DEJANILDO JORGE VELOSO

Ao de fitoterpicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados volteis: estudo in vitro .

PROGRAMA INTEGRADO DE PS-GRADUAO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA PROGRAMA INTEGRADO DE PS-GRADUAO EM ODONTOLOGIA

JOO PESSOA 2006

DEJANILDO JORGE VELOSO

Ao de fitoterpicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados volteis: estudo in vitro .

Tese apresentada ao Programa Integrado de Ps-Graduao em Odontologia da Universidade Federal da Paraba em cumprimento s exigncias para a obteno do ttulo de Doutor em Odontologia. rea de concentrao: Estomatologia.

Orientador: Prof. Dr. Fbio Correia Sampaio. Co-orientadora: Prof. Dr. Jane Sheila Higino.

JOO PESSOA 2006

DEJANILDO JORGE VELOSO

Ao de fitoterpicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados volteis: estudo in vitro .

DATA DA DEFESA: 27/07/2006.

_______________________________ Prof. Dr. Fbio Correia Sampaio. Orientador. ________________________________ Prof. Dra. Clia Maria M. B. de Castro Examinadora. _________________________________ Prof. Dra. Brenda Paula F. D. A. Gomes Examinadora. __________________________________ Prof. Dra. Margareth de Ftima F. M. Diniz Examinadora. __________________________________ Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira Examinador.

AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fbio Correia Sampaio, um verdadeiro orientador. A Prof. Dra. Jane Sheila Higino, da UFPE pela orientao e produo dos extratos usados neste trabalho. A Prof. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, da FOPUNICAMP, Piracicaba pela orientao e ajuda indispensveis com os testes realizados no laboratrio em Piracicaba. Ao Prof. Carlos Henrique Gomes Martins, da Universidade de Franca, SP pela orientao e amizade. A Prof. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira, A Pro. Dra. Nikeila Chacon Oliveira Conde, A Prof. Dra. Laurylene C. S. Vasconcelos, A Prof. Fbia Daniele S. C. M e Silvia, Ao Dr. Frederico Canato Martins, pelo laborioso trabalho e ajuda em Piracicaba, A Coordenao e Funcionrios do Programa Integrado de Ps-Graduao, Aos meus Mestres, Aos meus amigos, um pequeno e estimado grupo de heris. A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho... Como bem lembrou minha querida Me.

E porque me faltam as palavras... Obrigado!

Quando chegarmos ao final da linha, perceberemos que nossa obsesso egosta no nos oferece esperana, e estaremos abertos para nos tornarmos obcecados por Deus.
Larry Crabb.

RESUMO

produo

de

compostos

sulfurados

volteis

por

microrganismos da cavidade bucal a principal causa da halitose. O objetivo deste estudo foi de avaliar in vitro a atividade dos extratos de Caesalpinia ferrea Mart. (Juc), Cinnamomun cssia B. (Canela), Malva sylvestris L. (Malva), Punica granatum L (Rom), Rosmarinus officinalis L. (Alecrim),

Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macass), Sysygium aromaticum L (Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo) sobre microrganismos da

cavidade bucal produtores de compostos sulfurados volteis (CSV) utilizando diferentes testes de sensibilidade microbiana e um modelo de sedimento salivar. A atividade dos estratos foi avaliada sobre os microrganismos

Fusobacterium nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia isolados da cavidade bucal. Para o teste de difuso em agar foram utilizados os extratos puros depositados sobre o meio de cultura em cilindros de ao (8,0 X 10,0 mm com dimetro interno de 6,0 mm) e medidas as zonas de inibio. Foi tambm realizado o teste para determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) em meio lquido pelo mtodo da microdiluio com a resazurina como revelador da presena ou ausncia de atividade bacteriana. A quantidade de polifenis totais dos extratos foi medida pelo mtodo Azul da Prssia modificado por Graham. Para o teste com o sedimento salivar foi utilizado o mtodo de Kleimberg e Codipilly e o sedimento salivar foi exposto aos extratos de juc e rom seguindo-se a incubao e realizadas medidas organolpticas e com um

monitor de gases (Halimeter) em intervalos pr-estabelecidos. Ao teste de difuso os diferentes extratos demonstraram resultados variados com diferentes zonas de inibio ou ausncia destas. O extrato de rom foi o nico extrato que apresentou capacidade inibitria sobre todos os microrganismos testados. Os valores de CIM demonstraram tambm uma variao quanto a ao dos extratos sobre os diversos microrganismos. Os extratos usados para o teste de sedimento salivar determinaram uma menor formao de CSV quando comparado ao controle negativo. O uso de fitoterpicos pode representar uma alternativa para a abordagem

antimicrobiana nos casos de halitose de origem bucal.

ABSTRACT

The

production

of

volatile

sulfur

compounds

(VSC)

by

oral

microorganisms is the main cause for halitosis. This in vitro study evaluated the antibacterial activity of plant extracts from Caesalpinia ferrea Mart., Cinnamomun cassia B. , Malva sylvestris L., Punica granatum L , Rosmarinus officinalis L. , Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. , Sysygium aromaticum L e Tamarindus indica L. The bacteria tested were

Fusobacterium nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia obtained from clinical trials. The

antibacterial activity was determined by means of agar diffusion and broth microdilution test.. Stainless-steel cylinders (8.0 x 10 mm inside dia. of 6.0 mm) were placed on the agar plates and the test extracts were applied inside the cylinders. Zones of inhibition of bacteria growth around the cylinders were measured and recorded after incubation time. Resazurin was used as an indicator of bacteria growth in the microdilution test. In order to test for bactericidal or bacteriostatical effect from the extract on bacteria, 20 L from the well indicating the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and three more wells were dispensed in agar plates. Results for growing of bacteria were recorded after appropriated incubation time. Determination of total

polyphenols in the plant extracts was carried out by the Prussian blue method as described by Graham. The extracts of Punica granatum L. and Caesalpinia ferrea Mart. showed the highest values for total polyphenols and were chosen for the test with the suspended salivary system (SSS) method. The salivary

sediment were exposed to the extracts and the amount of odor was measured both with organoleptic test and by a sulfide monitor (Halimeter ) after appropriated periods. The agar diffusion and the microdilution tests demonstrated different results with the Punica granatum extract being able to inhibit the growth from all the bacteria tested by the diffusion method. The results from the test with the SSS method show that when the extracts were exposed to the extracts the production of VSC was smaller than the production from the negative control. The results suggest that some plant extracts may be useful for the antibacterial approach for the treatment of oral halitosis.

LISTA DE ILUSTRAES

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LISTA DE TABELAS

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LISTA DE ABREVIATURAS

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SUMRIO
1. INTRODUO 2. REVISO DA LITERATURA 2.1. HALITOSE 2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE 2.1.2. AVALIAO DO HLITO 2.1.3. PEVALNCIA DA HALITOSE 2.1.4. ETIOLOGIA DA HALITOSE 2.2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE 2.3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS 2.3.1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS NA ODONTOLOGIA 2.3.2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS NO TRATAMENTO DA HALITOSE 2.4. POLIFENIS 3. PROPOSIO 4. METODOLOGIA 4.1. PREPARAO DO EXTRATO DAS PLANTAS 4.1.1. EXTRAO DOS MARCADORES QUMICOS 4.1.2. CONCENTRAO DA SOLUO EXTRATIVA 4.2. DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 4.2.1. TESTE DA DIFUSO EM AGAR

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4.2.2. DETERMINAO DA CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) E EM MEIO LQUIDO 4.3. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE POLIFENIS DOS EXTRATOS 4.4. DETERMINAO DA CAPACIDADE INIBITRIA DOS EXTRATOS SOBRE A FORMAO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLTEIS (CSV) E OUTROS ODORES 4.4.1. PREPARAO DOS SEDIMENTOS 4.4.2. COLETA DOS DADOS 4.5. ANLISE ESTATSTICA 5. RESULTADOS 5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 5.2. CONCENTRAO DE POLIFENIS DOS EXTRATOS 5.3. AO DOS EXTRATOS DE JUC E ROM NA FORMAO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLTIS E OUTORS ODORES. 6. DISCUSSO 7. CONCLUSES REFERNCIAS

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1. INTRODUO.

Foi na dcada de 70 que J. Tonzetich usando cromatografia gasosa, demonstrou que era possvel identificar e quantificar os compostos sulfurados volteis (CSV) a partir de amostras de ar cavidade bucal, estabelecendo a importncia destas substncias na formao do mau odor bucal. Como principais componentes foram identificados: sulfidreto (H2S), metilmercaptana (CH3SH), e com uma participao menor o dimetilsulfeto [CH3]2S. Os compostos sulfurados volteis j haviam sido identificados como resultantes de processos putrefativos da saliva atravs de anlise por espectrometria de massa, contudo este mtodo no era sensvel o suficiente para a avaliao do ar no interior da boca. Em seu estudo Tonzetich, 1971 mostrou que a concentrao de compostos sulfurados volteis na boca varia para o mesmo indivduo, quando examinado em diferentes horrios num mesmo dia. Os nveis mais altos de concentrao destas substncias correspondem aos nveis de maior intensidade do mau hlito. Foi verificado ainda que a aplicao de mtodos de higiene bucal reduz significativamente a quantidade de compostos sulfurados na boca, concluindo-se que a formao destas substncias se deve aos processos putrefativos ocorrendo no interior da cavidade bucal. Aps os achados de Tonzetich os estudos foram desenvolvidos para detectar os mecanismos de produo dos compostos sulfurados volteis e a importncia da cavidade bucal como a principal fonte de produo destas

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substncias.

De acordo com Delanghe et al (1999), num grupo de 260

pacientes atendidos na clnica de odores bucais, foram encontrados aproximadamente 87% dos casos de halitose com origem bucal, 8% apresentava mau odor originrio da regio de ouvido, nariz e garganta, e em 5% dos casos a origem no pode ser determinada. No caso dos pacientes com halitose de origem bucal, 41% apresentavam saburra lingual, 31% tinham gengivite, e 28% periodontite. So diversos os estudos que descrevem que os compostos sulfurados volteis (CSV) so produzidos principalmente por bactrias anaerbias gramnegativas encontradas no somente em reas de progresso de gengivite e periodontite como tambm na superfcie lingual, na assim chamada saburra lingual. So vrios os microrganismos relacionados como produtores de CSV: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatun, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Peptostreptococcus. Essas

bactrias produzem compostos sulfurados volteis a partir do metabolismo de clulas, incluindo clulas descamadas da mucosa bucal e clulas sanguneas assim como protenas da saliva (WALER, 1997; LOESCHE e KAZOR, 2002; MORITA e WANG, 2001; MILAZZO et al, 2003; SCULLY e ROSEMBERG, 2003). O uso do fluoreto estanhoso foi utilizado num estudo realizado por Quirynen et al (2002), mostrando-se eficaz na reduo do mau hlito matinal, assim como na reduo de bactrias na saliva e retardando a formao do biofilme bacteriano bucal. Realizando reviso sistemtica das diversas abordagens no controle da halitose, Roldn et al (2003) relatam que o controle mecnico do biofilme

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lingual mostra uma reduo transitria nas concentraes dos diversos componentes do mau odor bucal. A abordagem antimicrobiana conta com um diverso nmero de agentes que so utilizados isoladamente ou em conjunto com a limpeza mecnica da lngua. Contudo, o uso prolongado desses agentes no deve promover o desequilbrio da microflora bucal ou contribuir para o surgimento de bactrias resistentes. Pratten, Barnet e Wilson (2003) verificaram a eficcia da clorexidina e do acetato de zinco num estudo in vitro, verificando sua capacidade em reduzir a formao de CSV num modelo com biofilme multiespcie chamado fermentador de imerso constante (CDFF constant deph film fermentor). Com as diversas aplicaes foi observada a reduo da produo de CSV e simultaneamente uma alterao no biofilme com reduo das bactrias produtoras de H2S. Neste contexto, a abordagem antimicrobiana no tratamento da halitose tem se mostrado como uma opo fundamental. Substncias como clorexidina, cloreto de cetilpiridnio, triclosan, perxido de hidrognio, dixido de cloro, assim como leos essenciais e cloreto de zinco tm sido estudados no combate a halitose, com benefcios, mas tambm restries. Embora

existam relatos do uso de plantas medicinais no combate da halitose, faltam ainda evidncias confiveis (SCULLY e ROSEMBERG, 2003). O uso de fitoterpicos j est incorporado pratica da da Odontolotogia. Medicina e

Em todo o mundo so desenvolvidas pesquisas que

avaliam o potencial do uso de produtos obtidos de vegetais incluindo o isolamento de substncias especficas na busca de novos medicamentos

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usados na preveno e tratamento das mais diversas enfermidades (SILANO et al, 2004; SILVA e ANDRADE, 2005; VASCONCELOS et al, 2003). Nesta pesquisa avaliamos a ao antimicrobiana de extratos fitoterpicos sobre microrganismos relacionados produo de CSV na cavidade bucal atravs de testes de sensibilidade microbiana por difuso em agar e microdiluio em caldo. Utilizamos tambm um modelo de sedimento salivar que simula as condies do meio bucal e que permite a quantificao de CSV atravs do uso de um monitor de gases. Como justificativa para o desenvolvimento desta pesquisa deve-se considerar a importncia da halitose como uma condio com implicaes na sade e tambm trazendo severas restries sociais. Uma abordagem fitoterpica pode mostrar-se adequada na busca de agentes antimicrobianos para uso nos casos em que se deseje a reduo dos CSV na cavidade bucal, preenchendo assim a lacuna hoje existente em termos de pesquisa nesta rea especfica.

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2. REVISO DA LITERATURA. 2.1. HALITOSE

2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE.

