GRADO EN NUTRICIN HUMANA Y DIETTICA

PRCTICA 1
BIOQUMICA
LORENA SNCHEZ DAZ y MARA GONZLEZ DAZ 06/06/2012

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Bioqumica

Introduccin
En est prctica, vamos a estudiar la cintica, extraccin y actividad de la enzima polifenoloxidasa o tambin llamada tirosinasa. Una de las caractersticas de esta encima, que se puede extraer tanto de clulas animales como de clulas vegetales, y en este caso la vamos a tomar de una patata. La funcin que tiene esta enzima, es catalizar la reaccin de la dopa, que al entrar en contacto con el O2, se oxida y obtenemos dopacromo. Usamos esta enzima porque se puede extraer con mayor facilidad que otras y tambin porque su grupo prosttico es el cobre que facilita la oxidacin de la dopa, adems, cuando se produce la reaccin y por tanto la oxidacin, la mezcla presenta un cambio de color, y adquiere un tono parecido al del cobre. Es en las clulas vegetales donde esta enzima tiene mayor importancia ya que es la responsable del oscurecimiento enzimtico durante el almacenamiento o durante el proceso de industrializacin. La enzima polifenoloxidasa est presente en todas las plantas y vegetales, pero se encuentra particularmente con una alta concentracin en la patata y en los championes, entre otros. La polifenoloxidasa, a diferencia de la mayora de las enzimas, puede catalizar a dos tipos de reacciones diferentes. Pero primero debemos explicar con un poco ms de detenimiento que es una enzima. La enzima es una protena que tiene funciones catalticas (esto quiere decir que va a suponer una aceleracin de la velocidad de reaccin, algunas pueden romper o formar enlaces). En los grupos prostticos hay derivados de protenas y metales, son estos ltimos los que nos determinan si una persona tiene deficiencias nutricionales por dficit de estos metales; un claro ejemplo sera la anemia. Son importantes para los seres vivos para muchas reacciones de oxidacin-reduccin y van a desempear su funcin biolgica gracias a los micronutrientes. Haremos una breve aclaracin de en que consiste la anemia con el fin de clarificar las posibles dudas y entender mucho mejor la importancia y funcin de las protenas. La anemia es una enfermedad en la que la sangre tiene menos glbulos rojos de lo normal. Tambin se presenta anemia cuando los glbulos rojos no contienen suficiente hemoglobina. La hemoglobina es una protena rica en hierro que le da a la sangre el color rojo. Esta protena les permite a los glbulos rojos transportar el oxgeno de los pulmones al resto del cuerpo.

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Bioqumica

Lo que vamos a hacer en el en el laboratorio es trabajar con el extracto de la patata en la cual hay ms de 3.000 enzimas diferentes aproximadamente de polifenoloxidasa, ya que es fcil de obtener y tiene como grupo prosttico al cobre. Tiene un tomo de cobre que se tiene que unir al sustrato para que se produzca la catlisis. Si tenemos todas estas enzimas y aadimos un sustratola dopa, al mezclarlo se va a producir una reaccin y se forma un compuesto coloreado que da como producto de la reaccin el DOPACROMO, la reaccin por tanto se producir en presencia de oxigeno, por eso se dice que se produce una reaccin de catabolismo; es decir, de oxidacin. Como punto final del catabolismo, obtenemos energa en forma de ATP, agua y dixido de carbono. Con las reacciones de catabolismo se va controlar mucho mejor, ya que la oxidacin va a ser muy lenta y controlada gracias a la accin de las enzimas. La dopa reacciona slo en cada enzima porque es especfica de ese sustrato.

2. Materiales
* Probeta de 50 ml * 1 vaso de 50 ml y otro de 100 ml * Cuchillo * Mortero * Embudo y trpode * Tubos de ensayo y una gradilla * Espectrofotmetro o colormetro * Pipetas: 1 0.5ml, 3 1ml, 2 5ml * Hielo y recipiente para mantenerlo * Patatas * Tampn fosfato sdico 20 mM, de pH 7.0. *DL--3,4 dihidroxifenilalanina (Dopa) 2 mg/ml disuelta en tampn anterior (preparada en el da). * Inhibidor: azida sdica 5x10-3 M.

