MONTAJE DE CARIOGRAMA

BLGA. MARIELA VINCES

ESTUDIO DE CARIOTIPO: Cultivo de linfocitos de sangre perifrica

Se colecta la muestra de manera asptica con la ayuda de una jeringa con un anticoagulante: heparina (3 mL) Algunas gotas de sangre pueden ser inoculadas en medio de cultivo o pueden ser sedimentadas. Se siembre el plasma que contienen los leucocitos.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO:

Presenta los compuestos y elementos necesarios para la sobrevivencia y multiplicacin de las clulas. Contiene antibiticos: impiden el crecimientos de bacterias FITOHEMAGLUTININA: AGENTE MITOGNICO

PROPIEDADES DE LA FITOHEMAGLUTININA
Tiene

como funcin promover la desdiferenciacin de los linfocitos que retornan a la condicin blstica, adquiriendo la capacidad de dividirse.

 En

un tubo falcon previamente esterilizado colocar 4 mL de Medio Mnimo Escencia (MEM) o RPMI 1640, adicional 1 mL de Suero Fetal Bovino (SFB), 0,35 mL de fitohemaglutinina (PHA) P, y aproximadamente 0,5 mL de sangre heparinizada (12 gotas). Se incuban las clulas a 37 oC por aproximadamente 69 horas

La siembra debe hacerse en cmara de aire de fluno laminar para evitar la contaminacin. La recoleccin de la muestra es el proceso que se obtienen clulas en metafase, de las cuales se obtendrn cromosomas. La calidad de las metafases se debe a principalmente de la solucin hipotnica que se utilice, lo que garantiza una buena dispersin de los cromosomas dentro de la clula, como el uso de una solucin fijadora encargada de remover los restos de organelos y membranas celulares, permitiendo obtener preparaciones limpias y analizables.

La colchicina, un inhibidor del huso mittico es esencial dentro del proceso que permite manipular las clulas para llegar al producto final de interes: los cromosomas. LA RECOLECCIN se incia con la adicin de 0,1 mL de Colchicina durante los 25 minutos finales de cultivo. Las clulas se centrifugan por 10 minutos a 1200 RPM; se descarga el sobrenadante y el botn celular se resuspende con una pipeta Parteur; luego se adicionan 8 mL de solucin hipotnica (Cloruro de potasio al 0,075 M), la cual debe estar a 37oC; se vuelve a resuspender con pipeta Pasteur evitando la formacin de burbujas, y se incuba por 10 minutos a 37oC.

 Adicionar

1 mL de solucin fijadora fra (Metano cido actico glacial) y centrifugar (10 min a 1200 RPM), Descargar el sobrenadante, desprender el botn celular por medio de golpes suaves al tubo, adicionar 5 mL de solucin fijadora (siempre fra) lentamente por las paredes del tubo; resuspender, tapar e icubar por 20 minutos en la nevera.

 Adicionar

mL de solucin fijadora, resuspender , tapar e incubar por 10 min en nevera. Centrifugar y descartar el sobrenadan te

Por cada cultivo deben prepararse de tres a cuatro lminas portaobjetos, las cuales tienen que ser de ptima calidad . Deben sumergirse con anterioridad en un recipiente de etanol puro, por mnimo 24 horas (en congelacin) y se limpian energticamente con una toalla que no deje motas. Al botn celular se le agrega 5 gotas de fijador, se resuspende y se extiende de 2 a 3 gotas de preparacin en lminas portaobjetos previamente desengrasadas a una distancia de 1 mt sobre un plano inclinado a 45.

 Luego

se procede a realizar la coloracin Giemsa

HIBRIDACIN IN SITU CON SONDAS FLUORESCENTES (FISH)

Se aplica esta tcnica de gentica molecular para la preparacin de cromosomas de ncleos en metafase o interfase. El objetivo es dectar reordenamientos cromosmicos pequeos que no puden ser detectados en microscopia. Durante FISH una sonde de ADN marcada es hibridada in situ con ADN cromosmico de cadena simple sobre un portaobjetos. La hibridadcin sito-especfica resulta en una seal visualizada sobre el cromosoma. En la marcacin directa, la marca fluorescente, un nucletido modificado (con frecuencia 2deoxiuridina 5trifosfato) que contiene un fluorforo, es incorporado directamente al ADN; la marcacin indirecta requiere de una sonda de ADN con un fluorforo para hacer visible la seal