Halitose o termo genrico usado para descrever um odor desagradvel e repugnante que emana da cavidade bucal. Embora inmeras localizaes fora da cavidade bucal tenham sido relacionadas halitose, sabe-se que em at 90% dos casos a boca a origem principal do mau odor (Rosemberg,1997; Delanghe, 1999). As implicaes da halitose na sade e com interferncia nos aspectos sociais, colocam esta condio numa rea de abrangncia que envolve a Odontologia, a Medicina e a Psicologia. Nas culturas mais antigas pode-se encontrar referncias a halitose, a exemplo da cultura Hebraica que h mais de dois mil anos esclarece no Talmud que um casamento poderia ser legalmente anulado caso um dos cnjuges apresentasse mau hlito. Outras referncias podem ser encontradas nas culturas Grega e Romana. Contudo, a halitose s foi cientificamente estudada no sculo XX, demonstrando-se que a halitose poderia ser fisiolgica ou patolgica e que a fonte do mau odor poderia estar localizada na boca, nasofaringe, ou outras partes do corpo (SANZ , ROLDN e HERRERA 2001). Diversas terminologias so empregadas para descrever a presena de odores desagradveis que emanem do ar expirado. Assim,

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halitose, fetor ex ore, fetor oris, mau odor oral ou mau hlito podem ser termos encontrados descrevendo as alteraes do hlito (TOUYZ, 1993). Uma primeira tentativa de classificao da halitose, associando as diferentes categorias com a necessidade de tratamento foi publicada em Japons por Miazaki et al em 1999 sob o ttulo: Tentativa de classificao da halitose e suas indicaes de tratamento (Tentative classification of halitosis and its treatment needs. Niigata Dent J, 1999; 32:7-11. Japonese). Posteriormente, Yaegaki e Coil (2000) difundiram os conceitos de Miazaki et al ao descrever um protocolo para exame, classificao e tratamento da halitose, que segundo os autores, deve ser utilizado para que se evite o inadequado tratamento dos portadores de pseudo-halitose ou halitofobia. Ao se receber para tratamento um paciente com queixa de halitose de fundamental importncia fazer-se a distino entre a halitose verdadeira e a pseudo-halitose. A halitose verdadeira descreve a situao na qual o mau odor um problema real que pode ser facilmente diagnosticado usando-se testes organolpticos ou meios fsico-qumicos. O termo pseudo-halitose usado quando o mau odor no existe de fato, mas o paciente insiste que seja portador de tal alterao. Se aps o adequado tratamento para halitose

verdadeira ou pseudo-halitose o paciente ainda insistir que possui alterao do hlito, esta condio ser classificada como halitofobia. A halitose verdadeira, por sua vez, apresenta a subclassificao em halitose fisiolgica e halitose patolgica, podendo ser esta ltima de origem bucal ou extra-bucal (YAEGAKI e COIL, 2000; MURATA et al, 2002).

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2.1. 2. AVALIAO DO HLITO.

A halitose pode ser mensurada por mtodos organolpticos e instrumentais. Os mtodos instrumentais incluem a cromatografia gasosa, monitores sulfdricos e nariz binico ou eletrnico. A investigao quanto a presena de halitose geralmente comea com a queixa de um paciente que se diz portador do problema ou que tenha sido informado por outro indivduo (LOESCHE e KAZOR, 2002). A partir deste momento a investigao quanto a presena de alterao do hlito se dar por uma medida organolptica ou com a utilizao de um monitor de gases. O desenvolvimento das tcnicas de anlise dos odores da cavidade bucal apresenta duas fases distintas. Uma primeira fase onde os instrumentos so utilizados para facilitar a avaliao organolptica, e uma fase onde os odores passam a ser mensurados atravs de testes fsicoqumicos. Brening, Sulser e Fosdick (1939) desenvolveram um aparelho chamado de crioscpio, que permitiu a avaliao dos odores do hlito de trs fontes primrias (boca, pulmes e cavidade nasal) de forma isolada. O crioscpio foi utilizado em conjunto com um outro aparelho desenvolvido em 1934 por Fair e Wells, o osmoscpio, inicialmente utilizado para a verificao da qualidade da gua atravs da olfao. Sulser, brening e Fosdick (1939) utilizaram o crioscpio e o osmoscpio e avaliaram algumas condies que afetam a concentrao dos

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odores no hlito. Os autores concluram que algumas variveis devem ser consideradas na produo dos odores bucais: presena de piorria1 gengivite, cries , tempo decorrido desde a ltima refeio, sexo e idade. Para o diagnstico e estudo da halitose encontram-se referncias a diferentes escala de odores. Assim, escalas com variaes de 0 a 5, 0 a 4 e 0 a 9 podem ser encontradas, onde os nmeros mais elevados correspondem a uma maior intensidade do odor percebido pelo examinador (PITTS et al, 1981; IWAKURA et al, 1994). Uma escala comumente utilizada aquela descrita por Allisson e Katz (1919) com variao de 0 a 5, criada para o controle de qualidade da gua e posteriormente utilizada para a

avaliao organolptica do hlito por Rosemberg et al (1991a). O uso de cromatografia gasosa na avaliao do ar da cavidade bucal foi introduzido por Tonzetich (1971) ao realizar um estudo onde o ar da cavidade bucal de 15 indivduos foi avaliado quanto a concentrao de compostos sulfurados volteis. Amostras de saliva dos mesmos indivduos foram incubadas e avaliadas pelo mesmo mtodo. Um cromatgrafo gasoso equipado com uma coluna de teflon. As amostras de ar da cavidade bucal foram colhidas atravs de seringa e imediatamente injetadas na coluna do cromatgrafo. Em 1975 Solis-Gafar et al realizaram um estudo clnico onde a cromatografia gasosa foi utilizada para analisar a eficcia de um colutrio contendo agente antibacteriano (quaternrio de amnia ). Uma modificao quanto a tcnica descrita no pargrafo anterior foi introduzida. Um sistema de vlvulas foi conectado a tubos de teflon de forma que uma extremidade do
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Naquele perodo da evoluo da Periodontia, utilizava-se o termo piorria para a descrio da Doena Periodontal.

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tubo era introduzida na cavidade bucal do indivduo e a outra extremidade era conectada a entrada do cromatgrafo. O estudo mostrou a reduo de

compostos sulfurados volteis (CSV) com o uso do antimicrobiano. Os autores concluram tambm que o uso da cromatografia gasosa estava indicada para a avaliao da eficcia de colutrios quanto a reduo de CSV na cavidade bucal. Com a evoluo dos estudos na rea de deteco dos odores do hlito foram desenvolvidos monitores que pudessem ser utilizados no consultrio odontolgico. Em 1991a, Rosemberg et al utilizaram um monitor de gases (compostos sulfurados) at ento usado para o controle ambiental na indstria. O estudo incluiu 75 voluntrios que tiveram os odores bucais avaliados atravs do monitor de gases e organolepticamente por 5 examinadores. Para o teste organolptico foi utilizada uma escala de 0 a 5. Foi observada uma significante correlao entre os dois mtodos utilizados. Rosemberg et al (1991b) avaliaram a reprodutibilidade e a

sensibilidade de um monitor porttil de compostos sulfurados envolvendo 42 sujeitos durante 12 semanas. Alm das medidas realizadas com o monitor de gases, foram realizados testes organolpticos, ndice de placa dentria, ndice de sangramento gengival e medio de bolsa periodontal. Soluo de clorexidina 0,2% foi utilizada e a mudana no odor bucal de cada indivduo foi avaliada, encontrando-se uma reduo de 47% na concentrao de compostos sulfurados. Os testes estatsticos aplicados mostraram maior

reprodutibilidade e sensibilidade nos resultados obtidos com o monitor quando comparado ao teste organolptico, mostrando a utilidade deste monitor em testes clnicos.

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Furne et al (2002) compararam as medidas na concentrao de compostos sulfurados volteis obtidas utilizando um monitor porttil (Halimeter) e cromatografia gasosa. Embora algumas diferenas tenham sido encontradas, as leituras com o monitor mostram uma correlao positiva com aquelas obtidas na avaliao por cromatografia gasosa. Em 2004, Tanaka et al utilizaram pela primeira vez um nariz eletrnico (FF-1 Odor discrimination analyzer) na avaliao da halitose. Os resultados foram comparados com os achados dos testes organolpticos e

cromatografia gasosa mostrando similaridade entre os mtodos de avaliao da halitose. Outros monitores portteis para a anlise de compostos sulfurados volteis foram desenvolvidos nos ltimos anos a exemplo do OralChroma - Ability,Japan (AIZAVA et al, 2005) e Breathtron - New Cosmos Eletric Company, Osaka, Japan (SOPAPORNAMORN et al, 2006).

2.1. 3. PEVALNCIA DA HALITOSE.

Segundo Loesche e Kazor (2002) poucos estudos documentaram a prevalncia da halitose a partir de uma amostra determinada populao. que representasse uma

Em um estudo na Sucia com uma amostra

aleatria de 1.681 indivduos, somente 2,4 % foram classificados como portadores de halitose. A presena de halitose foi definida como a presena de odor emanado da cavidade bucal do paciente e que surtia um efeito no examinador a ponto de tornar o exame martirizante. Em um estudo

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desenvolvido na Frana, 4.815 indivduos de 15 anos de idade responderam a um questionrio e 22% relataram ser portadores halitose. Os autores concluram que esta prevalncia est provavelmente superestimada

considerando-se a questionvel confiabilidade da auto-percepo da halitose. Em uma amostra com 2.672 indivduos no Japo, com idade entre 18 e 64 anos, 28% da amostra apresentou halitose. Neste estudo, os indivduos com halitose foram definidos como aqueles apresentando valores 75 ppb para compostos sulfurados volteis medido com o Halimeter (MIYAZAKY et al, 1997). Mais recentemente, Liu et al (2006) avaliaram a correlao entre os nveis de mau odor bucal e condies de sade bucal em 2000 indivduos na China, com igual nmero de indivduos das zonas urbanas e rurais. A

amostra foi dividida de forma que continha o mesmo nmero de indivduos do gnero masculino e feminino, entre 15 e 64 anos de idade. Ao teste organolptico, 27,5% dos indivduos apresentaram halitose. Na medida com um monitor de gases (Halimeter) 20,3% apresentaram medidas acima de 110 ppb e 35,4 % apresentaram medidas acima de 75 ppb. No foram verificadas diferenas significantes nos valores mdios medidos com o Halimeter para as diferentes faixas etrias ou para os grupos da zona urbana ou rural.

2.1. 4. ETIOLOGIA DA HALITOSE.

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Os primeiros estudos que avaliaram odores associados s alteraes do hlito buscaram relacionar a produo destes odores com os processos putrefativos da saliva. Em 1943 Law, Berg e Fosdick verificaram que as protenas salivares de indivduos com doena periodontal sofriam putrefao e hidrlise mais rapidamente do que protenas oriundas da saliva de indivduos sadios. Berg e Fosdick (1946) desenvolveram o primeiro estudo onde a saliva foi utilizada como um meio para o crescimento de microrganismos bucais em culturas isoladas. Os autores observaram que a introduo de uma maior quantidade do microrganismo testado resultava em um aumento do processo putrefativo. Observaram tambm que uma microbiota mista produzia putrefao mais rapidamente do que quando da presena de espcies isoladas. Os resultados quanto a produo de odores no mostraram

diferena quando a saliva foi incubada em condies de aerobiose ou anaerobiose. Berg, Burril e Fosdick (1947) observaram que a saliva de indivduos sadios possua a capacidade de gerar odores desagradveis aps 1 hora de incubao. Ao final de 3 horas de incubao estes odores tornavam-se

intensos ao ponto impedir uma medio acurada. A saliva de indivduos com doena periodontal apresentava uma maior velocidade de putrefao. Posteriormente, estudos de Ballantyne et al (1951), Clegg e Rae (1956) e Rae e Clegg (1956) demonstraram as alteraes na produo de amnia por microrganismos bucais quando ocorrem alteraes no pH da saliva. Shiota e Kunkel Jr. (1958) mostraram que estas mudanas no pH

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tambm so responsveis pelo maior ou menor crescimento de determinadas espcies de microrganismos. O trabalho de McNamara et al (1972) demonstrou que a gerao de mau odor na cavidade bucal ocorre devido a presena de microrganismos. Quando a saliva livre de microrganismos foi incubada isoladamente ou adicionada a caldo para cultura, nenhum odor foi produzido. Este trabalho tambm mostrou que nem todos os microrganismos tem a mesma capacidade de produzir estes odores, sendo os gram-negativos os principais responsveis. O pH foi tambm avaliado e amostras com pH 6,5 inibiram a formao de odor enquanto amostras com pH 7,2 mostraram presena de mau odor. A presena de glicose inibiu a formao de mau odor bucal e manteve o equilbrio na quantidade de microrganismos gram-positivos e gram-negativos. A capacidade de bactrias da bolsa periodontal em produzir compostos sulfurados volteis (CSV) foi avaliada por Persson, Claesson e Carlsson (1989). Bactrias foram colhidas de bolsas periodontais de 9

pacientes e cultivadas em soro humano. A medida de CSV foi realizada atravs de cromatografia gasosa e a quantidade de compostos sulfurados presente no soro aps a incubao foi determinada com espectrometria por emisso de plasma. Os resultados mostraram que as bactrias colhidas das bolsas periodontais tinham uma alta capacidade de produzir CSV quando cultivadas no soro humano, sendo o sulfidreto a principal composto sulfurado formado. Quantidades significantes de metilmercapitana e dimetilsulfeto foram tambm encontradas.

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Persson et al (1990) verificaram a capacidade de diferentes espcies bacterianas em produzir compostos sulfurados volteis. A capacidade de formao de CSV foi medida por cromatografia gasosa a partir de bactrias isoladas de bolsas periodontais e amostras padronizadas (ATCC). Um total de 163 amostras representando 75 espcies, alm de 7 bactrias at ento no classificadas, mostraram significativa capacidade de produzir CSV quando cultivadas no soro humano ou a partir da adio de L-cistena ou Lmetionina em soluo salina. Segundo os autores, os resultados

encontrados ampliaram a lista de bactrias bucais capazes de produzir CSV. Kleinberg e Kodipilly (1997) estudaram as bases biolgicas para a formao da halitose. Utilizando diversos microrganismos da cavidade bucal encontrados na placa bacteriana e introduzindo diversos aminocidos ao meio de cultura, os autores identificaram os microrganismos responsveis pela produo do mau hlito usando teste organolptico. Verificaram ainda que as bactrias anaerbias gram-negativas so as principais responsveis pela produo dos odores. Em 1999 Kleinberg e Codipilly utilizaram um modelo de sedimento salivar (Suspended Salivary Sediment - SSS) e avaliaram alguns parmetros relacionados a formao do mau odor bucal. Demonstraram a funcionalidade do SSS para testar a eficcia de substncias usadas em colutrios quanto a sua atividade antibacteriana e inibitria sobre a formao de compostos sulfurados volteis e outras substncias. Kato et al (2005) utilizaram a reao da cadeia de polimerase em tempo real para a anlise quantitativa de microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados volteis (CSV). Vinte e dois pacientes forneceram

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amostras da saliva, biofilme lingual e da placa subgengival. Estes pacientes foram avaliados quanto a produo de compostos sulfurados volteis por cromatografia gasosa a partir de amostras de ar da cavidade bucal Os

testes de PCR foram realizados para a anlise de Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Treponema denticola e Bacteroides forsythus. De acordo com os autores, esta metodologia pode ser usada para a anlise quantitativa de bactrias bucais produtoras de CSV. Algumas das bactrias diretamente relacionadas com as alteraes do hlito esto tambm esto associadas s alteraes periodontais e endodnticas (GOODSON, 1994; GOMES et al, 2005; SAKAMOTO et al, 2006; SEOL et al, 2006). Segundo Lee et al (2003) aceita-se a idia de que a causa principal da halitose seja devido a presena de compostos sulfurados volteis. Devese considerar, contudo a presena de outras substncias compondo o grupo de substncias que produzem os odores do hlito como cadaverina e putrescina, indol, escatol, piridina, entre outros (GOLDBERG et al, 1994; KLEIMBERG e CODIPILLY, 1997; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG, 2004).

