se derive un conocimiento ms preciso de la patogenia de las enfermedades renales.

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BIOLOCIA MOLECULAR

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