Engenharia Gentica

Aulas Prticas
2011/2012

MUTAGNESE Mutao / Reverso

Parte I Identificao do efeito toxico e/ou mutagnico de vrios compostos qumicos em estirpes de Bacillus subtilis.

Parte II Estudo da aco mutagnica de compostos qumicos a partir da determinao da taxa de revertncia de mutaes do mutante Bacillus subtilis IGC724. Parte III Anlise dos resultados de sequenciao dos revertentes Ara+ Bacillus subtilis IGC724

Departamento de Cincias da Vida (DCV) Faculdade de Cincias e Tecnologia - Universidade Nova de Lisboa (FCT/UNL)

1. Introduo
Os factores ambientais tm um papel determinante na capacidade de um organismo se desenvolver, mas alguns desses factores podem ser prejudiciais originando mutaes que podem ter consequncias graves. O contacto com esses agentes danosos leva ao desencadeamento de processos de reparao do DNA impedindo o estabelecimento das mutaes e contribuindo para o normal desenvolvimento das clulas. As bactrias so particularmente sensveis aos agentes fsicos e qumicos, incluindo substncias txicas existentes no meio, e sendo de manipulao fcil so muitas vezes utilizadas para testar a toxicidade de certos compostos (estudos de viabilidade celular; inibio de crescimento) e o efeito mutagnico dos mesmos (estudos de reverso de mutaes como p. ex. teste Ames).

2. Objectivo
Este trabalho tem como objectivo identificar o efeito toxico ou mutagnico de alguns compostos qumicos em estirpes de Bacillus subtilis (1 parte do trabalho), e estudar a aco mutagnica de alguns desses compostos, determinando a taxa de reverso de mutaes (2 parte do trabalho). Pretende-se obter revertentes ara+ de Bacillus subtilis IGC724 -lys3 met araD24, incubando a estirpe na presena de diferentes mutagnicos. Como controlo utiliza-se a estirpe Bacillus subtilis 168T+ que uma estirpe prototrfica e no portadora de mutaes no opero da arabinose.

3. Background das estirpes de B.subtilis

A utilizao da L-arabinose em B. subtilis depende de trs enzimas intracelulares, codificadas pelos genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribulocinase) e araD (L-ribulose-5-fosfato 4epimerase), que convertem a L-arabinose em D-xilulose 5-fosfato, posteriormente catabolizada pela via das pentose fosfato. Os genes catablicos constituem as trs primeiras ORFs do opero araABDLMNPQ-abfA, localizado aproximadamente nos 251o do cromossoma de B. subtilis. Os genes a jusante de araD no so essenciais para a utilizao da L-arabinose. Os genes araN, araP e araQ esto envolvidos no transporte da arabinose para o interior da clula, abfA uma -Larabinofuranosidase e araL e araM no se conhece a funo. Noutra regio do cromossoma, a aproximadamente 298, est localizado o segundo opero araER, constitudo por uma unidade divergente de transcrio que inclui os genes: araE, que codifica um transportador activo com especificidade para a arabinose e para o AraR (regulador do opero da arabinose) codificado pelo gene araR. Em E.coli o transporte da L-arabinose para o interior da clula e o seu catabolismo requerem uma srie de protenas e enzimas cujos genes codificantes so muito semelhantes aos de Bacillus mas encontram-se agrupados em quatro operes distribuidos pelo cromossoma de B.subtilis: os operes araE e araFGH, que correspondem a genes que codificam protenas que se ligam L-arabinose e a transportam para dentro da clula; e os operes constitudos pelos genes araBAD e gene araC que especificam respectivamente enzimas envolvidas no catabolismo da L-arabinose e uma protena reguladora AraC. Os operes araE, araFGH e araBAD constituem um regulo sob controlo do opero regulador AraC que tambm se auto-regula. O opero araBAD da L-arabinose de E.coli foi o primeiro opero, controlado positivamente por uma protena reguladora, a ser descoberto. Este opero consiste em 3 genes estruturais envolvidos na converso da pentose L-arabinose para D-xilulose-5-fosfato promovida pelas enzimas cinase codificada pelo gene araB, isomerase codificada pelo gene araA e epimerase codificada pelo gene araD (ver esquema na pgina seguinte). Na figura que se segue esto representados os 3 genes estruturais que codificam as enzimas envolvidos na converso da L-arabinose em D-xilulose-5-fosfato de E.coli