3. Procedimiento
El objetivo de la prctica es utilizar una enzima para estudiar su cintica, para llevar acabo esto es necesario llevar acabo una serie de procesos. En primer lugar, extraemos la enzima que vamos a utilizar en este caso, la polifenoloxidasa, que tomaremos de la patata, lo mezclamos

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con tampn y lo colocamos en un tubito y este en un vaso con hielo para evitar que reaccione y acte la enzima. En segundo lugar, pasamos a preparar los distintos tubos de ensayo que vamos a utilizar, cada uno con las cantidades que se nos indica en las diferentes tablas. En los tubos de la primera tabla, solo echaremos la dopa y el tampn. En los de la segunda tabla, a dems de la dopa y el tampn, colocamos el extracto en el momento de medirlos. Para acabar, en los tubos de la tercera tabla, colocamos la dopa, el tampn, el extracto en el momento de medirlos al igual que en los otros y un inhibidor, que es la azida, que es un potente inhibidor de la actividad de esta enzima ya que es un agente quelante del cobre. A continuacin, una vez preparados todos los tubos necesarios con sus correspondientes cantidades en mL, procedemos a medirlos con el espectrofotmetro, echando justo en el mismo momento de medirlos el extracto de la enzima a cada tubo. Por ltimo, al medirlos obtenemos el tiempo y la absorbancia de cada reaccin, datos que utilizaremos para obtener la velocidad de catlisis de la enzima.

4. Resultados
Tabla 1
N tubo Tampn Dopa 1 2,4 0,5 2 1,9 1,0 3 0,9 2,0 4 0 2,9

Tubo 1 Tiempo 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 ABS 0,033 0,038 0,041 0,045 0,048 0,052 0,053 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00

Tubo 2 Tiempo ABS 0,051 0,054 0,057 0,060 0,061 0,063 0.066 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00

Tubo 3 Tiempo ABS 0,053 0,059 0,068 0,071 0,074 0,078 0,077 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00

Tubo 4 Tiempo ABS 0,052 0,057 0,057 0,058 0,061 0,062 0,064

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1,10 1,20 1,30 0,056 0,057 0,059 1,10 1,20 1,30 0.067 0,070 0,070 1,10 1,20 1,30 0,079 0,081 0,082

Bioqumica
1,10 1,20 1,30 0,064 0,066 0,066

Tabla 2
N tubo Tampn Dopa extracto 1 0,9 2 0,1 2 0,8 2 0,2 3 0,6 2 0,4

Tubo 1 Tiempo 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30 ABS O,036 0,040 0,051 0,048 0,051 0,053 0,056 0,056 0,058 0,060 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30

Tubo 2 Tiempo ABS 0,041 0,048 0,054 0,058 0,062 0,064 0,066 0,068 0,069 0,071 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30

Tubo 3 Tiempo ABS 0,041 0,046 0,051 0,056 0,059 0,063 0,064 0,066 0,068 0,070

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Bioqumica

Tabla 3
N tubo Tampn Dopa Inhibidor (azida) Extracto 1 0,9 2 0 0,1 2 0,5 2 0,4 0,1 3 0,1 2 0,8 0,1

Tiempo 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30

ABS 0,061 0,068 0,074 0,078 0,082 0,084 0,086 0,087 0,090 0,089

Tiempo 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30

ABS 0,043 0,049 0,055 0,061 0,066 0,070 0,074 0,077 0,081 0,082

Tiempo 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 1,10 1,20 1,30

ABS 0,053 0,058 0,062 0,067 0,072 0,075 0,078 0,081 0,084 0,087

Cuando hacemos la grfica, observamos que conforme pasa el tiempo el ABS aumenta, y va formando una curva cuando la representamos. Con esta grfica sacamos la velocidad, tomando como ABS final el que se encuentra en el lugar donde se empieza a formar la curva; a continuacin, elaboramos la grfica Velocidad- Azida (mL), en la que podemos ver como, conforme aumenta la concentracin de azida, que es el inhibidor, va disminuyendo la velocidad de la reaccin. 6