2. 2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE.

A abordagem antimicrobiana no tratamento na reduo dos odores bucais est diretamente relacionada abordagem antimicrobiana utilizada na doena periodontal, uma vez que existem bactrias comuns a ambos os processos.

29

Baker at al (1987) avaliaram o efeito da clorexidina e uma srie de anlogos onde o clorofenil foi substitudo por cadeias do tipo alquil. A

clorexidina mostrou atividade antimicrobiana sobre baterias gram-negativas e gram-positivas. Os melhores resultados foram obtidos com o uso dos

agentes hexidecidine, hexhexidine e alexidine que apresentaram um largo espectro e boa ao sobre patgenos da cavidade bucal. Uma comparao quanto a substantividade de 9 produtos para higiene bucal, incluindo 2 dentifrcios, foi avaliada por Elworthy et al (1996). A

substantividade foi definida como a persistncia da ao antibacteriana ao longo de intervalos de 30, 60, 180, 300, e 420 minutos. A ao

antibacteriana foi medida a partir da contagem de unidades formadoras de colnias obtidas da coleta de saliva estimulada , incubada em anaerobiose por 72 horas. A clorexidina (0,12%) mostrou o melhor resultado com mxima eficcia aps 3 a 5 horas e mantendo o melhor resultado at o intervalo de

7 horas, quando comparada as demais substncias testadas. Herrera et al (2003) realizaram estudo in vitro e in vivo de 4 enxaguantes bucais contendo clorexidina a 0,12%. Teste de contato direto in vitro mostrou que Lactocacillus casei, Straptococcus mitis e Streptococcus micros foram sensveis a associao de clorexidina + cetilpiridnio e resistentes as associaes clorexidina + lcool, clorexidina + fluoreto de sdio e a clorexidina 0,12% de forma isolada. No estudo in vivo a contagem bacteriana mostrou uma maior reduo para as associaes clorexidina + cetilpiridnio e clorexidina + lcool, independentemente de se tratarem de bactrias aerbicas ou anaerbicas.

30

Sreenivasan (2003) realizou um ensaio clnico para avaliar a eficcia de um dentifrcio contendo triclosan associado a um copolmero ( PVM/MA polyvinyl methyl ether/maleic acid ) sobre bactrias bucais produtoras de sulfidreto. O efeito do dentifrcio testado foi comparado a um outro dentifrcio sem triclosan ou copolmero, em um modelo de estudo duplo cego e

cruzado. Para a avaliao do efeito antibacteriano, amostras de saliva foram coletadas e devidamente processadas para crescimento em trypticase soja agar (TSA) e um meio especfico contendo acetato de chumbo para o crescimento de bactrias produtoras de sulfidreto. Os resultados mostraram que o uso do dentifrcio contendo triclosan e o copolmero levaram a uma reduo significativa de todas as bactrias, incluindo aquelas produtoras de sulfidreto, corroborando resultados previamente obtidos com o uso deste dentifrcio na reduo do mau odor bucal. A reduo de compostos sulfurados volteis (CVS) com o uso de um colutrio foi avaliada por Winkel et al (2003). O estudo clnico duplo cego envolveu 40 voluntrios que utilizaram um colutrio teste contendo clorexidina, cetilpiridnio e lactato de zinco e um colutrio placebo. Os parmetros foram avaliados atravs de: teste organolptico ( 0 5 ), nvel de CSV, ndice de Winkel para saburra lingual e manchamento lingual e manchamento dentrio. O uso do colutrio teste levou a uma significante reduo do teste organolptico de 2,8 para 1. A mdia de CSV caiu de 292 ppb para 172 ppb no grupo teste enquanto nenhuma reduo foi observada no grupo controle. Em ambos os grupos no foi observada reduo lingual foi um

significativa no ndice de saburra lingual. O manchamento

31

efeito adverso observado apenas no grupo teste. Concluram os autores que o colutrio testado foi eficaz no tratamento da halitose. Uma reduo na contagem de microrganismos anaerbios

subgengivais foi encontrada por Santos et al (2004) ao avaliarem a eficcia do uso da clorexidina (0,05%) associada ao cloreto de cetilpiridnio (0,05%) usado por um perodo de 15 dias. Um ensaio clnico aleatrio utilizando

placebo foi realizado com 33 portadores de periodontite crnica previamente tratados. Observou-se uma reduo significativa da microbiota e na A

freqncia de deteco de Porphyromonas gingivalis no grupo teste.

formulao antissptica testada demonstrou uma atividade inibitria de curto prazo na formao de biofilme dental. Um estudo de Carvalho et al (2004) avaliou o impacto de colutrios sobre o hlito matinal. Usando um modelo duplo cego, aleatrio e cruzado, os autores avaliaram 4 diferentes marcas comerciais de colutrios disponveis no Brasil, em um grupo de 12 indivduos, por um perodo de 4 dias. Os produtos continham respectivamente: triclosan (0,03%), gluconato de clorexidina (0,12%), cloreto de cetilpiridnio e leos essenciais. Foram utilizados controle positivo e negativo, e se avaliou: nveis de compostos sulfurados volteis (CSV) com Halimeter, ndice de gengivite e ndice de placa dentria. O gluconato de clorexidina (0,12%) foi o produto que se mostrou mais eficaz na reduo de CSV. Roldn et al (2004) desenvolveram um estudo duplo cego, cruzado utilizando controle negativo com 10 indivduos para comparar a eficcia de 5 diferentes colutrios contendo clorexidina, com relao ao seu efeito sobre a concentrao de compostos sulfurados volteis e contagem de bactrias na

32

saliva (aerbias e anaerbias).

As formulaes continham:

clorexidina

0,12% (CHX + NO); clorexidina 0,12% + lcool (CHX + ALC); clorexidina 0,12% + cetilpiridnio 0,05% (CHX + CPC); clorexidina 0,12% + fluoreto de sdio (CHX + NaF); e clorexidina 0,05%, + cetilpiridnio 0,05% + acetato de zinco 0,14% (CHX + Zn). As medidas de CVS com Halimeter, teste

organolptico, ndice de saburra lingual e contagem bacteriana na saliva foram realizadas antes do uso dos produtos seguindo-se novas avaliaes com 1 e 5 horas aps o uso dos mesmos. Com relao aos CSV o melhor resultado em 1 hora ocorreu com o uso de CHX + NO e CHX + Zn. Aps 5 horas os melhores resultados foram obtidos com o uso de CHX + CPC e CHX + Zn. Com relao a contagem bacteriana CHX + CPC mostrou o melhor desempenho tanto sobre bactrias aerbicas como anaerbicas. Concluem os autores que diferenas importantes podem ser observadas com o uso de diferentes formulaes contendo clorexidina. Sekino et al (2004) avaliaram o uso da clorexidina na formao do biofilme dental atravs de um ensaio clnico duplo cego. Alm do uso de colutrio com clorexidina (0,2%), os voluntrios da pesquisa utilizaram clorexidina gel (1,0%) para escovao da lngua. Exames foram realizados do 1 ao 4 dia. Observou-se que o uso da clorexidina na forma de bochechos associado ao uso do gel reduziu a formao de novo biofilme bacteriano, diminuindo o nmero de microrganismos do biofilme o nmero de microrganismos na saliva. Colutrios contendo baixas concentraes de clorexidina foram avaliados quanto a ao antimicrobiana sobre bactrias produtoras de sulfidreto e relacionadas halitose. Sreenivasan e Gittins (2004) realizaram

33

um ensaio clnico aleatrio para comparar a eficcia de colutrios contendo clorexidina nas concentraes de 0,03% , 0,06% e 0,12% , com relao ao colutrio controle sem clorexidina. mostraram significativa reduo Bactrias produtoras de sulfidretos ps-tratamento para ambas as

concentraes de clorexidina quando comparadas ao controle . Recentemente, um dentifrcio em forma lquida contendo

triclosan/copolmero foi testado in vitro por Sreenivasan et al (2005) quanto a sua ao antimicrobiana sobre 13 espcies de microrganismos da cavidade bucal, incluindo Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia. Adicionalmente, testes microbiolgicos ex vivo avaliaram sua eficcia a partir de saliva coletada de indivduos que utilizaram o dentifrcio e compararam seus efeitos com outras duas amostras dentifrcios contendo ingredientes tpicos (flavorisantes, de

humectantes,

abrasivos, sufactantes e fluoreto de sdio). Em ambos os testes o uso do dentifrcio contendo triclosan/copolmero resultou em uma significante reduo no nmero de bactrias cultivveis quando comparado aos demais dentifrcios. Quirynen et al (2005) realizaram um estudo duplo cego, aleatrio de longa durao (6 meses) e avaliaram a eficcia de colutrios contendo clorexidina 0,05% + cloreto de cetilpiridnio 0,05% em formulaes com ou sem lcool, comparando-as com um placebo (sem lcool). Depois de 1, 3 e 6 meses uma srie de parmetros clnicos e microbiolgicos foram avaliados. Dentre estes parmetros, foi avaliado o efeito dos colutrios sobre bactrias anaerbias, inclusive Fusobacterium nucleatum. Efeitos adversos tambm foram avaliados. As formulaes com ou sem lcool foram igualmente

34

eficazes na reduo das bactrias na placa bacteriana dental e na saliva. Concluem os autores que as formulaes testadas so efetivas enquanto agentes inibidores do biofilme bucal a longo praso, apresentando reduzidos efeitos colaterais. Um colutrio contendo benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% foi testado por Herrera et al (2005) quanto a sua eficcia na preveno da recolonizao da placa bacteriana num perodo de 4 dias. Um colutrio contendo cloreto cetilpiridinio e um placebo foram usados para comparao. Dentre os microrganismos testados estavam includos: nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas Fusobacterium gingivalis e

Prevotella intermedia.

Resultados demonstraram que houve uma ao

inibitria da associao benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% sobre Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia, quando comparada ao placebo. Lakhssassi et al (2005) estudaram a susceptibilidade antimicrobiana de 50 patgenos anaerbicos colhidos de 20 sujeitos adultos e com diagnstico de doena periodontal agressiva. Foram isoladas amostras de Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum e Peptostreptococcus micros. Foram testados 10 antibiticos utilizando-se as tcnicas de microdiluio e difuso em agar (discos). Os resultados da difuso mostraram que, nas amostras estudadas, os antibiticos amoxicilina, ampicilina, amoxicilina/clavulanato, doxiciclina, e clindamicina mostraram-se efetivos. Ciprofloxacina e clindamicina

apresentaram baixa eficcia contra os microrganismos estudados.

35

Um estudo sobre o efeito antimicrobiano de dentifrcio contendo triclosan/copolmero (triclosan 0,3%, gantrez 2%) e de colutrio contendo diferentes concentraes de clorexidina (0,12% e 0,06%) foi desenvolvido por Yang e Sreenivasan (2005). Foi utilizado um modelo ex vivo onde amostras bacterianas colhidas a partir da saliva e do dorso da lngua foram expostas as substncias testes e depois cultivadas em meios apropriados, incluindo meio de cultura especfico para o crescimento de bactrias produtoras de sulfidreto. A exposio ao dentifrcio mostrou efeito antimicrobiano dose dependente , sobre bactrias anaerbias e facultativas O efeito dos

colutrios bucais contendo clorexidina sobre bactrias produtoras de sulfidreto mostrou uma reduo de 82% e 69% para as concentraes do colutrio de 0,12% e 0,06%, respectivamente. Contudo, no foi observada uma significante resposta dose dependente.

2. 3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS.

Os

produtos

naturais

obtidos

diretamente

de

vegetais

ou

microrganismos so uma importante fonte de compostos que orientam a indstria farmacutica na busca de novos medicamentos (HASLAN, 1996). Populaes em todos os continentes tm experimentado o poder de cura das plantas e utilizado milhares destas plantas desde a pr-histria (COWAN, 1999). Desde a antiguidade a humanidade tem usado as plantas para o tratamento de doenas. Na verdade, muito antes da descoberta das bactrias, aceitava-se que certas plantas apresentavam o potencial para

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curar diversas enfermidades. Alguns dos medicamentos de origem vegetal chamados atualmente de medicamentos tradicionais so ainda utilizados (RIOS e RECIO, 2005). Em diversos continentes cresce o nmero de estudos que procuram comprovar o que divulgado como conhecimento popular sobre a atividade de determinadas plantas no combate s doenas (STICKEL, PATSENKER e SCHUPPAN, 2005; FUNARI e FERRO, 2005; MICHELIN MELNDEZ e CAPRILES, 2006). De acordo com Lorenzi e Matos (2002) diversas partes das plantas so empregadas nas chamadas prticas caseiras do uso de plantas medicinais. So usadas as folhas, cascas, razes, o ltex, frutos e sementes. As formas de utilizao so variadas e podem incluir: chs, inalao, xaropes, tinturas, entre outras. Neste contexto, a atividade antimicrobiana de diversas espcies de plantas tem sido avaliada. Na Guatemala, Cceres et al (1987) realizaram uma pesquisa entre vendedores e curandeiros e detectaram o uso de pelo menos 200 plantas usadas para o tratamento de leses da pele e mucosas. Numa seleo de 21 plantas usadas com propsitos medicinais na frica do Sul, Rabe e Staden (1997) verificaram que 12 das espcies testadas apresentaram atividade antibacteriana sobre bactrias Grampositivas. Na Nigria, Kudi et al (1999) avaliaram a atividade antimicrobiana de 8 espcies de plantas tradicionalmente utilizadas no tratamento de infeces tanto em humanos como em animais. A maioria dos extratos apresentou atividade inibitria sobre bactrias Gram-positivas. Duas espcies et al, 2005;

37

(Angeiossus schimperi e Anacardium occidentali) apresentaram atividade inibitria sobre bactrias Gram-negativas, as quais sejam, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. No norte da Argentina, Salvat et al (2001) avaliaram a atividade antimicrobiana de 25 espcies de plantas. Entre outros resultados, a Vassobia breviflora apresentou atividade bacteriosttica sobre

Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium. No estudo de Geyid et al (2005) no qual foram avaliados extratos de 44 plantas usadas no tratamento de doenas infecciosas na Etipia, verificouse que de modo geral, quanto maior o nmero de substncias constituintes apresenta uma determinada espcie de planta, maior a diversidade de microrganismos sobre os quais esta planta ter atividade inibitria. Segundos os autores, pode-se explicar este fenmeno por um possvel efeito de sinergismo entre os diversos componentes presentes no extrato. Holetz et al (2002) realizaram um estudo e avaliaram a atividade antimicrobiana de 13 plantas usadas popularmente no Brasil para o tratamento de doenas infecciosas. Dez dos extratos produzidos a partir das plantas testadas mostraram variados nveis de atividade antibacteriana. Por exemplo, o extrato de Piper regnelli (Pariparoba) presentou boa atividade sobre Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis. O extrato de Punica granatum (Rom) mostrou boa atividade sobre Staphylococcus aureus. Silva e Andrade (2005) verificaram as diferentes formas de utilizao da vegetao por parte de comunidades da Zona do Litoral e da Mata do Estado de Pernambuco Brasil. Dentre as diversas formas de uso verificouse que o uso medicinal apresentou o maior nmero de espcies em todas as

