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Mtodos fotomtricos de dispersin de la radiacin:

turbdimetra y nefelometra
En capftulos antcriorcs sc han cstucliaclo diversos m-

todos espectrofotomtricos de anlisis, los cuales se basan en la absorcin o emisin de la radiacin electromagntica. La mayorfa de los mtodos estn diseados para medir la concentracin de un analito, aunque tambin alguno de ellos se usan en anlisis cualitativo.
En contraste con captulos anteriores, ste trata sobre un mtotlo no espectroscpico importante para la determinacin cle la concentracin, el cual se denomina fotometrfa de dispersin de radiacin. Algunas aplicaciones importantes de esta fotomettlase pueden encontrar en el laboratorio clnico. Comencemos este estudio considerando la clispersin de la energfa radiante por partculas en solucin.

sustancia cn suspensin, cambia la direccin de propagacin cle algunos fotones del haz (Fig. 10-1). El cambio de direccin de propagacin y de intensidad de la radiacin dispersacta clepende de numerosos factores. A travs de los aos, se han desarrollado las bases teoricas de los

procesos de dispersin de la radiacin. Dado que su desarrollo matemtico es complicado y que ofrece un bajo significado prctico, no expondremos en el texto stts bases tericas. Consideramos, sin embarSo, los aspectos generales en el prrafo siguiente. En primer lugar, la longitud de onda de la radiacin transmitida, dispersada e incidente es la misma. El segun-

clo hecho es que con frecuencia

la intensidad de la

DISPERSION DE LA RADIACION POR PARTICUI-AS EN SOLUCION

Crnnclo tur haz, de radiacin monocromtica, dc longitucl dc onda no ahsortlihlc chocl contra las partfcults dc unl

radiacin dispersada no es la misma en todas las direcciones. En numerosas aplicaciones clfnicas la mayorfa de la dispersin, es dispenin hacia adelante, la cual emana clescle el centro de la cubeta, opuesta a la radiacin incidente. En tercer lugar, lg concentracin de las partculas en suspensin puede ser determinada midiendo la disminucin cle P" al atravesar la cubeta o midiendo la radiacin clispersada a un ngulo determinado. I-a eleccin del mtoclo tlclcndc dc la conccntracin dc la suspensin. Si

_>
Energa radiante incldente

Cubeta
contenie ndo

Po

-->

la suspensin

_>
La radiacin dispersada se muestra como flechas continuas

Energa radiante transmitida

Figura 10-I

t29

L30

CLINICA METODOS INSTRITMENTALES DE ANALISIS E,N QUIMICA

f,
miembros de la
Ecuacin L0-2

F'l

la concentracin es alta, se pueclen medir P Y Po' Este es mtodo se denomina turbidimetra. si la concentracin distinta de Po como baja, P puede no ser suficientemente puiu clr lugar a una medida exacta. En este caso se obtien"n *ores resultados micliendo la radiacin dispersada. Est tcnica sc clcnomina nefclometrfa'

Tomando logaritmos
ecuacin, se obtiene:
2,3031og P/?o =

en ambos

Fr

-fbc

ir a

ReagruPando la ecuacin 10-2 se obtiene,

f -log P/P" =bc

Ecuacin 10-3

TURBIDIMETRIA
cuando la concentracin cle una suspensin de partcn culas se micle por turbidimetrfa, la suspenlin se sita cn la una cubeta de-un instrurncnto sinrilar al ilustratlo Figura L0-2,e1 cual permite real izar las medidas de-P,.y p. Esto hace posibie calcular la concentracin de la
suspensin. Consideremos los corponentes pticos que se muestran en la Figura IO-2'

2,303

le da br sfmboro T, r-a turbicidad es para la medida

y se se puede llamar al trmino (f/2,303) "turbicidad>

de turbiclimtrica lo que la absortividad es pala la meclida depenabsorcin. El valoi clc turbidiciclad es una funcin onda diente clcl tamao de partfcula y dc la longitud de se ve afectado por el utilizada en la medid. su valOr no o los productos que componen.lgs n1lfculal' Stituyendo T en la ecuacin 10-3 se obtiene'
,

F F F F F
;

ir

-log P/?" = Tbc

Fuente Detector

Ecuacin 10-4

puede

Cubeta

la absorbancia si se mide la radiacin absorbiAlgucla. sc pueclc denominar al -log P/?." "turbidancia>' aparente' nas veces se denomina absorbancia I turbidimetra puede realizarse en espectrofotmetros de visible o ultraviolcta. Esto es una prctica frecuen-