Tincin slida

Tincin con Giemsa Bandeo G

Tincin con Mostaza de quinacrina Bandeo Q

Bandeo C tie especficamente regiones centromricas

Bandeo de alta resolucin

Bandeo 550 bandas

Bandeo 650 bandas

CARIOTIPO

Conjunto de cromosomas caracterstico de una especie determinada. En cada cromosoma, la cromtida izquierda muestra las bandas que aparecen en la metafase y a la derecha el mayor nmero de bandas encontradas en la profase tarda. p: brazo corto q: brazo largo Los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22 tienen satlites que corresponden a los organizadores nucleolares y que no deben confundirse con el llamado ADN satlite de secuencias repetidas. Los organizadores nucleolares contienen el ADN con los genes de los ARN ribosmicos de 18 S, 28 S y 5,8 S

CARIOGRAMA HUMANO
Para

la construccin del carigrama humano, los cromosomas son recortados y depositados de forma ordenada, de acuerdo con la morfologa, en orden decreciente de tamao, a menos que hayan sido sometidos a coloracin especial, en ese caso se debern tomar en cuenta el patrn de bandas

 En

los laboratorios de citogentica humana, el anlisis cromosmico para rutina con fines de diagnstico se realizan teniendo como base los cromosomas que hayan sido diferenciados en bandas G o alguna otra banda equivalente, que permita la identificacin inequvoca de cada para de cromosomas homlogos.

Los 46 cromosomas humanos forman 23 pares 22 pares son autosmicos y un par sexual Los pares de cromosomas autosmicos son numerados del 1 al 22 de manera decreciente en cuanto a su tamao Los cromosomas sexuales son denominados X e Y. Los pares cromosmicos, incluyendo los sexuales son reunidos en 7 grupos, designadoles las letras del A hasta la G, y clasificndolos por grupos.

Para la distribucin de los cromosomas en los diferentes grupos, despus de la coloracin convencional, se debe obedecer a los siguientes criterios:
GRUPO

Presenta a los 6 cromosomas ms grandes El par 1 es metacntrico El par 2 es submetacntrico El par 3 es metacentrico pero ms pequeo que el primero,

GRUPO B
Incluye

los pares 4 y 5: submetacntricos El tamao de los brazos cortos equivale a los 1/3 de sus brazos largos. No existe diferenciacin morfolgica entre los pares de cromosomas homlogos.

GRUPO C

Presenta 15 cromosomas en el hombre 7 16 cromosomas en la mujer, debido a que el cromosomas X se encuentra incluido en este grupo. Son metacntricos y submetacntricos, siendo difcil su identificacin individual. Los pares 6 y 7 son identificados por ser los de mayor tamao en el grupo, as como el cromosoma X; su tamao se encuentra comprendido entre el par 7 y 8. Los cromosomas del par 9 son identificados en un solo par (raramente ambos) debido a una constriccin secundaria intersticial en los brazos largos.

GRUPO D
Presenta tres pares de cromosomas acrocntricos, de tamao mediano. Presentan constriccin secundaria y satlites en los brazos cortos (pero no siempre visibles). Los pares 13, 14 y 15 no son morfolgicamente diferenciados entre si

GRUPO E
Incluye

3 pares de cromosomas El par 16 es metacntrico, e identificable morfolgicamente. Los pares 17 y 18 son submetacntricos; el par 17 presenta los brazos cortos ligeramente de mayor tamao a los del par 18.

GRUPO F
Presenta dos pares de cromosomas Los pares 19 y 20 Son metacntricos pequeos Nos diferenciados morfolgicamente entre si

GRUPO G

Presenta 4 cromosomas en las mujeres y 5 cromosomas en los hombres, aqu se encuentra el cromosoma Y Los pares 21, 22 y el cromosoma Y son acrocntricos, y los ms pequeos. Los cromosomas 21 y 22 presentan constricciones secundarias y satlites en el brazo corto (no siempre se pueden observar). No existe diferencia morfolgica en ambos pares El cromosoma Y se caracteriza por la ausencia de constriccin secundaria y satlite; se reconoce por el tamao mayor o menor que los autosmicos, y por la posicin paralela de los brazos largos

PRCTICA CARIOGRAMA
OBJETIVOS:

Aprender el protocolo adecuado para el cultivo de linfocitos Armar un cariograma humano MATERIALES
Fotografa Tijeras Goma

de clula humana en metafase

PROCEDIMIENTOS

Descartar la hoja que trae la copia fotogrfica de la metafase Contar el nmero de cromosomas, prestar atencin con la ocurrencia de superposiciones, asociaciones de acrocntricos, constricciones secundarias, satlites, etc.; que pueden confundir al contar. Con la identificacin preliminar del grupo al cual pertenece, recortar cada cromosoma, manteniendo un pequeo margen alrededor. Obtener los pares de cada uno de los grupos del A al G Dejar para el final los cromosomas del grupo C por ser los ms numerosos y semenjantes entre s. Colocar cara par cromosmico en la tabla anexa.

 http://learn.genetics.utah.edu/content/b

egin/traits/karyotype/

http://learn.genetics.utah.edu/content/di

sorders/whataregd/klinefelter/