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comunidades estudadas, correspondendo a quase a metade (169) do total de plantas indicadas pelos participantes na pesquisa. As ervas foram descritas como mais frequentemente utilizadas, com pouca utilizao das arbreas e arbustivas. De acordo com Maciel et al (2002) o uso das plantas medicinais o nico recurso de que dispem algumas comunidades e grupos tnicos. No Brasil o uso de plantas com finalidade teraputica ocorre nas regies mais pobres do pas assim como nas grandes cidades e diversas plantas so comercializadas em feiras-livres, mercados populares e at encontradas cultivadas em quintais residenciais. Dois aspectos importantes devem ser considerados no uso dos fitoterpicos: a possibilidade de toxicidade e a possibilidade de interao medicamentosa. Segundo Calixto (2000), no Brasil, a despeito da imensa

diversidade botnica e o largo uso de ervas medicinais, poucos esforos tem sido feito no sentido de se estabelecer a qualidade, segurana e eficcia destes produtos. Sabe-se que as plantas em geral contem centenas de

constituintes sendo alguns destes muito txicos. Segundo o autor: a idia de que produtos naturais so seguros e livres de efeitos colaterais falsa. Existe um senso comum de que produtos obtidos a partir de plantas so intrinsecamente inofencveis, uma vez que so naturais. Todavia, seus efeitos derivam de suas caractersticas farmacolgicas e dos nveis de ingredientes ativos. Efeitos txicos podem tambm ser atribudos a toxicidade

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de seus constituintes, contaminao por pesticidas, microrganismos ou metais pesados (CAPASSO et al, 2000). Sabe-se que fatores intrnsecos e extrnsecos incluindo diferenas de espcies, variao durante diferentes estaes do ano, ambiente, coleta, cultivo, contaminao, substituio e processamento podem afetar a qualidade botnica do material utilizado na produo de medicamentos e consequentemente a sua eficcia e segurana (REICHLING e SALLER, 1998; FONG, 2002). Muitos medicamentos naturais so utilizados como auto-medicao por adultos e algumas vezes em doses excessivas ou misturas com at 10 plantas diferentes, as vezes associados a vitaminas e minerais. Pode ocorrer ento efeito txico proveniente de uma das plantas utilizadas ou decorrente da interao entre elas. So ainda desconhecidas as conseqncias da

exposio em longo prazo e no se deve excluir a carcinogenicidade, mutagenicidade, efeito txico sobre o feto ou a criana ( WOOLF, 2003). Fugh-Berman (2000) alerta para o perigo das interaes entre certos medicamentos alopticos e fitoterpicos. Pacientes em uso de ciclosporina ou digoxina devem evitar o uso de Hypericum perforatum L. (Erva de So Joo) e misturas de ervas chinesas que podem potencializar o efeito de corticosterides. Sparreboom et al (2004) revisaram a literatura cientfica publicada sobre a interao de medicamentos fitoterpicos usados concomitantemente com medicamentos alopticos no tratamento do cncer. Verificaram que

Allium sativum, Gingko bliloba, Echinacea purprea, Panax ginseng, 40

Hipericum perforatum e Piper methysticum podem atuar

na modulao de

enzimas e interferir tanto na absoro por via oral quanto no metabolismo heptico de medicamentos alopticos usados em oncologia. As plantas includas neste estudo j foram previamente avaliadas quanto a sua atividade antimicrobiana ou apontadas como teis para o tratamento de diferentes doenas por diferentes populaes, atravs de estudos de etnofarmacologia. Das espcies aqui estudadas, Caesalpinia ferrea Mart. (juc) e Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (macass) foram encontradas na literatura cientfica em pesquisas envolvendo sua atividade antiinflamatria e anticonvulsivante. Contudo, substncias que apresentam atividade antimicrobiana so encontradas em sua composio, a exemplo da presena de taninos e linalol no macass (CARVALHO et al, 1996; COSTALOTUFO et al, 2004; LIMYATI e JUNIAR,1997; LPEZ et al, 2005; MAU, CHEN e HSIEH, 2001; SANTOYO et al, 2004; SOUZA et al, 2004;

VASCONCELOS et al, 2003). 2. 3. 1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS NA ODONTOLOGIA. O uso de plantas medicinais na Odontologia segue o padro para o uso de plantas medicinais em geral. O conhecimento popular da ao de determinada planta disseminado entre a populao e o seu uso passa a ser empregado nas afeces bucais. Xavier, Ramos e Xavier Filho (1995) realizaram estudo bibliogrfico e entrevista com raizeiros no Estado da Paraba e descreveram diversas

41

plantas e suas indicaes nas afeces bucais, como no combate a aftas, abscessos, gengivite, ulceraes por prteses mal adaptadas, entre outras. Um estudo duplo-cego de 9 meses de durao foi conduzido por Gordon et al (1985) para avaliar a eficcia de um colutrio contendo leos essenciais (Listerine) em inibir o desenvolvimento do biofilme dental e da gengivite. O estudo incluiu 127 sujeitos com idade entre 18 e 54 anos. Quando comparado ao uso do controle, o uso da substncia teste mostrou uma reduo de 12,1%, 18,3% e 18,0% na formao de biofilme dental, nas avaliaes realizadas nos intervalos de 1, 3 e 6 meses, respectivamente. Reduo significativa foi tambm observada para o ndice de gengivite aos nove meses de uso do produto. DePaola et al (1989) a inibio da formao do biofilme dental e da gengivite em um estudo duplo-cego conduzido em 107 indivduos adultos. O estudo teve durao de 6 meses e comparou a eficcia do Listerine ao uso de um controle com soluo hidroalcolica a 5%. Ao final do estudo no foi observado manchamento extrnseco dos dentes ou tecidos moles, e a substncia teste levou reduo de 34% nos ndices de formao de biofilme dental e gengivite. O efeito antimicrobiano sobre microrganismos do biofilme dental do extrato hidroalcolico da Punica Granatum Linn. foi avaliado por Pereira (2002) em uma pesquisa in vitro e tambm numa avaliao clnica de um dentifrcio contendo este mesmo extrato. Observou-se que o extrato atividade bactericida sobre Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis e Lactobacillus casei. O extrato de Punica granatum Linn. inibiu a aderncia ao vidro de todos os microrganismos

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testados. O estudo clnico demonstrou a reduo na contagem de S. mutans em 54,8 % dos indivduos aps 30 dias de uso do creme dental contendo o extrato teste. Vasconcelos et al (2003) compararam o gel de Punica Granatum Linn. e o miconazol quanto a sua eficcia no tratamento da candidose bucal associada a estomatite prottica. Resultados clnicos e laboratoriais

apresentaram uma resposta semelhante entre as duas substncias utilizadas indicando a possibilidade do uso do gel de Punica Granatum no tratamento da enfermidade estudada. A ao da Camelia sinensis (Oolong tea) foi avaliada sobre Streptococcus mutans. Os resultados demonstraram um efeito inibidor sobre a enzima glicosiltransferase que permite a sntese de glucanos, responsveis pela aderncia destes microrganismos superfcie dentria (NAKAHARA et al, 1993). Gebara, Zardetto e Mayer (1996) estudaram a ao antimicrobiana in vitro de produtos naturais sobre Streptococcus mutans e Streptococcus

sobrinus. Foram avaliadas tinturas de cacau, camomila, malva, salva e tomilho e estabelecidas as concentraes inibitrias mnimas e

concentraes inibitrias mnimas de aderncia.

Cacau e tomilho

apresentaram tanto ao antibacteriana como inibio da aderncia ao vidro dos microrganismos testados. Pan et al (2000) utilizaram um mtodo de colorao bacteriana (LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR USA) para verificar a eficcia de um colutrio contendo leos

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essenciais (Listerine). Dezessete sujeitos participaram do estudo do tipo aleatrio e cruzado. Todos os participantes usaram o colutrio e o controle, observando-se um perodo de uma semana de intervalo. Trinta minutos aps a realizao de bochechos de 30 segundos com a substncia teste ou com uma soluo salina como controle, realizou-se a contagem de bactrias viveis e no viveis presentes no biofilme dental. Os resultados foram comparados com os resultados das coletas de biofilme dental obtidos

previamente a realizao do uso das substncias teste e controle. O uso do colutrio contendo leos essenciais determinou a destruio de 78,7% das bactrias enquanto o controle de terminou a destruio de 27,9% das bactrias. O leo essencial de Cymbopogon citratus (capim-santo) foi avaliado em um estudo in vivo por Santos (2000) e demonstrou eficcia na reduo da colonizao de fungos do gnero Candida na mucosa do palato e na base de dentaduras. De acordo com Matsumoto, Hamada e Ooshima (2003) polifenis presentes no extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) apresentaram atividade inibitria sobre as enzimas glicosiltransferase B e D de

Streptococcus mutans . A velocidade de sntese de glucano foi diminuida quando da presena de polifenol (OTF6) quando comparada a velocidade de sntese na ausncia desta substncia. Isto sugere que o polifenol testado reduz a sntese do glucano por inibio enzimtica e no por competitividade. O extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) foi testado quanto a sua atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus. Nenhuma atividade inibitria sobre os microrganismos foi

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observada no cultivo em caldo (BHI- Brain- Heart Infusion Broth). A atividade antibacteriana foi observada numa suspenso de soluo salina tamponada e foi mais acentuada para fraes monomricas dos polifenis. Os resultados sugerem que a atividade antibacteriana da Camelia sinensis seja

conseqncia do efeito sinrgico de polifenis monomricos que se ligam a protenas (SASAKI et al, 2004). Charles et al (2004) compararam o efeito da clorexidina e leos essenciais (Listerine) usados como colutrio num ensaio clnico com 6 meses de durao. O Listerine foi descrito com a seguinte composio: 0,064% de timol, 0,092% de eucaliptol, 0,060% de metilsalicilato e 0,042% de mentol. Uma soluo hidroalcolica a 5% foi usada como controle negativo. 108 sujeitos foram aleatoriamente distribudos em 3 grupos. Os resultados dos ndices de sangramento gengival, biofilme dental, clculo dental e

manchamento dental foram comparados com os ndices obtidos no incio do experimento. Aps 6 meses ambos os colutrios mostraram resultados

semelhantes quanto ao efeito sobre o biofilme dental e a gengivite. O grupo que usou a clorexidina mostrou uma maior quantidade de clculo dental e manchamento dental quando comparado ao grupo que usou o colutrio com leos essenciais ou controle negativo. O efeito inibitrio do extrato da casca da semente da Theobroma cacao (cacau) sobre Streptococcus mutans foi avaliado por Matsumoto et al (2004). O estudo foi dividido em um experimento in vitro e um ensaio clnico onde indivduos utilizaram bochechos com o extrato estudado e forneceram amostras de saliva para contagem bacteriana. No estudo in vitro o extrato reduziu de forma significativa a aderncia do S. mutans a discos de

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hidroxiapatita cobertos com saliva, a formao do biofilme dental artificial e a contagem bacteriana. No estudo in vivo constatou-se a reduo da formao do biofilme dental mensurado pelo ndice de placa bacteriana e a reduo na contagem de S. mutans na saliva. Nostro et al (2004) estudaram a ao do extrato de Helichrysum italicum sobre Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius e

Streptococcus sanguis. O estudo avaliou ainda: a ao do extrato sobre a hidrofobicidade do S. mutans, um importante fator relacionado a capacidade de aderncia a estrutura dentria; celular. a aderncia ao vidro; e a agregao

O extrato estudado mostrou atividade antimicrobiana sobre os 3

microrganismos testados. Concentraes menores que a concentrao inibitria mnima apresentaram atividade redutora na aderncia do S. mutans a superfcie do vidro e na hidrofobicidade e ainda interferncia na agregao bacteriana. A associao de clorexidina e leos essenciais foi avaliada quanto a sua atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Lactobacilus plantarum . Os resultados revelaram que quando a clorexidina foi associada a leos essenciais, a quantidade de clorexidina necessria para inibir o crescimento bacteriano foi reduzida de 4 a 10 vezes (FILOCHE, SOMA e SISSONS, 2005).

2. 3. 2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERPICOS NO TRATAMENTO DA HALITOSE.

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Descreveremos a seguir alguns estudos que utilizaram a abordagem antimicrobiana relacionada reduo da halitose com uso de leos essenciais e outros fitoterpicos. Tambm foram includos neste tpico

estudos que fazem referncia direta a micorganismos reconhecidamente produtores de compostos sulfurados volteis. Em 1949 Morris e Read avaliaram a variao da intensidade do odor bucal e do odor decorrente da putrefao da saliva quando da ao de um colutrio contendo mentol, timol, eucaliptol, salicilato de metila, cido benzico e cido brico. Os resultados mostraram que a diluio da saliva com 6% do antissptico impediu a completamente a formao de odores. O uso do coltrio levou a reduo dos odores do hlito medidos com osmoscpio. Pianotti e Pitts (1978) verificaram a eficcia na reduo do nmero de bactrias Gran-negativas relacionadas a halitose aps o uso de Listerine como colutrio. Os resultados mostraram a reduo estatisticamente significante dos microrganismos colhidos do sulco gengival de 5 indivduos aps 15, 60 e 120 minutos da realizao de bochecho com o colutrio testado. minutos Contudo, a reduo do nmero de microrganismos aps 180 no mostrou diferena estatisticamente significante quando

comparada as medidas realizadas antes do uso do colutrio. Pitts et al (1983) realizaram um estudo aleatrio, duplo-cego do tipo cruzado que incluiu 30 voluntrios. A eficcia do Listerine ( Warner- Lambert Co, USA) foi comparada a de um colutrio placebo (formulao sem a

presena dos leos essenciais) e um colutrio contendo apenas gua. Foram avaliados: a populao de microrganismos a partir de amostras da lngua e

47

sulco gengival; intensidade do odor bucal a partir de testes organolpticos; medida de compostos sulfurados volteis (CSV) com cromatografia gasosa. O efeito do uso das substancias foi avaliado aps 30, 60 e 180 minutos. O colutrio teste foi efetivo em reduzir todos os determinantes do mau odor bucal analisados. Destacam os autores que o efeito mascarador se mostrou importante apenas nos primeiros 30 minutos. Os resultados em 60 e 180 minutos foram atribudos ao efeito antibacteriano do colutrio. O controle da halitose, gengivite e formao do biofilme dental foi avaliado por um perodo de 6 semanas por Kozlovsky et al (1996), utilizando um colutrio contendo cloreto de cetilpiridnio e leo (Assuta, 2 phase oil:water mouthrinse, Sherman Soad Industries Israel) . O Listerine foi usado como controle positivo. A reduo na formao de compostos sulfurados volteis foi medida com um monitor porttil (Model 1170, Interscan Corp. Ca, USA). Outros parmetros foram avaliados: teste organolptico, ndice de biofilme dental, ndice de sangramento gengival, nvel de

microrganismos na saliva. Houve uma reduo da halitose de 80% e 70% para o TPM e Listerine, respectivamente. O Listerine contudo, mostrou-se mais eficaz quanto a reduo do ndice de formao do biofilme dental. Os efeitos antimicrobianos da Arnica montana e da prpolis sobre diversos microrganismos da cavidade bucal, incluindo Porphyromonas gingivalis, foram avaliados por Koo et al (2000). A atividade antimicrobiana foi determinada pela difuso em gar. A prpolis mostrou melhor resultado. O resultado do extrato de Arnica montana sobre a bactria P. gingivalis foi discreto, sem uma diferena estatisticamente significante ao resultado do controle (soluo hidroalcolica de etanol a 80%, v/v ).