Hay que tener en cucnta que el trmino

-lgg P{1"

l*i

F F F F

te en laboratorios de aprendirale'

Figttra I0-2. I'urbidmetro sencillo'

Aptcaciones ctlncas de la turbldimetrla

o en bacteriolo gfa.una bacteria tfpica posee un dimetro entreZy 5 [rm; pol tanto tiene una longitud omprendido un tamao suficientc como para dispersar la radiacin visible. Debido a ello, la turbidirnetrfa es ampliamente utilizada en instrurncntos automatizdos los cuales miclcn la scnsibilidatl a antitriticos. En cstos instrumentos en se utiliza un sistema ptico como el que se rcpresenta se usa para detectar si la Figu ra ra-Z.1 turioinretrfa bactehay no crecimiento. Al aumentar el crecimiento

F F
es

I-a fuente de racliacin ms frecuentementc util i'nrJa tames la lmpara de wolframio, pero pueden utilizarse fuentes de racliacin visible. si el contenido dc bin otras la cubeta es colorearJo, se debe util izar un filtro para eliminar toclos los fotones absorbibles de Po. Dc otro modo los resultados obtcnidos scrfan una mczcla dc espectroscopia dc absorcin y turbiclimetrfa. Esto darfa lugar a meidas cle concentracin falsamentc elcvdas' h- turbidfmetros pueden incorporar cualquier dctector quc sea sensible a la longitud de nda de P, el ms comn
es el fotodiodo semiconductor.

El uso ms frecuente de la turbidimetrfa en clfnica

F F F

Teniendo en cuenta el instrumento mostrado en la Figura IO-2, conviene tener presentes los tratamientos

riano aumenta la dispersin detectada. En el laboratorio se usan espectrmetros cle haa sencillo, en el visible a 500 nm paia determinar en el caldo

mt"mticos cle la turbidimctrfa. son muy similares a los p" Y.P cle la espectroscopia de absorcin. [,os valoret- dt la medidos experimbntalmente estn relacionados con de las partfculas suspendidas mediante la concentracibn ecuacin:
P/?" =
s-rbc

de cultivo

el

instrumentos muestras de contenitlo bacteriano conocido. se realiza

nmero dc bacterias por mililitro. I"os se estand anzan mediante el anlisis de

una curva patrn de la turbidancia (absorbancia aparente) se flrente u ronrentraciones de bacterias y postcriormente

utiliza para hallar la concentracin dc bacterias en muestras de concentracin desconocida'

Ilcuacin 10- I

donde b es el esPesor de la cubeta c es la conccntracin clc partfculas dispersantcs dc la radiacin f es una constantc para una partfcula de un tamao determinado a una longitud dc onda dada.

una scgunda aplicacin importante dc la turbidimetrfa la coniituyen los analizadore,s clc coagulacin. t as clulas sangufneas poseen un tamao suficicnte como a ello se para tlispcrsr la eneigla radiante visiblc, debido un bucn nmcro de instrumentos que se han construido
Estos basan en los procesos de clispersin de la radiacin. 24. instrumentoi se discutirn en el Capftulo

I T I

METODOS FOTOMETRICOS DE DISPERSION DE

f"{

RADIACION: TURBIDIMETRIAYNEFELOMETRIA

131

Nefelometrfa
Cuando la concentracin dc una suspensin dc partculas es baja cs prelbrible nlcclirla por ncfelometra. En nctblonretra, la suspcnsin sc coloca cn una cutleta, la cual sc sita cn cl instrumento tal como sc muestra cn la Figura 10-3. El instrumento pcrmite la medida de intenColector de rad iaciones neg ro
Energ a

2s

Estado metastable

Cubeta (vista superior) Fuente

en electrn-

voltios

Filtro si

se requiere
Tubo fotom
u

ttiplicado r

T0r-

Itigurn I0-3

Figrn I0-s

siclad dc clispcrsin, S, la cual cst rclacionada con la conccntracin. [s fucntcs dc radiacin utilizadas en los equipos instrumentales son de laser* helio-nen, lmparas de halgcnos de cuarzo y lmparas de xenn. Dado

que el laser de helio-nen es muy frecuente en ne[elometra, nos ocuparemos de l a continuacin. El laser de helio-nen sc obticne introduciendo cn un
tubo largo y estrecho, horada,lo y cerrado por dos espejos, una mezcla de gas formada por 7 partes de helio y 1 parte de nen (Fig. 10-4). l-a presin del gas de helio-nen en el tubo es de algunos torr. Un torr es igual a 1 mm de mercurio (Hg). Se aplica un voltaje suficientemente alto como para producir una descarga elctrica a travs del

gas. La descarga elctrica cs la f uente de energfa que se transtbrma en radiacin laser. E,n el proceso, los tomos de helio absorben cnergfa elctrica y son excitados a un estado electrnico denominado estado metaestable (Fig. 10-5). El nivel de energa metaestable es relativamente inusual y su tiempo de vida es bastante largo con relacin a los estndares.