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A L-ribulose-5-fosfato, que o substracto da enzima AraD, toxica para a clula, por isso mutantes araD- para alm de no poderem metabolizar a arabinose, no podem tambm sobreviver na sua presena. A estirpe Bacillus subtilis IGC724, apresenta o seguinte gentipo lys3 met araD24, no sobrevivendo portanto na presena de arabinose, mesmo que tenha outra fonte de carbono disponvel no meio. Os mutantes so normalmente detectados por comparao com as estirpes de fentipo wt. A reverso de uma mutao corresponde ao restabelecimento, de uma forma estvel, do fentipo wt, transmitindo-se sem alterao s geraes seguintes. A reverso pode ser espontnea ou induzida por mutagnicos. Normalmente a reverso devida a uma 2 mutao mutao supressora que suprime o efeito da primeira, contribuindo para o restabelecimento do fentipo wt. Quando esta 2 mutao se d noutro gene diferente daquele que sofreu a 1 mutao denomina-se supresso intergnica. Se a 2 mutao, responsvel pelo regresso ao fentipo wt, se d no mesmo gene denomina-se supresso intragnica. Na 1 parte deste trabalho vamos determinar o efeito toxico e mutagnico de vrios compostos qumicos nas estirpes de Bacillus subtilis 168T+ (que no portadora de mutaes no opero da arabinose) e Bacillus subtilis IGC724, respectivamente. Na 2 parte vamos estudar da aco mutagnica de compostos qumicos identificados na 1 parte deste trabalho a partir da determinao da taxa de revertncia de mutaes em Bacillus subtilis IGC724.

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4. Protocolo Experimental:
Parte I Identificao do efeito toxico e mutagnico de vrios compostos qumicos em estirpes de Bacillus subtilis. Estirpes: Bacillus subtilis IGC724 lys3 met araD24 Bacillus subtilis 186
Ateno: toda a manipulao que se segue deve ser feita chama (rea estril).

1 Dia (vspera da aula) Pr-inoculo

Inocular 10 ml de meio CsCH em erlenmeyers de 100 ml com uma colnia isolada da estirpe BsIGC724 e da o estirpe Bs168T+. Incubar a 37 C com agitao (120 rpm), durante a noite.

2 Dia (aula pratica) Inoculo Diluir as culturas do pr-inoculo (1:25) em 10 ml de meio CSCH em
erlenmeyers de 100 ml. Incubar a 37 C com agitao (200 rpm) durante 5 horas.
o

1. Inoculo das culturas.

Recolher 1 ml de cada cultura, com auxilio de um pipetador automtico, para tubos eppendorf previamente marcados na tampa com o nome de cada estirpe. Inoculo por incorporao em meio semi-slido: Agitar no vortex o eppendorf da cultura e retirar 50 l da suspenso de clulas de Bs724 para juntar 0 rapidamente aos 20 ml de meio semi slido CSCH+Ara (aquecido a 45 C), agitar no vortex. Deitar em seguida a mistura sobre a superfcie de meio slido CSCH+Ara das cx de petri grandes, previamente marcadas com a designao de cada cultura. Inclinar a cx de forma que o meio se espalhe por toda a superfcie, mas evitando formar bolhas de ar. Repita o procedimento com a outra cultura de Bs168. Coloque as cx inoculadas na parte lateral da bancada de forma a poder continuar a trabalhar perturbar a superfcie de solidificao do meio nas cx.

2. Preparao dos discos de papel de filtro embebidos na substncia qumica a testar

Cada grupo de trabalho deve marcar previamente uma cx de petri estril que est sobre a bancada escrevendo na base da cx. a sigla da substncia que lhe vai ser distribuda.