48

A eficcia na reduo de compostos sulfurados volteis de 4 colutrios foi avaliada em um estudo clnico por Rsing, Jonski e Rlla (2002) utilizando cromatografia gasosa. Um dos colutrios utilizados foi descrito como contendo produtos derivados de ervar, contudo no especificadas. Os

resultados mostraram que o colutrio contendo acetato de zinco (0,1%) mostrou o melhor resultado. O colutrio contendo ervas, juntamente com colutrios contendo triclosan, flor e bicarbonato de sdio apresentaram um baixo nvel de reduo na formao de compostos sulfurados volteis sem diferena estatisticamente significante entre eles. Borden et al (2002) verificaram a reduo do odor bucal atravs de teste organolptico e medida de compostos sulfurados volteis com um monitor de gases (Halimeter) num grupo de 99 sujeitos em um estudo de 4 semanas. Foi realizado um estudo aleatrio, duplo-cego e longitudinal onde foram avaliados 3 diferentes colutrios: leos essenciais (Listerine ), cloreto de cetilpiridnio e outro contendo a associao de dixido de cloro e zinco. Um placebo tambm foi utilizado. Os resultados domonstraram que as 4 substncias reduziram o mau odor bucal por um perodo de 4 horas aps o uso, sendo a maior reduo produzida pelo uso do cloreto de cetilpitidnio e a menor pelo placebo. O cloreto de cetilpiridnio mostrou o melhor resultado tambm nos perodos de 2 e 4 semanas. O leo de Melaleuca alternifolia, uma rvore Australiana, foi testado in vitro quanto a sua ao sobre bactrias orais por Hammer et al (2003). 161 amostras de bactrias incluindo Fusobacterium ssp. e Prevotella intermedia foram utilizadas. Foram utilizados os mtodos de microdiluio e macrodiluio em caldo. Dado o grande nmero de gneros e espcies

49

utilizados uma grande variao foi encontrada nos resultados.

Para as

diferentes espcies de estreptococos a concentrao inibitria mnima (CIM) variou de 0,12% a 2%. Alguns das bactrias de outros gneros foram consideradas mais susceptveis ao leo estudado, com bactrias do gnero Prevotella e Veillonella apresentando CIM para concentraes de 0,016%. O efeito antimicrobiano de um colutrio contendo leos essenciais em associao com zinco (0,09%) foi testado por Fine et al (2005). Foram usadas amostras de biofilme dental supragengival e do dorso da lngua. As amostras foram cultivadas de forma que se pode mensurar a reduo de bactrias anaerbias e tambm foi utilizado meio de cultura especfico para bactrias produtoras de compostos sulfurados volteis (CSV). O estudo contou com 17 sujeitos e foi usado um modelo aleatrio, duplo cego e cruzado. As avaliaes foram feitas 12 horas aps a realizao de um nico bochecho com o colutrio, e 12 horas aps um perodo de 14 dias de uso dirio do colutrio. As mdias de redues encontradas no nmero de

bactrias variaram de 56,3% a 95,3% para o biofilme dental e 61,1% a 96,1% para o biofilme lingual. O uso do colutrio teste mostrou um efeito positivo na reduo do nmero de anaerbios e bactrias produtoras de CSV.

2. 4. POLIFENIS.

Os Polifenis representam o grupo mais comum de substncias encontradas nos vegetais. So descritos como metablitos secundrios sem uma funo especfica para o metabolismo intracelular. Nos vegetais, estas substncias assumem importante funo de proteo seja por sua ao

50

antimicrobiana ou na proteo da integridade da planta ao conferir um sabor desagradvel, e evitando a ingesto da mesma por espcies animais (BENNICK, 2002). O grupo de antioxidantes mais abundantes na dieta humana constitudo pelos polifenis. Seus efeitos enquanto antioxidantes, absoro biodisponibilidade, riscos e segurana incluindo a interao com

medicamentos so estudados por diversas reas incluindo a Nutrio (KROON et al, 2004; MENNEN et al, 2005; SCALBERT, JOHNSON e SCALMARSH, 2005). No escopo deste trabalho, destaca-se a ao antimicrobiana dos polifenis. Estima-se que o nmero de metablitos secundrios nos vegetais ultrapasse 100.000 e so 3 os principais grupos conhecidos: terpenos, fenis e alcalides. Todavia, a definio destes grupos no muito rgida uma vez que, entre outras reaes, alguns precursores da biossntese de fenis podem originar alcalides. Os fenis possuem pelo menos um grupo hidroxila ou derivado funcional ligado a um sistema de anel aromtico e podem ser identificados como diversas substncias: arbutina, hidroquinona, cido glico, cido cinmico, cumarina, lignina, flavonas e antocianidinas (CARVALHO, 2004). Segundo Haslam (1995) tanino o nome genrico usado para descrever um grupo de fenis polimricos capazes de curtir o couro ou precipitar gelatina em suspenso, uma propriedade conhecida como adstringncia. Podem ser encontrados com a variao de peso molecular entre 500 e 3000. Como outros polifenis, apresentam uma variedade de propriedades, tais como: ao bactericida, moluscocida, antihelmntica e

51

capacidade de inibio viral.

A ao dos taninos se d por mecanismos

diversos e inclui: a ligao com ons metlicos, atividade antioxidante, a capacidade de ligao com outras molculas incluindo macromolculas do tipo protenas e polissacardeos. Os mecanismos de ao dos taninos sobre os microrganismos so estudados h dcadas. Esta ao estudada a partir de estudos in vitro que avaliam o crescimento de micelos de fungos filamentosos, contagem de colnias bacterianas em placas e testes de difuso em disco. Parmetros bioqumicos do metabolismo de certos microrganismos so utilizados nestes estudos a exemplo da degradao da celulose, produo de metano ou etanol e sntese de glucano, esta ltima usada na avaliao da ao sobre Streptococcus mutans ( SCALBERT, 1991). Cowan (1999) realizou uma extensa reviso sobre as propriedades antimicrobianas dos constituintes de plantas medicinais.. Os elagitaninos aparecem como o grupo com o maior nmero de possveis mecanismos de ao: A ligao com protenas (ligao com adesinas, inibio enzimtica, inibio do substrato, formao de complexos com a parede celular, ruptura de membrana, ligao com ons metlicos) e B Interao com o DNA (ao antiviral). A seguir podemos ver um quadro que destaca algumas plantas e a atividade dos polifenis. Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a ateno para o fato de que classificao dos taninos em hidrolisveis e condensados est bem estabelecida na literatura e frequentemente utilizada. Todavia, entre os hidrolisveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores, sabe-se que alguns elagitaninos no so hidrolisveis e por isso propuseram

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a classificao dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos complexos e taninos condensados.

NOME CIENTFICO Rhamnus purshiana Eucalyptus globulus Melissa officinalis Onobrychis viciifolia Artemsia dracumculus Thymus vulgaris

NOME POPULAR Cscara sagrada Eucalipto Limo

ATIVIDADE Vrus, bactrias fungos Bactria, vrus Vrus Bactrias de ruminantes

Artemsia Tomilho

Vrus Vrus, bactrias e fungos

Quadro 1. Atividade antimicrobiana de taninos extrados de algumas plantas.Fonte: Adaptado de Cowan, 1999. Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a ateno para o fato de que classificao dos taninos em hidrolisveis e condensados est bem estabelecida na literatura e frequentemente utilizada. Todavia, entre os hidrolisveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores, sabe-se que alguns elagitaninos no so hidrolisveis e por isso propuseram a classificao dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos complexos e taninos condensados. Os taninos podem se ligar a protenas salivares, em especial histatinas e protenas ricas em prolina. Acredita-se ser este um mecanismo de defesa direcionado a reduzir a absoro de taninos, considerando-se a sua potencial toxicidade sobre humanos e animais (YAN e BENNICK, 1995; LU e BENNICK, 1998).

53

Joiner et al (2004) estudaram as caractersticas da adsoro de polifenis sobre pelculas de protenas salivares formadas sobre discos de hidroxiapatita. Utilizando elipsometria, observou-se que os polifenis determinam uma alterao nas caractersticas da pelcula protica e leva a modificao no mecanismo de interao desta pelcula com novas camadas de protenas. Este mecanismo explica a formao de manchas sobre a

superfcie dentria quando da presena de polifenis.

3. PROPOSIO.

54

 proposio deste trabalho avaliar in vitro a atividade dos extratos de Caesalpinia ferrea Mart. (Juc), Cinnamomun cssia B. (Canela), Malva sylvestris L. (Malva), Punica granatum L (Rom), Rosmarinus officinalis L. (Alecrim), Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macass), Sysygium sobre

aromaticum L (Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo)

microrganismos da cavidade bucal produtores de compostos sulfurados volteis (CSV) utilizando-se diferentes testes de sensibilidade microbiana.

4. MATERIAIS E MTODOS.

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Trata-se de um estudo experimental realizado em 2 etapas sendo a 1 etapa do estudo sobre a atividade antimicrobiana in vitro e a 2 em um modelo ex vivo com sedimento salivar.

4.1. PREPARAO DO EXTRATO DAS PLANTAS.

Extratos de Cinnamomun cassia B (Canela ), Malva sylvestris L (Malva), Punica granatum L (Rom), Rosmarinus officinalis L (Alecrim),

Aeolanthus suaveolens (Als.)Spreng.L (Macassa , Sysygium aromaticum L (Cravo) e Tamarindus indica L (Tamarindo) foram preparados no

departamento de Cincias Farmacuticas da Universidade Federal de Pernambuco em Recife (PE) aps a devida identificao botnica no

Laboratrio de Toxicologia da mesma instituio. O Extrato de Caesalpinia ferrea Mart. (Juc), foi preparado Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas. na

O preparo do

extrato foi realizado utilizando-se a mesma metodologia utilizada para os demais extratos.

4. 1 .1. EXTRAO DOS MARCADORES QUMICOS.

Aps lavagem e secagem em estufa a 33 C por uma semana para eliminao de umidade e estabilizao do contedo enzimtico o material foi triturado a p em moinho eltrico seguindo-se a extrao dos princpios ativos.

56

Foi empregado o mtodo de lixiviao ou percolao em fluxo contnuo temperatura ambiente. Neste processo existe a renovao constante da soluo extratora durante um perodo de 24 horas. Decorrido este tempo ocorre ento a total extrao dos marcadores ou princpios ativos. Para o processo so utilizados 8 litros de soluo hidroalcolica para cada quilo de matria prima pulverizada, visando o completo esgotamento da extrao. Recuperou-se aproximadamente 6.600 ml de cada extrato que aps filtrao para retirada de impurezas, foram acondicionados em fracos mbar e estocados em cmara fria. Especificamente no caso do Tamarindo (Tamarindus indica L. ) o processo de extrao se deu por macerao fracionada devido ao teor de acar e pectina, evitando-se assim a produo de um extrato

excessivamente turvo. Na primeira macerao a parte da fruta utilizada foi lavada e cortada em pequenos pedaos, colocada em um balo de fundo chato e recoberta pela soluo extrativa (soluo hidroalcolica a 80%). Aps uma semana realizou-se uma filtrao com a obteno do primeiro filtrado chamado de extrato A, que foi acondicionado em refrigerao. O material colhido pelo aparato filtrante foi recolocado em um balo de fundo chato e recoberto com uma nova soluo extrativa, na mesma concentrao. Aps uma semana realizou-se filtrao para obteno do extrato B, que foi acondicionado em refrigerao. Repetiu-se o processo para obteno do extrato C, aps o qual se deu o completo esgotamento do marco. Na etapa final os extratos A, B e C foram misturados e concentrados em rotavaporizao.

57

4.1. 2. CONCENTRAO DA SOLUO EXTRATIVA.

Aps

extrao

dos

marcadores

qumicos

foi

realizada

concentrao em nvel de extrato fluido 1:1 ( p/v). Este processo foi realizado em aparelho rota-vapor (Modelo Ika Werk) a uma temperatura constante de 40C. O quadro 2 mostra o detalhamento da parte da planta utilizada,

substncia extratora e concentrao final do extrato obtido.

PLANTA ALECRIN

NOME CIENTFICO

PARTE UTILIZADA Folha Casca Pednculo floral Vargem completa Folha Folha, caule e sumidade florais Fruto sem semente Casca do fruto

SUBSTNCIA EXTRATORA Etanol 70% Etanol 70% Etanol 70% Metanol 80% Etanol 80% Etanol 80% Etanol 70% Etanol 80%

CONCENTRAO FINAL 1000 mg/ml 321 mg/ml 396 mg/ml 500 mg/ml 1000 m g/ml 125 mg/ml 411 mg/ml 540 mg/ml

Rosmarinus officinalis L. CANELA Cinnamomum cassia Breyn. CRAVO Syzygium aromaticum L. JUC Caesalpinia ferrea Mart MALVA Malva sylvestris L. MACASS Aeolanthus suaveolens (Als.)Spreng. TAMARINDO Tamarindus indica L. ROM Punica granatum L.

Quadro 2. Descrio do material fitoterpico utilizado: nome popular, nome cientfico, parte utilizada, substncia extratora e concentrao final do extrato obtido.

4.2. DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.

58

Os ensaios antimicrobianos foram realizados no Laboratrio de Anaerbios, Disciplina de Endodontia da FOP- Unicamp, Piracicaba, SP. Foi testada a atividade antimicrobiana dos extratos sobre cepas selvagens previamente cultivadas. Foram utilizadas cepas de: Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e

Prevotella intermedia. Como controle positivo foi utilizado o gluconato de clorexidina 2% (lquido).