procede de l,ight Amplification by the Stimulated Emission of Racliation, cuya traduccin pcxlra ser amplificacin de la luz por emisin estimulacla de la radiacin.

* El trmino IASER

l-a energfa elctrica puede ser almacenada durante cierto tiempo por estos tomos de helio metaestables, los cuales chocan posteriormente con los tomos de nen. Cuando esto ocurre, el tomo de helio metaestable cede su ener g{a al de nen volviendo ste al estado fundamential. El helio, que ha regresatlo al estado fundamental, toma ms energfa elctrica y vuelve al estado metaestable, comenzando el proceso de nuevo. El helio puede considerarse como el sistema de bombeo del laser. I-a energfa cedidg al nen excitaa los tomos de este cn estaclo fundamental produciendo tomos de nen en
Espejo de salida

Espejo

sem i-transparente

Salida
L,ASER

-ft

Conexin de alto voltaJe

Conexin de alto voltaje

Figura I0-4. Laser de helio-neon.

-t
r32
ME,-I'ODOS INSTRUME,NTALES DE,

ANALISIS trN QUIMICA CLINICA raramente ut ilizada. Es suficiente saber que en la mayorfa de los casos a bajas concentraciones existe una relacin

i i
:::

:,?T!:ffi :i:1,:,11"x"i":"i',:::fi i'J;Iffjiff

T--.--!-!?- 06 , a^r i- [_45tr I ranstcton
632,8 nm se puede desanollar una calibracin no lineal'

( {

I
Aptcacones clfnicas de Ia nefelometrla

Energa en electrn-

Rpido

voltios

Desactivacin por colisin (rpida)

Nivel motastable de energa del nen

Desactivacin Por' colisin (rPida)

3'nivel de nen Figrrn I 0-6.

iagrantn .sinlpli ficado clc los orbitales altinlicos dc ncirn.
D

Existen trcs aplicacioncs importantc's tlc la nefelometra en el laboratorio clnico. Primero, el mtodo se utiliza cn algnnos contaclorcs clc clulas sangunffis para distinguir los distintos tipos tlc clulas dc lA sangrcv Tambin se utiliza para cgntar clulas. El rntodo cxacto cmpleaclo se discutc en cl Capftulo 23. L,asegunda aplicaciln clc la ncf clometrfa es la medida de complejos anifgtno-anticuerpo. El mecani,bmo qumico dc estos procesos se discute en el Apndice A. Para potler seguir cstas reacciones inrnunoqufmidls algunos
instrumcntos utiliz.anuna radiacin quc sigue una trayectoria como lif quc aparccc cn la Figura l0-3. tr31 rngtllo 0

de estc instrunrcnto cstl comprentlido cn cl intcrvalo cntre 30 y 70 graclos. Estc intervalo proporciona el

estado excitado. El estado favorecido es el orbital 5s. Esto se representa en un cliagrama muy simplificado dc orbitales atmicos para el nen, Figura 10-6. Este proceso es muy eficazpaia la produccin de una amplia poblacin de tomos de nen en estado excitado. El proceso es tan

eficaz que hay ms tomos de nen en estado excitado

que tomos en estado fundamental. Estos tomos de nen

ngulo ptimo para el tamao tle las partfculas generadas en este tipo cle reaccin .I-aclispersin de'sarrollada porla muestra es corregicla por otras fucntes de cl ispersin mccliante un proceso suprcsor. La clispcrsin cofregida de csta mancra sc compara con la proclucitla por soluciones estndar. Este instrumento sc utilizapara medir los niveles en suero cle muchas protenas importantes. Se han para IgA, IgG, IgM, cornplemento C' fabricado

complemento Co, albminh, transferrina, Cr.'-macroglobuli a, haptoglotlina, protcna C rcactivE, orosomucoidc, y lactor rcumatoiclc. Atlcrnrs, lu ncfclotttctrfa sc usa para ia dcterminrci(ln de algunos frmacos, los cuales se nritlen utilizanclo csta tcnica conjunlanlcntc con innlunoqufrnica. t terccra aplicacin cs cl anrlisis clc enzimas que actan sobrc cleicrminados sustratos, El analizador ami-