Tabela A Substncias qumicas a embeber nos discos de papel de filtro - 20 l . Tarefa de cada grupo.
Grupo Grupo 1 Grupo 2
Substncia qumica

Grupo Grupo 5 Grupo 6

Substncia qumica

CV
10 discos

DMSO
10 discos

VM
10 discos

H2O
10 discos

Grupo 3 Grupo 4

SF
10 discos

Grupo 7 Grupo 8

CA1
6 discos

AN
10 discos

CA2
6 discos

VC Violeta cristal; VM Verde malaquite; SF Safraniana; AN cido nitroso; DMSO Di-metil-sulfxido; CA1 e CA2 corantes alimentares.

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Com a ajuda de uma pina esterilizada em alcool a 70% e passada chama, separe e alinhe os 10 discos de papel de filtro estreis, na caixa que tem na bancada, de forma a no ficarem sobrepostos. Em seguida coloque 20 l da soluo do composto qumico, cuja sigla est registada na base da cx., em todos discos de papel de filtro que esto na cx. Consulte a Tabela A para saber que soluo que o seu grupo vai usar para embeber os discos de papel de filtro. A seguir colocar a caixa, com os discos embebidos na soluo, semi - aberta na estufa a 37 C para secagem dos filtros durante 5 10 minutos.
o

2. Colocao dos discos de papel de filtro embebidos na substncia qumica a testar sobre o meio inoculado.
Certifique-se que o agar solidificou antes de inverter a cx de petri. Na base das cx., com auxlio de uma rgua e de um marcador, divida o espao seis partes iguais*, e marque cada cx como se indica no esquema: - Identificao da estirpe inoculada, - Siglas do composto embebido no disco, respeitando a ordem do esquema - Turno prtico e grupo (P2G3). Colocar, com a ajuda de pina esterilizada chama, os discos embebidos nas diferentes solues da substncia a testar, de acordo com a ordem do esquema.

Incubar as caixas inoculadas invertidas, na estufa a 37 C, durante a noite.

* os grupos 7 e 8 dividem as cx em 8 partes iguais uma vez que vo analisar mais duas solues (CA1 e CA2)

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3 Dia - Registo e discusso dos resultados A. Observao e registo dos resultados da aco mutagnica dos vrios compostos qumicos na Tabela B.
(i) Halos de inibio de crescimento - medir com rgua em mm e comparar os tamanhos correspondentes s diferentes concentraes (ii) Aparecimento de colnias resistentes - espalhadas por toda a superfcie da cx. e/ou concentradas volta do halo de inibio de crescimento.

Tabela B Resultados dos ensaios para determinao da capacidade mutagnica de algumas substncias qumicas.
Composto
Determinar

Embebido nos discos 20l /disco

N moles / disco
Halo de inibio do crescimento (mm)

B.subtilis IGC724 Meio Cs CH Ara

Observaes Halo de inibio do cresciment o (mm)

B.subtilis 168 Meio Cs CH Ara

Observaes

CV
100 mg/ml MW 393,96

VM
50 mg/ml MW 364,91

SF
25 mg/ml MW 350,84

AN (65%) MW 63,02 d = 1,4804 g / ml DMSO (99,5%)

MW 78.13 d = 1,094 g/ ml

H2O CA1* CA2* MW peso molecular; d densidade

* S para os grupos 7 e 8

Clculos:

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B. Depois de registar e analisar os resultados com os elementos do seu grupo, responda s perguntas que se seguem para poder mais claramente tirar as suas concluses.
1. Porque razo o crescimento das estirpes de B. subtilis no pr-inoculo feito em meio completo Cs+CH e no num meio rico?

2. Porque razo que na experiencia o inculo se faz em meio CsCH+Ara?

3. Os resultados obtidos na medio dos halos de inibio de crescimento de B.subtilis IGC724 na presena dos diferentes compostos permitem tirar concluses quanto ao (Assinale a alnea CORRETA) a. efeito mutagnico dos diferentes compostos. b. efeito txico dos diferentes compostos. c. efeito mutagnico e txicos dos diferentes compostos. 4. E os resultados obtidos na experiencia identica, mas com o inculo de B.subtilis 168, permitem tirar concluses quanto ao (Assinale a alnea CORRETA) a. efeito mutagnico dos diferentes compostos. b. efeito txico dos diferentes compostos. c. efeito mutagnico e txicos dos diferentes compostos. 5. Com base nos resultados que registou na tabela B, que pode concluir sobre o efeito mutagnico destes compostos? Justifique. Composto CV VM SF AN DMSO Justificao

6. Como explica o aparecimento de colnias isoladas no meio inoculado com a cultura de B.subtilis IGC724, em vez de confluente como observou para B.subtilis 168? Meio CSCH+Ara + B.s724 colnias isoladas Meio CSCH+Ara + B.s168 cultura confluente

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7. A diferente distribuio das colnias de B.subtillis IGC724 em algumas caixas de meio CsCH+Ara que concluso lhe permite tirar?