4.2.1. TESTE DA DIFUSO EM AGAR.

Foi utilizado o mtodo de difuso em meio slido. 100 L de meio FAB (Fastidious Anaerobe Broth - LAB M - Lancashire UK) contendo inculo correspondente ao padro 1 da escala de McFarland ajustado por espectrofotmetro (Mod. 432, FEMTO, Brasil- comprimento de onda de 800 nm) foram semeados em placas contendo FAA (Fastidious Anaerobe Agar LAB M - Lancashire UK) enriquecido com sangue de carneiro ( Newprov, Brasil). A escolha do padro 1 de McFarland para o inoculo est de acordo com as caractersticas de crescimento das bactrias estudadas. de ao (8,0 X 10,0 mm Cilindros

com dimetro interno de 6,0 mm ) foram Utilizados nas

colocados sobre os meios FAA previamente semeados.

concentraes mostradas no quadro 2, 50 L dos extratos testados e o antimicrobiano (gluconato de clorexidia 2%) foram colocados no interior dos cilindros. As placas foram ento incubadas em cmara de anaerobiose (Don

59

Whitley Scientific, Bradford, UK ) numa atmosfera contendo 5-10% H 2, 10 % de CO2 e 80-85% de N2 por 72 horas. Zonas de inibio foram medidas aps o perodo de incubao. Foi considerada como zona de inibio a menor distncia (mm) medida da margem externa do cilindro at o ponto inicial do crescimento microbiano. Foram feitas triplicatas para cada substncia testada sobre os diferentes microrganismos. Aps o perodo de incubao e leitura das zonas de inibio foram retirados os cilindros e feitas coletas de material sobre o meio slido que esteve em contato direto com a substncia testada. Este material foi semeado em placas com FAA e incubado nas mesmas condies

anteriormente descritas. Aps o perodo de incubao foi feita a leitura para verificar a inibio por contato direto, representada pela ausncia de

crescimento bacteriano.

4.2.2. DETERMINAO DA CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) E EM MEIO LQUIDO.

A concentrao inibitria mnima (CIM) foi estabelecida em meio lquido usando-se o mtodo da microdiluio. Diluies das substncias

testadas foram preparadas de forma que para os extratos foram utilizadas concentraes entre 50 e 400 g/mL, com um total de 20 diferentes concentraes. Para a clorexidina foram utilizadas concentraes entre com um total de 10 diferentes concentraes. Os

0,0115 e 5,9 g/mL,

60

inculos foram preparados e ajustados por espectrofotmetro (800 nm) correspondendo ao padro 1 da escala de McFarland. Foram dispensados na microplaca controles contendo: apenas o meio lquido (FAB); o meio lquido (FAB) mais o extrato; mais o inoculo. Aps incubao em cmara de anaerobiose por 72 horas foi realizada a leitura utilizando-se colorao com resazurina (Sigma, USA) na concentrao de 0,02%. Foram adicionados 30L da soluo de resazurina em cada poo da microplaca contendo o inculo e a substncia testada, como tambm nos poos contendo os controles. Foi interpretada como CIM a menor concentrao correspondente ao poo teste que manteve a colorao azul da resazurina. A alterao da colorao para a cor rosa violcea ou rosa indicou a reduo da resazurina implicando na presena de e o meio lquido (FAB)

crescimento bacteriano. A leitura foi realizada aps 20 minutos da aplicao do corante. As diferentes concentraes foram distribudas nas microplacas em duplicata de forma que aps a leitura da CIM, uma alquota de 20L foi retirada e semeada em placas com meio FAA. A alquota foi retirada do poo correspondente a leitura da CIM, e mais trs poos consecutivos com concentrao maior dos extratos. Aps a incubao foi feita a leitura quanto presena ou no do crescimento bacteriano.

61

Esquema 1. Esquema ilustrativo dos procedimentos para a CIM por microdiluio. Cultura em placa Meio lquido
ESPECTROFOTMETRO

Grau 1 de McFarland

FAB

De acordo com a concentrao do extrato preparada a soluo me (SM) para ser colocada na microplaca. Tambm preparada a clorexidina. Extrato Clorexidina

Preparo da placa.
1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Preparada a SM esta distribuda de forma que se obtenha as diferentes concentraes que variaram de 400g/mL at 50g/mL, ocupando os poos A 1 a 12 e B 1 a 8. Linhas C e D representam a duplicata. Na linha F colocada a clorexidina. Nos mesmos poos so acrescentados o inculo e o meio FAB. Controles colocados na linha H.

PLACAS SO INCUBADAS EM ANAEROBIOSE

Resazurina 0,02%

10

11

12

A B C D E F G H

Leitura da placa aps 20min da aplicao da resazurina. ltimo poo azul (esquerda para direita) representa CIM. Poo com cor rosa-violceo ou rosa indica atividade bacteriana com reduo do corante. Linha H controles. Linhas C e D usada para repique em meio slido. 62

4.3. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE POLIFENIS DOS EXTRATOS.

A quantificao de polifenis totais dos extratos foi realizada pelo mtodo Azul da Prssia segundo modificao proposta por Graham (1992). Uma Soluo Blank foi preparada com 3 mL de gua deionizada adicionando-se 100 L do mesmo solvente utilizado para o preparo do extrato. Aps agitao se acrescentou 1 mL da Soluo de Ferrocianido de Potssio (Soluo 2) e 1 mL de Cloreto Frrico (Soluo 1). Aps 15 minutos se acrescentou 5mL da soluo estabilizadora (30 mL de gua destilada, 10 mL de H3PO4 e 10mL de goma arbica a 1%). Subseqente a preparao da Soluo Blank, preparou-se uma Soluo Padro com 3 mL de dua deionizada adicionando-se 100L de soluo de cido glico a 0,01M seguindo-se os demais procedimentos para a preparao da soluo Blank. Em seguida, as amostras foram preparadas, utilizando-se 3 mL de gua deionizada acrescidos de 100L do extrato teste em diluio apropriada, seguindo com a seqncia de adio dos reagentes usados na preparao das solues Blank e Pado. Aps a preparao as solues Blank, padro e amostras foram levadas para leitura em Espectrofotmetro (Beckman DU640, USA) em luz visvel, em comprimento de onda de 700nm.

63

4.4.

DETERMINAO

DA

CAPACIDADE

INIBITRIA

DOS

EXTRATOS SOBRE A FORMAO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLTEIS (CSV) E OUTROS ODORES.

A concentrao de CSV foi medida em tubos contendo cultura total de saliva incubada aps a exposio aos dois extratos que apresentaram a maior concentrao de polifenis. Cada extrato foi usado separadamente. Cultura total de saliva no exposta a nenhum dos extratos foi utilizada como controle. O gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard ) foi usado como controle positivo. A concentrao de 0,12% a concentrao usual presente nos enxaguantes bucais. O estudo foi desenvolvido com amostras em duplicata.

4.4.1. PREPARAO DOS SEDIMENTOS. O mtodo descrito por Kleinberg e Codipilly (1999) foi utilizado para a preparao do sistema de sedimento salivar: saliva total foi coletada de dois indivduos que se mantiveram sem realizao de higiene bucal por 24 horas e com perodo de jejum de 12 horas antecedendo a coleta. A saliva foi coletada em tubos de ensaio tipo Falcon (15 mL), pelo mtodo estimulado, utilizando-se hiperbolide. Aps coleta, as amostras de saliva foram centrifugadas em 3500 rpm (centrfuga QUIMIS) por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e estocado em freezer a 4 C. Um volume de 41,75 l de sedimento foi colocado em 10 tubos Falcon. O sedimento presente em cada tubo foi lavado com um volume de 1 mL de gua de deionizada por 3 vezes por 30 segundos. Cada ciclo de

64

lavagem foi

realizado acrescentando-se 1ml de gua deionizada ao

sedimento presente em cada tubo, que foi agitado e aps 30 segundos foi feita a centrifugao por 1 minuto. O excesso de gua foi retirado,

permanecendo o sedimento em cada tubo. Foram testadas 3 diferentes concentraes dos extratos,

correspondendo a diluies 1:1, 1:2, e 1:4. As amostras-teste foram exposta (por 30 segundos) a 1 mL do extrato seguindo-se centrifugao por mais 1 minuto. Aps exposio foi realizada outra sesso de lavagem por mais 30 segundos. Os tubos contendo o controle positivo foi exposto a 1ml da

soluo de clorexidina a 0,12% e os tubos contendo o controle foram expostos a gua deionizada, por 1 minuto. Em seguida, para simular o

cllearence pela saliva, todas as amostras de sedimento foram centrifugadas, lavadas com 1ml de gua deionizada e mais uma vez centrifugadas, retirando-se a gua de forma que cada tubo permaneceu com o sedimento. Em cada um dos tubos Falcon contendo o sedimento, foi preparado o SSS sendo formado por 250 l de sedimento salivar a 16,7% (v/v) , 250l de sobrenadante a 33,3% (v/v) e 250 ul de L-cistena (6 mM). As amostras controle e teste foram incubadas por 24 horas a 37 C. As leituras organolpticas e por Halimeter foram realizadas nos seguintes momentos: aps 1 , 2, 4 e 24 horas de incubao.

65

Fotografia 1. Saliva distribuda em tubos antes da centrifugao.

Fotografia 2. Saliva distribuda em tubos aps a centrifugao. Detalhe a esquerda.

66

4.4.2. COLETA DOS DADOS

Foi realizado teste organolptico para verificao de mau odor, utilizando-se uma escala de 0 a 4, com o mtodo da verificao ao basto de vidro esterilizados , onde 0 representa a ausncia de odor e 4 o odor mais intenso. Imediatamente aps a abertura de cada tubo, um basto de vidro com 0,5 cm de dimetro e 30 cm de comprimento foi introduzido no tubo Falcon contendo a cultura salivar tendo sua extremidade mergulhada no sis tema de sedimento e realizando-se movimentos circulares de forma a fazer a agitao do contedo do tubo. Em seguida o basto foi posicionado horizontalmente a 10 cm das narinas do examinador, sendo estabelecido o valor correspondente da escala de acordo com a intensidade do odor. Para a medio da concentrao dos CSV foi utilizado o aparelho Halimeter (Interscan Corporation), um monitor de CSV. Para tal foi adaptada uma tampa para o tubo Falcon, contendo duas perfuraes. Em uma das perfuraes foi instalado o canudo que foi acoplado ao Halimeter, que no momento da medida foi ajustado de forma que a extremidade fosse posicionada a uma distncia de 5 mm da superfcie do sedimento salivar. Na outra perfurao foi acoplado um segmento de canudo plstico com o mesmo dimetro do que foi acoplado ao Halimeter , de forma a permitir a entrada de ar, compensando o volume de ar retirado pelo aparelho. Essas medidas foram realizadas imediatamente aps a medida organolptica do contedo de cada tubo. Medidas de pH foram realizadas com eletrodo (Orion, USA) acoplado a um potencimetro 710A (Orion, USA). Calibraes foram realizadas com 67

padres de pH 4 e 7 e slope de 95%. As leituras foram realizadas aps a ltima leitura de CSV.

Fotografia 3. Tubos Falcon. A esquerda tubo para incubao. A direita tubo com tampa e canudos acoplados para medida com Halimeter. Detalhe acima.

Fografia 4. Halimeter ( Interscan Co. USA).

68

4.5. ANLISE ESTATSTICA. Os dados obtidos nas diferentes etapas deste estudo foram tabulados em programa Excel (verso x) e SPSS (verso 11.0). Nestes programas foram calculados mdias, desvios padro e valores em percentual quando apropriado. Os resultados so apresentados em tabelas simples e quadros.

69

5. RESULTADOS.
5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA. A tabela 1 mostra o resultado do teste de difuso em agar dos diferentes extratos testados. Na mesma tabela pode-se verificar a presena ou ausncia de crescimento bacteriano do material retirado da rea de contato direto com a substncia testada. Tabela 1. Mdia da zona de inibio (mm) e ao por contato direto de extratos hidroalcolicos e clorexidina sobre microrganismos da cavidade bucal.
MICRORGANISMO

EXTRATO / DROGA ALECRIM CANELA CRAVO MACASS MALVA JUC ROM TAMARINDO CLOREX. LIQ. 2%

Peptostreptococcus micros 1,6 ( - ) * (-) 3 (-) * (-) * (+) 6,3 ( - ) 10,3 ( - ) 2,6 ( - ) 9,3 ( - )

Fusobacterium nucleatum * (-) * (-) * (+) * (+) * (+) * (+) 5 (+) 2 (+) 8,6 ( - )

Porphyromonas gingivalis 3 (-) * (+) * (+) * (-) * (+) * (+) 3 (-) * (-) 8 (-)

Prevotella intermedia * (-) * (-) * (-) * (-) * (+) * (-) 3,6 ( - ) * (-) 9,6 ( -)

* Sem inibio. (-) Ausncia de crescimento bacteriano aps inoculao em meio slido, de material retirado da rea de contato direto do extrato/droga com microrganismo. (+) Presena de crescimento bacteriano aps inoculao em meio slido, de material retirado da rea de contato direto do extrato/droga com microrganismo.

A maior mdia de inibio observada entre os extratos foi a da rom sobre o Peptostreptococcus micros. A rom foi o nico extrato que produziu zona de inibio sobre todos os microrganismos testados, inclusive com mdia superior a da clorexidina para o Peptostreptococcus micros. O extrato

70

de juc mostrou um halo de inibio significativa sobre o Peptostreptococcus micros, contudo, este extrato no mostrou zona de inibio sobre os demais microrganismos testados Os extratos de canela, macass e malva no produziram zona de inibio sobre nenhum dos microrganismos testados. O extrato de cravo produziu zona de inibio apenas sobre o

Peptostreptococcus micros. O alecrim por sua vez, mostrou zona de inibio sobre Peptostrptococcus micros e Porphyromonas gingivalis. A clorexidina mostrou zona de inibio sobre todos os microrganismos testados.

4 Fotografia 5. MIC por difuso em agar de extratos fitoterpicos sobre Fusobacterium nucleatum. 1: Malva ; 2: Juc; 3: Macass; 4: Tamarindo; Central: Rom.