"Kits>

Cxcitados picrden parte de su cnerga por emisin dc fotones a632,8 nm, los cualcs son reflcjados hacia atrrs y hacia adelante por los cspejos. Cuando pasan a travs clel gas, producen una mayor cmisin. La cxplicacin dc este efccto estimulador sobrcpasa cl alcancc dc cstc tcxttl pero el efecto es un fcnmeno ohservado con frecucncia' Esta emisin estimulada se denomina bombco de laser. Is fotones de 632,8 nm salen a travs cle un espejo dc

salida parcialmente transmisor. Los fotones son posteriormente usados en el instrumento . IA energfa cle los tomos de nen excitados que no se ha perdido en el proceso cle bombeo, se pierde por colis iln con las parcdcs del tubo de laser. Los tomos de ncn pueclen despus,

reiniciar el proceso. El filtro puede incluirse o no en cl instrumento usado para medir la intensidad dc dispersin (Fig. 10-3)' pcro generalmcntc hay uno. La cubcla es de alta calitlad y cS

lasa-lipasa modelo 91 clc Colcman es un ejemplo de instrumento que realiz.a cstc tipo de anlisis. Tanto la amilasa como la lipasa trabajan rncjor cn la interfase agua-sustrato. Para cl anlisis dc lipasa el sustrato es amilopectina, cn cl caso cle la lipasa el sustrato es aceite cle oliva. [,os procluctos de reaccin que Se producen cuanclo las emimas actan sobrc estas partculas de sustrato, son tlemasiado pequcos para dispcrsar la
radiacin.
En ambos anlisis la suspcnsin establc de sustrato sc mczcla con la mucstra quc conticnc la cnz.itna, clcsptrs la rcduccin dc la turbic't, sc rclacitlna con la conccntracin dc cnzima. El analizador antilasa-lipasa, cs un ncIclmctro tfpico

iimilar

a la e rnplcatla cn cspcctroscopa dc fl uorcsccncia.

El valor tlel ngtrlo dc dispcrsin sclcccionado 0, oscila entre algunos grados y 90 gradosr peto el nts frecucntc est comprendido gencralntentc cntrc 30 y 70 gracltls; slt valor sc selccciona clc rcucrdo con la aplicacin cspccffica considerada.

[ relacin matcmrtica entrc la intensidad tlc clispcrsin, S y la concentracin de partfculas suspendidas cs

(ptc utiliza radiaci(rn policrornfitica blanca y tlctcccin fotoclctrica. Su calibrado sc rcaliza utilizando un cstnclar gclatinoso cstablc quc pucclc scr sustituitlo por cl que aconrpaa al kit dc anlisis.

|'

rt

r'
I}
; ; ; ;

METODOS FOTOMETRICOS DE DISPERSION DE I.A RADIACION: TURBIDIMETRIA Y NEFEL,OMETRTA

133

FUENTES DE ERROR
En las medidas turbidimtricas, ras cubetas sucias pueden causar prdida en po produciendo un aumcnto

It

en suspensin.

turbidancia de la solucin, que tienden a disrninuir de un modo errneo las meclidas d concentracin de partculas

t t t1 ll

en valores altos de turbidancia. [.os compuestos fluores@ntes que son excitdr por p", producen valores aparentemente elevados de P. Esto dalugar a valores bajos en la

falso los valores cle la turbidancia de la solucin. La presencia en lasolucin de sustancias cxtraas capaces de dispersar la energfa radiante tiende a disminuir de un modo ineal los valores de P. Esta tendencia da lugar a valores de la turbidancia falsamente elevados. I-a radiacin perdida limita la linealidad en la calibracin

falso de los valores cle P. Estdtiende a elevar de un modo

aqu.

En nefelometrfa, ras cubetas sucias pueden causar problemas. Si la suciedad hace disminuir ir^ la trayectoria que llcva la energfa radiante hacia el Obiector, "n sern detectados valores errneamente bajos cle S. [ presencia de sustancias extraas en la cubeta es capazoe oispersar la energla radiante con tentlencia a la clevacin cle S. I presencia de compuestos fluorescentes que son excitados por-P" da lugar a valores falsamente elevados de s. ls r*ry].ones qufmicas usadas pana preparar ra muesrra para un anlisis son fuentes potbnciles de error, los cuales son especfficos, de cada nlisis y no se discutirn

fi::