8. Em que zona observa o aparecimento de mutantes espontneos?

9. A figura que se segue mostra os resultados obtidos num trabalho prtico idntico ao que fez, mas em que se testou o efeito inibidor do brometo de etdeo no crescimento das mesmas estirpes. Faa a interpretao desses resultados.

168T+

Meio Cs + CH + Ara

H2O - controlo

Brometo de Etdeo
IGC724

IGC724

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5. Meios e solues
Soluo de Sais C (10x) K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 H2O at prefazer 120 g 40 g 30 g 1000 ml 100 ml 5 ml 1 ml 10 ml 1000 ml para meio lquido; 2% para meio slido; 8% para meio semi-slido

Meio Cs Meio mnimo suplementado com sais Sais C (10x) MgSO4 ml 0,1 M MnSO4 ml 0,1 M Citrato de amnio frrico 2,2 mg/ml H2O estril at perfazer Bacto-agar

Este meio um meio mnimo de crescimento que tem que ser suplementado com uma fonte de carbono e que para crescimento da estirpe S.subtilis IGC724 deve tambm ser suplementado com lisina (stock 10 mg/ml) e metionina (stock 10 mg/ml), numa concentrao final de 20 g/ml (em meio slido) e de 50 g/ml (em meio lquido) para cada um dos aminocidos. Meio mnimo suplementado - CS+ fonte de C + Met+Lys Quando o meio suplementado com casena hidrolizada CH deitar 100 ml desta soluo a 10% (p/v), para um volume final de 1000 ml [concentrao final de CH de 1% (p/v) 1mg/ml]. Meio CS CH Meio completo Quando os meios so suplementados com arabinose Ara deve usar-se uma concentrao final de 0,1% /p/v (1mg/ml) [soluo stock de arabinose a 10% (p/v) (100mg/ml) ]. Meio CS + Met + Lys + Ara Meio CS CH + Ara Compostos qumicos a testar: - DMSO dimetilsufxido (99,5%) - (CH3)2SO MW 78.13; d=1,1g/ml Solvente orgnico; anticongelante; utilizado para preservao das clulas e organitos celulares a baixas temperaturas impedindo a formao de cristais de gelo. - CV - cristal violeta -C24H28N3Cl MW 393,96 (100mg/ml) - cloreto de hexametil-p-rosanalina; usado na colorao de Gram, cora os cidos teicoicos das clulas Gram positivas de azul intenso; tem aco antifungica - VM - verde malaquite - C23H25ClN2 MW 364,91 (50mg/ml) - corante usado na colorao de esporos (Wirtz-Conklin); tem capacidade de se ligar ao DNA. - SF safranina C20H19ClN4 - MW 350,84 (25mg/ml) - usada na colorao de Gram como contra corante que cora os lipopolisacardeos da membrana externa tornando as clulas Gram negativas visveis e coradas de vermelho. - AN - cido ntrico 65% - HNO3 - MW 63,02; d=1,48 g/ml Baixa o pH do meio por ser um cido forte.

6. Bibliografia
- De S-Nogueira, I. 2007. Regulao da transcrio em procariontes. In O mundo do RNA. Novos desafios e perspectivas futuras. Arraiano, C.M. and Fialho, A.M. LIDEL. Pag. 23-42. - Griffiths, A.J.F., Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, Sean B. Carroll. 2007. Mutation, repair and recombination. In Introduction to Genetic Analysis. Publisher, W. H. Freeman. Pag. 513-540. - Malacinski, G.M. and D. Freifelder. 1998. Mutations, mutagenesis and DNA repair. In Molecular Biology. Jones and Bartlett Publishers, Inc. Boston. Pag. 213-247 Disciplina de Engenharia Gentica - Mutagenese