Na tabela 1 vemos ainda que o Peptostreptococcus micros colhido da zona de contato direto com os extratos de alecrim, canela, cravo, macass, juc , rom e tamarindo, no apresentou crescimento quando semeado em meio slido (FAA). O extrato de malva ,por sua vez , no impediu o

crescimento desta bactria quando retirada da rea de contato direto e semeada em meio slido. A bactria Fusobacterium nucleatum no

71

apresentou crescimento quando retirada da rea de contato direto com os extratos de alecrim e canela. Todavia, mostrou crescimento quando

semeada a partir das reas de contato direto com os extratos de cravo, macass, malva, juc, rom e tamarindo. Na fotografia 2 podemos observar a formao de halos de inibio no teste de difuso em agar. Pode ser visto o resultado dos extratos de malva, juc macass tamarindo e rom numa placa com crescimento do Fusobacterium nucleatum. Os resultados do teste de CIM por microdiluio podem ser vistos na tabela 2 mostrada a seguir. concentrao inibitria Cada valor expresso em g/mL mostra a dos diversos extratos sobre os

mnima

microrganismos utilizados, identificado pela colorao com a resazurina. Os resultados da clorexidina tambm podem ser vizsualizados. Todos os extratos estudados mostraram valores de CIM presentes nas concentraes utilizadas, sobre no mnimo dois dos microrganismos estudados. Contudo, nenhum dos extratos apresentou CIM sobre todos os quatro microrganismos testados. O extrato da rom foi o nico extrato a no apresentar valor da CIM sobre o Peptostreptococcus micros. Contudo, foi o nico extrato a apresentar valor de CIM (160g/mL) sobre a Prevotella intermedia concentraes estudadas. Do ponto de vista da sensibilidade dos microrganismos frente aos extratos testados, o Peptostreptococcus micros foi o microrganismo a apresentar o maior nmero de valores de CIM na concentrao abaixo de 50 g/mL para os diversos estratos utilizados. Por outro lado, a Prevotella para as

72

intermedia apresentou o maior nmero de valores > 400 g/mL para a CIM frente aos extratos estudados. Tabela 2. Valores da Concentrao Inibitria Mnima * por microdiluio de extratos hidroalcolicos sobre microganismos da cavidade bucal. EXTRATO / DROGA ALECRIM CANELA CRAVO MACASS MALVA JUC ROM TAMARINDO CLOREX LIQ. 2%
Peptostreptococcus micros MICRORGANISMO Fusobacterium nucleatum Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia

50 50 50 50 400 50 > 400 190 0,1844

> 400 > 400 400 > 400 > 400 400 400 > 400 0,3688

190 190 400 50 50 120 170 250 0,3688

> 400 > 400 > 400 > 400 > 400 > 400 160 > 400 0,1844

* Valores da CIM expressos em g/mL.

Fotografia 6 . Detalhe de microplaca. MIC do Tamarindo sobre P. Gingivalis.

73

Tabela 3. Crescimento de microrganismos em meio slido aps a determinao da Concentrao Inibitria Mnima por microdiluio.
MICRORGANISMO

Extrato/Droga Alecrim Canela Cravo Macass Malva Juc Rom Tamarindo

Clorexidina

Peptostreptococcus micros 80 80 + 80 + 80 80 + 300 +

1,475

Fusobacterium nucleatum CIM >400 >400 > 400 >400 >400 400 400 + >400
2,95 1,475 0,7375 0,3688

Porphyromonas gingivalis 100 90 300 250 80 80 150 200 + 400 +

2,95

Prevotella intermedia CIM >400 >400 >400 >400 >400 >400 190 +
1,475

60 70 + 70 + 70 70 + 250 +
0,7375

70 60 + 60 + 60 60 + 200 +
0,3688

CIM 50 50 + 50 + 50 400 50 + >400 190 +

0,1844

80 200 60 60 130 180 + 300 +

0,7375

70 70 140 190 + 350 +

1,475

CIM 70 190 400 50 50 120 + 170 + 250 +

0,3688

180 +
0,7375

170 +
0,3688

160 + >400
0,1844

CIM ( Concentrao inibitria mnima- g/mL); ( + ) Crescimento bacteriano; ( - ) Ausncia de crescimento bacteriano.

75

A tabela 3 apresentada na pgina anterior, mostra o resultado da presena ou ausncia de crescimento bacteriano sob a ao dos diversos

extratos, das alquotas retiradas dos poos correspondentes aos valores da CIM e de mais trs poos consecutivos representando concentraes elevadas. O Peptostreptococcus micros apresentou crescimento em meio slido aps exposio aos extratos de canela, cravo, juc e tamarindo para os valores da CIM e concentraes mais elevadas. Quando exposto aos extratos de mais

alecrim e malva, este microrganismo no apresentou crescimento em meio slido para as concentraes da CIM. Especificamente no caso do extrato de alecrim tambmm no houve crescimento bacteriano para concentraes acima da CIM. Podemos observar que quanto ao Fusobacterium nucleatum no houve crescimento bacteriano aps o repique em meio slido quando da exposio ao extrato de juc. O repique realizado quando este microrganismo foi exposto ao estrato da rom apresentou crescimento. Para os demais extratos a CIM

apresentou valor >400 g/mL e portanto no foi realizado o repique em meio slido. O microrganismo Porphyromonas gingivalis no apresentou crescimento em meio slido para os valores da CIM ou concentraes mais elevadas quando exposto aos extratos de alecrim, canela, cravo, macass ou malva. Contudo, apresentou crescimento para a CIM e valores mais elevados, quando exposto aos extratos de rom e tamarindo. Quanto exposio ao extrato de juc, este microrganismo apresentou crescimento quando repicado aps a

exposio ao valor da CIM, contudo, no mostrou crescimento para concentraes mais elevadas do extrato. O microrganismo Prevotella intermedia foi semeado em meio slido

somente aps a exposio ao extrato de rom mostrando crescimento para o valor da CIM e valores mais elevados. Quando exposto aos demais extratos apresentou valores da CIM >400 g/mL , no sendo realizado o repique em meio slido. Para todos os microrganismos estudados no foi observado crescimento bacteriano quando da exposio clorexidina, tanto para a CIM quanto para as concentraes mais elevadas.

5.2. CONCENTRAO DE POLIFENIS DOS EXTRATOS.

Fotografia 7. Foto ilustrativa de solues preparadas para a quantificao de polifenis. Da esquerda para a direita: Blank, Padro, Extrato de Malva, Extrato de Rom.

77

Tabela 4. Concentrao de polifenis de extratos hidroalcolicos obtidas por espectofotometria. Planta Diluio Mdia cidido Mg de fenis Concentrao Polifenis em quivalente da soluo de da do extrato glico de cido glico trabalho Leitura por mL de (mg/mL) (%) ug/mL
extrato

Padro Etanol 80% Juc Rom Canela Malva Macassa Padro Etanol 70% Alecrin Tamarindo

1,175 01:32 01:64 01:08 01:04 EP 2,5954 1,8382 1,6223 0,3773 0,5911 1,175 01:04 01:04 1,3932 0,4404

190,00 568,73 329,73 290,92 67,65 143,07 36,39 21,10 04,65 0,54 0,14 500 540 321 1000 125 7,3 3,9 1,5 0,1 0,1

225,28 71,21

1,80 0,56

1000 411

1,3 0,1

Comprimento de onda de 700 nm. Mtodo azul da Prssia (GRAHAM, 1992).

A tabela 4 mostra a concentrao de polifenis dos extratos utilizados neste trabalho. O extrato de juc apresentou a maior concentrao seguindo do estrato de rom.

5.3. AO DOS EXTRATOS DE JUC E ROM NA FORMAO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLTIS E OUTORS ODORES.

As tabelas apresentadas a seguir mostram os resultados da ao dos extratos de juc e rom na formao de CVS e outros odores utilizando-se o sintema de sedimento salivar, tomando-se as medidas organolpticas e com o Halimeter. So apresentadas tambm as tabelas com o resultado das

78

medidas de pH realizadas ao final do perodo de incubao e leituras de concentrao dos odores presentes no sistema de sedimento salivar.

Tabela 5. Efeito do extrato de Juc na formao de compostos sulfurados volteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar. D1 D2 D3 CONT. POSITIVO ORG HAL ORG HAL ORG HAL ORG HAL 1h 0 30 0 30 0 33 0 48 2h 0 37 0 34 0 37 0 50 4h 0 38 0 39 0 46 0 50 24h 0 27 0 40 0 70 0 33 ORG : Teste organolptico; HAL: Leitura com Halimeter CONTROLE ORG HAL 1 900 2 911 3 1250 4 1500

Tabela 6. Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ao do extrato de Juc aps 24 h de incubao. AMOSTRAS

pH
6.003 6.005 4.621 4.791 3.047 4.420 7.321 6.800 6.197 6.029

D1 A D1 - B D2 - A D2 - B D3 A D3 B CONT. POSIT. - A CONT. POSIT. B CONTROLE A CONTROLE - B

Tabela 7. Efeito do extrato de Rom na formao de compostos sulfurados volteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar.
D1 ORG HAL 0 30 0 0 0 30 43 35 ORG 1 1200 2 1 2 D2 HAL 800 950 560 ORG 1 1200 2 1000 1 1000 3 D3 HAL CONT. POSITIVO ORG HAL 0 40 0 0 0 42 50 33 CONTROLE ORG HAL 1 1500 2 3 4 1320 1400 1500

1h 2h 4h 24h

79

1400

ORG : Teste organolptico; HAL: Leitura com Halimeter Tabela 8 .Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ao do extrato de Rom aps 24 h de incubao. AMOSTRAS

pH
5.713 7.100 6.320 6.787 5.638 5.249 6.605 5.640 5.906 5.974

D1 A D1 - B D2 - A D2 - B D3 A D3 B CONT. POSIT. - A CONT. POSIT. B CONTROLE A CONTROLE - B

80

6. DISCUSSO.
A descoberta da participao bacteriana na formao dos odores bucais trouxe uma grande contribuio ao estudo da halitose. Os primeiros passos foram dados com o estabelecimento da cavidade bucal como fonte primria dos odores do hlito na maioria das situaes clnicas encontradas. Primeiro com os estudos de cultura de saliva total e depois de culturas com microrganismos isolados, diversas bactrias foram identificadas como produtoras de substncias de odor desagradvel e como tal, responsveis pela formao do mau hlito (LAW, BERG e FOSDICK , 1943; BERG e FOSDICK, 1946; CLEGG e RAE, 1956; PERSSON, CLAESSON e CARLSSON , 1989; KLEINBERG e CODIPILLY, 1999; KATO et al , 2005). Neste estudo se utilizou bactrias reconhecidamente relacionadas formao de compostos sulfurados volteis (CSV): Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia. Sabe-se que existe uma maior contribuio das bactrias Gram-negativas (LOESCHE e KAZOR, 2000; MORITA e WANG, 2001). Embora a bactria Peptostreptococcus micros seja Gram-positiva, sua capacidade de produzir CSV a partir de aminocidos (L-glutadiona e L-cistena) foi comprovada por Carlsson, Larsen e Edlund (1993). Esta constatao demonstrou que vrias espcies bacterianas da cavidade bucal participam na formao de CSV e apontou para a importncia de se pesquisar a ao de antimicrobianos tanto sobre bactrias Gram-negativas quanto Gram-positivas.

81

Vale ressaltar que o nmero total de espcies envolvidas na produo de CSV ou outras substncias que participam na formao da halitose ainda desconhecido. O trabalho de pesquisa de Persson et al (1990) demonstrou a existncia de bactrias bucais at ento no classificadas que apresentaram a capacidade de produzir CSV. Uma comparao direta entre os resultados encontrados neste estudo com os resultados de outras pesquisas no poder ser realizado uma vez que no conseguimos resgatar na literatura publicada e indexada, estudos que utilizaram os mesmos extratos fitoterpicos sobre as bactrias aqui estudadas. Ainda que estudos com as mesmas espcies vegetais e bactrias sejam citados, devemos considerar que extratos de plantas medicinais apresentam uma variao na quantidade de seus constituintes. Esta variao pode estar relacionada com os tipos de mtodos de extrao e substncias utilizadas (RABE e STADEN, 1997; NOSTRO et al, 2000) com a parte da planta utilizada, variaes sazonais durante o crescimento e coleta e ainda provocados pelo solo e ambiente (REICHLING e SALLER, 1998; ARRIGONI-BLANK et al, 2002). Especificamente no nordeste do Brasil, Monteiro et al (2006) detectaram variaes na concentrao de taninos durante as estaes chuvosas e secas em amostras de aroeira do serto (Myracroduon urundueva) e angico (Anadenathera colubrina). Na Tabela 1 observa-se as variaes ao teste de dIfuso quanto a atividade dos extratos sobre as bactrias utilizadas neste estudo. Quando da utilizao de discos impregnados com agentes antimicrobianos, sabe-se que ao contato do disco com o meio de cultura, a gua absorvida pelo disco e ocorre a difuso do agente antimicrobiano. medida que aumenta a distncia a partir

82

da borda do disco, diminui a concentrao do agente antimicrobiano (WINN et al, 2006). Este conceito extrapolado para o uso de extratos fitoterpicos aplicados diretamente sobre o meio slido. Todavia, no devemos excluir a possibilidade de interaes fsico-qumicas entre o meio de cultura e o extrato que possam, por exemplo, reduzir a capacidade de difuso dos constituintes do extrato. Alteraes do pH tanto do extrato como do meio podem tambm

ocorrer. A influencia do pH do meio sobre a atividade antimicrobiana um fator considerado relevante nos testes de susceptibilidade antimicrobiana (NCCLS, 2003). Os resultados na tabela 1 demonstram que a ausncia de formao de halo de inibio no exclui a possibilidade de atividade antimicrobiana. Isto se considerarmos a ao por contato direto do extrato avaliada pelo cultivo de material retirado da rea sobre o meio de cultura onde foi depositado o extrato. Por exemplo, no houve crescimento da Prevotella intermedia quando do cultivo de amostras retiradas da rea de contato dos extratos de alecrim, canela, cravo e macass, mesmo no havendo a formao de zona de inibio ao teste de difuso. Por outro lado, mesmo com uma zona mdia de inibio de 5 mm produzida pela rom, houve crescimento de Fusobacterium nucleatum quando o material da rea onde foi depositado o extrato sobre o meio de cultura foi cultivado. Pode-se inferir que estas variaes se devam a diferenas de atividade bactericida ou bacteriosttica dos diferentes extratos; ou diferenas quanto a possveis interaes entre o extrato e o meio de cultura, como anteriormente mencionadas. Para os testes de sensibilidade antimicrobiana com substncias alopticas so estabelecidos os padres de concentrao que devem ser

83

internacionalmente utilizados pelos laboratrios de anlises clnicas (CLSI, 2005). Em nosso estudo uma faixa de concentrao foi arbitrada para a

realizao do teste de microdiluio em caldo. O teste da microdiluio em caldo tem como vantagem a necessidade de pequenas quantidades de reagentes podendo-se avaliar a atividade de vrios agentes sobre diversos microrganismos. A desvantagem est no tempo envolvido quando no se utiliza mtodos automatizados (WNN et al, 2006). Os resultados da microdiluio encontrados neste estudo mostram a dinmica da interao entre o agente antimicrobiano e as bactrias testadas. Podemos ver, por exemplo, que o extrato de canela no produziu zona de inibio sobre o Peptostreptococcus micros ao teste de difuso em agar. Contudo ao teste de microdiluio este extrato apresentou concentrao inibitria mnima com valor abaixo de 50 g/ml para esta mesma bactria. Novamente, devemos considerar a possibilidade de que o teste em meio lquido permita uma interao entre os constituintes do extrato e as bactrias que seja diferente daquela que ocorre no teste em meio slido. Podemos ento considerar que a ausncia de efeito antimicrobiano de determinado extrato ao teste de difuso em agar deve ser interpretado com cautela uma vez que este mesmo extrato pode apresentar atividade antimicrobiana ao teste de microdiluio. Neste estudo utilizamos a resazurina como revelador do crescimento bacteriano. Este corante apresenta a vantagem de uma fcil interpretao e j foi utilizado em testes de atividade antimicrobiana com leos essenciais e extratos hidroalcolicos (MANN e MARKHAM, 1998; UMEH, OLUMA e IGOLI, 2005). A utilizao da resazurina nos controles quando adicionada ao meio de