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5. Cuestiones
1. Qu reaccin cataliza la polifenoloxidasa? Cul es el sustrato de la reaccin? La polifenoloxidasa cataliza la reaccin de oxidacin de la dopamina, que acta como sustrato de la reaccin, y que en presencia de O2, se transforma en dopacromo. 2. Por qu razn se mantiene el extracto de patata en fro? Se mantiene en fro para evitar que la enzima reaccione, es decir, que se oxide, por ello no la mezclamos con la dopa hasta el momento de medir el ABS de cada uno de los ensayos a realizar. 3. Calculad las velocidades iniciales de reaccin de cada ensayo representando los valores de absorbancia frente al tiempo. er 1 ensayo: V1= ABS2-ABS1/ T2-T1 -> V1= 0052 0033 / 05 -0 -> V1= 0038m/s -> Inversa = 1/0038= 2632 V2= ABS2-ABS1/ T2-T1 -> V2= 0060-0051 / 03-0 -> V2= 003m/s ->Inversa= 1/ 003= 3333 V3= ABS2-ABS1/ T2-T1 -> V3= 0078-0053/ 05-0 -> V3=005 m/s -> Inversa= 1/005= 20 V4= ABS2-ABS1/ T2-T1 -> V4= 0061-0052 / 04 -0 -> V4= 00225 m/s ->Inversa= 1/ 00225= 4444

2 ensayo:
V1= ABS2-ABS1/ T2-T1 002 m/s V2= ABS2-ABS1/ T2-T1 00525m/s V3= ABS2-ABS1/ T2-T1 0044 m/s -> V1= 0056-0036 / 1 -0 -> V1=

-> V2= 0062-0041 / 04 -0 -> V2= -> V3= 0063-0041/ 05 -0 -> V3=

3er ensayo:
V1= ABS2-ABS1/ T2-T1 0046 m/s -> V1= 0084-0061 / 05 -0 -> V1=

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V2= ABS2-ABS1/ T2-T1 0032 m/s V3= ABS2-ABS1/ T2-T1 V3= 0025m/s

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-> V2= 0081-0043/ 12 -0 -> V2= ->

-> V3= 0081-0053 / 110 -0

4. Calculad los valores de Km y Vmx mediante la representacin de Lineweaver Burk. Para representar la velocidad, necesitamos saber las concentraciones de cada ensayo, sabiendo que tenemos 2mg/ml de Dopa, y teniendo los mL que usamos para cada ensayo. 2mg/ml= 2gr/L; Mm C9H11NO4= 197 gr/mol; 2 gr 1mol/197 gr = 001015 moles Pasamos los mL de cada tubo a L y con los moles, sacamos la concentracin de cada uno. 1er ensayo: M1= 001015/ 00005= 203gr/mol M2= 001015/ 0001= 1015gr/mol M3=001015/ 0002= 5075 gr/mol M4= 001015/ 00029= 35gr/mol 2 ensayo: los tres tubos tienen la misma concentracin. M=001015/ 0002= 5075 gr/mol

1er ensayo:
Km1= 2 ensayo: Km2= 3er ensayo: Km3= Vmx= Vmx= Vmx=

5. Tras realizar el estudio del efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad, qu conclusiones podis deducir a partir de la representacin de la actividad enzimtica frente al volumen de extracto? Observando las distintas grficas que hemos realizado, a partir de los datos obtenidos, podemos observar y deducir que a mayor cantidad de extracto, mayor actividad enzimtica y mayor velocidad de catlisis. Esto es debido a que hay mas centros activos, y el enzima se puede unir a mas cantidad de sustrato y de esta manera generar mas productos. Adems, cuando aumenta la cantidad de enzima, tambin aumenta la velocidad mxima sin producirse una saturacin por excesos de sustrato. 6. Por qu la azida acta como inhibidor de la polifenoloxidasa? La azida acta como inhibidor de la polifenoloxidasa porque cuando se une a las enzimas, evita que se produzca la catlisis, ya que el

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grupo prosttico de la enzima es el cobre y la azida es el agente quelante de este. 7. Calculad los porcentajes de inhibicin en presencia de diferentes concentraciones de azida. er 3 ensayo: empleamos la azida en la mezcla. El primer tubo no contiene la azida, y presenta un VsinI= 0046, mientras que el tubo dos y tres, que si contienen la azida, presentan una VconI= 0032 y 0044, respectivamente. % In.= 100 (1- 0032/0046) = 3043% % in.= 100 (1- 0025/0046) = 4565%