84

cultura e ao meio de cultura contendo o extrato teste nos permite afirmar que a presena do extrato no interferiu na leitura utilizando-se o corante. As diferentes coloraes observadas nos poos aps a adio da resazurina de fato comprovam a presena ou ausncia de atividade microbiana. O resultado do subcultivo de alquotas retiradas dos valores de CIM apresentados na tabela 3 mostra a diversidade da atividade dos extratos testados sobre os diferentes microrganismos. O crescimento de

microrganismos no subcultivo em meio slido indica uma ao bacteriosttica enquanto a ausncia de crescimento indica uma ao bactericida. A importncia do efeito bactericida ou bacteriosttico ainda motivo de discusso no tratamento das doenas infecciosas de um modo geral. O rgo atingido, imunidade do hospedeiro, os nveis sricos da substncia, entre outros fatores, podem ser critrios para a escolha do antibitico (FINBERG et al, 2004). Para o uso de colutrios, a importncia da ao bactericida ou bacteriosttica no conclusiva. Os testes com agentes antimicrobianos so em sua maioria voltados para o estabelecimento da CIM em microrganismos em sua forma planctnica. Em nossa opinio, estes testes tm a sua

importncia como um passo inicial na avaliao do potencial antimicrobiano de novas substncias. Existe contudo a necessidade de que sejam desenvolvidos modelos experimentais que se aproximem ao mximo das condies encontradas na cavidade bucal. Pratten, Barnett e Wilson (1998) comprovaram o j bem conhecido efeito refratrio dos biofilmes bucais aos agentes antimicrobianos. O uso de clorexidina a 0,2% sobre um modelo de biofilme durante 1 minuto no apresentou uma significativa reduo no nmeros de bactrias. Uma reduo

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substancial foi alcanada somente quando o biofilme foi exposto a clorexidina por 60 minutos. Isto demonstra a importncia da substantividade do agente antimicrobiano. A realizao do teste com o sistema de sedimento salivar mostrou a atividade dos extratos de rom e juc num ambiente que se assemelha aquele encontrado na cavidade bucal (KLEINBERG e CODIPILLY, 1999). A consistncia dos extratos de rom e juc mostrou-se imprpria para o uso no sistema de sedimento salivar e por isso foram utilizadas diluies a 50% (D1), 25% (D2) e 12,5% (D3). Com a exposio do sedimento salivar aos extratos de rom e juc observou-se uma menor formao de CSV. Neste estudo, os sedimentos foram expostos aos extratos em diferentes concentraes e em seguida lavados para simular a remoo dos extratos que ocorreria na cavidade bucal com a presena da saliva. Em seguida cistena foi adicionada aumentando a disponibilidade de substrato para o metabolismo bacteriano. Podemos ento inferir que a menor formao de CSV observada se deu pela ao antibacteriana dos extratos. Neste contexto, no devemos deixar de considerar a importncia do pH no sistema de sedimento. Um pH cido leva a inibio na formao de CSV. Segundo Kleinberg e Codopilly (1999) as concentraes de CSV caem acentuadamente com valores de pH em torno de 4,0. Os resultados da leitura de pH na tabela 6 mostra valores prximos de 4,0 para as diluies D2 e D3 do estrato de juc, indicando uma possvel influncia quanto a formao de CSV e leitura ao teste organolptico.

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Por outro lado os valore de pH do juc para a diluio D1 um valor no leva a reduo de formao de CSV podendo-se ento atribuir a menor formao de odores ao efeito inibitrio do extrato sobre as bactrias.

Os valores de leitura organolptica obtidos tambm mostram a capacidade de inibio da formao de odores no sistema de sedimento quando da exposio aos extratos de rom e juc, quando comparado ao controle. Ao teste organolptico so percebidos pelo examinador no somente os odores representados por CSV, mas tambm outros odores de outras substncias que esto presentes nos odores bucais (GOLDBERG et al, 1994; KLEIMBERG e CODIPILLY, 1999; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG, 2004). A reduo do pH pode ocorrer como resultado direto da presena dos extratos ou por alteraes decorrentes da ao sobre diferentes bactrias. Processos fermentativos relacionados presena de glicoce no sistema de sedimento salivar permite um aumento no nmero de bactrias sacarolticas o que reduz o pH. A reduo dos odores com origem em outras substncias (indol, escatol) medidas ao teste organolptico pode resultar da maior degradao de cistena em relao a outros aminocidos. Um efeito oposto pode ocorrer quando ocorre menor degradao de cistena e um aumento da degradao de outros aminocidos (KLEINBERG e CODIPPILY, 1999). Na tabela 7 que mostra o efeito do extrato de rom sobre o sistema de sedimento salivar. Podemos ver que para a diluio D2 os valores do teste organolptico aumentam enquanto os valores de CSV diminuem nas leituras de 1h e 2h. Como j discutido anteriormente, ao teste organolptico so

87

percebidos simultaneamente odores de outras substncias juntamente com os CSV. Os dados de CSV obtidos com a leitura pelo Halimeter sobre sedimento salivar controle (Tabelas 5 e 7) mostram valores elevados e que representam clinicamente casos extremos de concentrao de CSV na cavidade bucal. Do mesmo modo estes dados tambm indicam que a inibio proporcionada pela exposio do sistema de sedimento salivar ao extrato ocorreu em um meio com condies ideais para a produo de CSV, dada a adio de cistena ao sistema. No estudo in vivo de Liu et al (2006) medidas acima de 75 ppb foram utilizadas na incluso dos indivduos no grupo de portadores de halitose. Um outro fator precisa ser considerado na avaliao organolptica que

a possibilidade da presena de um odor mascarador. O estudo in vivo de Pitts et al (1983) demonstrou a presena de um efeito mascarador que foi observado at 30 minutos aps o uso de um colutrio. Em nosso estudo, no foram percebidos odores mascaradores apresentados pelos extratos quando da anlise organolptica do teste com sedimento salivar. A quantidade de extrato utilizada, o tempo de exposio do sedimento ao extrato e a lavagem do sedimento explicam a ausncia da interferncia de odores prprios do extrato. Os testes de sensibilidade antimicrobiana realizados previamente ao teste com sedimento salivar tambm colaboram para a interpretao de que a reduo na formao de CSV foi decorrente do efeito antimicrobiano dos extratos. Ainda que o sedimento salivar seja composto por um nmero de

espcies bem maior do que o nmero testado por difuso e microdiluio, devemos considerar: A o possvel efeito antimicrobiano sobre outras espcies produtoras de CSV; B que o efeito antimicrobiano sobre determinada espcie

88

leva ao desequilbrio do meio, impedindo o desenvolvimento de espcies bacterianas produtoras de CSV mesmo que estas no sejam sensveis ao agente antimicrobiano presente no extrato. Bradshaw et al (1998) demonstraram a importncia da bactria Fusobacterium nucleatum na coagregao bacteriana e observaram que a

presena deste microrganismo facilitou a sobrevivncia de Porphyromonas gingivalis e Prevotella nigrescens quando cultivos contendo estes

microrganismos foram expostos ao oxignio. O oposto tambm foi observado de forma que na ausncia de Fusobacterium nucleatum o crescimento destes outros microrganismos foi perturbado. Sabe-se que Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola so frequentemente encontradas em associao na doena periodontal. Estudo in vitro demonstrou um efeito sinrgico na formao de biofilme quando estes dois microrganismos foram cultivados em associao. Por outro lado, quando Treponema denticola foi incubada com Fusobacterium nucleatum ou Tannerella forsythia, nenhum aumento na formao do biofilme foi observado quando comparado ao cultivo destes dois microrganismos na ausncia da Treponema denticola (YAMADA, IKEGAMI e KURAMITSU, 2005). No somente a presena de determinada bactria importante no fenmeno de coagregao, no caso do envolvimento de Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum. Estudo utilizando medidas automatizadas com espectrofotometria indicou que a quantidade de bactrias presentes influncia de tal forma o fenmeno de coagregao que este pode no ocorrer se uma proporo ideal entre o nmero de bactrias for alterado (METZGER et al 2001).

89

A utilizao o sedimento salivar de Kleinberg e Codopilly (1999) no inclui testes para verificao da viabilidade das bactrias aps a ltima medida de CSV. Se considerarmos as interaes entre as bactrias descritas anteriormente, o cultivo para verificao do crescimento e identificao das bactrias viveis poderia trazer informaes adicionais sobre a influncia da presena do agente antimicrobiano presente no sistema. A quantificao de polifenis em produtos de origem vegetal bastante utilizada dada a importncia destes componentes por suas propriedades antioxidantes e antimicrobianas. Diferentes mtodos so utilizados e na sua maioria fazem uma equivalncia com a quantidade de cido glico presente na amostra estudada (GRAHAM, 1992; SELLAPPAN, AKOH e KREWER, 2002; LEE et al, 2003; KIM et al, 2003; GIAMPERI et al, 2004; ROMANI et al, 2006; MILLER et al, 2006). O cido glico j foi apontado como o responsvel pela ao antimicrobiana em estudo que realizou avaliao de componentes isolados da planta Rubus ulmifolius (PANIZZI et al 2002). Fizemos a opo pelo mtodo Azul da Prssia modificado por Grahan (1992) que apresenta como vantagem a estabilidade da cor aps a adio dos reagentes e utilizamos os resultados na escolha de dois extratos com as maiores concentraes de polifenis para a realizao dos testes com sedimento salivar. Dada a literatura revisada e os resultados encontrados neste estudo, podemos inferir que o efeito antimicrobiano est relacionado presena de polifenis nos extratos estudados. No entanto no podemos descartar a participao de outros compostos presentes nos extratos como aminocidos, protenas, cidos graxos esterides, entre outros (CARVALHO, 2004).

90

No foi objetivo deste trabalho a quantificao de componentes isolados presentes nos extratos. No estamos alheios a importncia da identificao destas substncias quando consideramos o potencial encontrado nos extratos utilizados quanto a sua capacidade de inibio de bactrias produtoras de

CSV. Todavia, este aspecto deve ser considerado tendo-se em vista dois fatores destacados por Chan (2003) quanto ao uso de produtos de origem vegetal: substncias isoladas podem ser demasiadamente txicas ou podem no apresentar atividade teraputica. Este fenmeno observado tanto

quando do estudo da atividade antimicrobiana como da atividade antioxidante dos polifenis (CHATTOPADHYAY et al, 2002; SEERAM et al, 2005; KUET et al, 2006). Verificamos que so poucos os estudos com fitoterpicos na

Odontologia. Seymour (2003) realizou reviso bibliogrfica quanto as propriedades e uso dos leos essenciais quanto ao seu efeito bactericida, uso na irrigao em casos de gengivite, bochechos em fase ps-cirrgica, manuteno de implantes, reduo de bacteremia e reduo de bactrias pelo aerosol das turbinas odontolgicas. Em todos os estudos revisados, o

Listerine foi o colutrio contendo leos essenciais utilizado. Outros estudos tem surgido nas ltimas dcadas incluindo, por exemplo, Cymbopogon citratus, Arnica montana Melaleuca alternifolia, Camelia simensis, e Punica granatum, como visto na reviso da literatura (SANTOS, 2000; KOO et al, HAMMER, 2003; VASCONCELOS et al, 2003; MATSUMOTO et al, 2003). Observamos que na literatura publicada sobre a abordagem 2000;

antimicrobiana com produtos fitoterpicos na halitose, o seu uso em estudos in vivo est restrito aos leos essenciais e praticamente aos estudos com

91

Listerine. Como excees temos: o estudo de Koslovsky et al (1996) que no descreve a composio de um colutrio com a combinao gua/leo e o estudo de Rsing, Jonski e Rlla (2002) que no especifica as substncias de origem vegetal presentes no colutrio testado. Vimos em nosso estudo Nesta pesquisa vimos que existe um potencial para a utilizao de fitoterpicos no combate a microrganismos relacionados a halitose. A realizao de ensaios clnicos so reconhecidamente os melhores modelos de estudo (LOESCHE e KAZOR, 2000) e inclusive so exigidos pela American Dental Association (ADA) para os produtos indicados para o tratamento da halitose para os quais se solicite a aprovao daquele Conselho (WOZNIAK, 2005). De forma geral, o uso de popular de produtos vegetais com finalidade teraputica tem seu uso legitimado pela prtica do consumo baseado nas informaes acumuladas durante os sculos. Ainda que o uso de plantas

medicinais ocorra como uma prtica comum em todo o mundo, as pesquisas nesta rea especfica so indispensveis tanto para a descoberta de novos medicamentos como para avaliao quanto aos riscos e benefcios destes produtos (CALIXTO 2000; CAPASSO et al, 2000; WOOLF, 2003;

SPARREBOOM et al, 2004). Um fato interessante pode ser observado no Brasil. Podemos nos alimentar com extratos de plantas medicinais que tm o seu registro no Ministrio da Agricultura, que compramos nas farmcias, esto acondicionados em frascos com atomizadores ou sprays, e no rtulo tm a observao: melhor no ingerir nada aps o uso.

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O crescente interesse pelos medicamentos de origem vegetal no um fenmeno social desvinculado de um forte componente de interesse econmico. Somente nos mercados dos Estados Unidos e Europa foram alcanados valores em torno de cinco e sete bilhes de dlares no ano de 1999, respectivamente. No Brasil contamos com uma legislao especfica quanto ao uso de produtos fitoterpicos que, no obstante, sofre oposio por parte de algumas companhias farmacuticas (CALIXTO, 2000). Utilizamos modelos in vitro como um passo inicial na investigao de alguns extratos e demonstramos sua atividade antimicrobiana. Vimos ao teste de difuso, microdiluio e com a utilizao do sistema de sedimento salivar que os extratos testados apresentam potencial utilidade no tratamento da halitose uma vez que mostram atividade antimicrobiana sobre microrganismos diretamente responsveis pela produo de CSV. Como esses microrganismos esto envolvidos na doena periodontal e endodntica, estas reas da Odontologia podem tambm ser beneficiadas. Estudos pr-clnicos e clnicos precisam ser realizados at que se obtenha o to necessrio binmio eficcia e segurana.

7. CONCLUSES.

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Extratos fitoterpicos demonstraram atividade inibitria sobre microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados volteis e portanto apresentam uma potencial utilidade na abordagem antimicrobiana para o tratamento da halitose de origem bucal. Os extratos fitoterpicos de juc (Caesalpinia ferrea) e rom (Punica granatum) inibiram a formao de compostos sulfurados volteis em um modelo de sedimento salivar mostrando potencial utilizao na cavidade bucal para a reduo das principais substncias relacionadas a halitose de origem bucal.

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