Captulo I Factores demogrficos y genticos en la conservacin de ccadas

Resumen General Ceratozamia mexicana Brongn. es una especie de lento crecimiento y larga vida, endmica del centro del Estado de Veracruz. Habita en el sotobosque del bosque mesfilo de montaa, uno de los ecosistemas ms diversos del pas pero tambin uno de los ms fragmentados. La legislacin mexicana registra a esta especie como endmica amenazada; mientras que la IUCN le asigna un estatus de vulnerable con poblaciones en decadencia. En estos casos, los estudios demogrficos son fundamentales en el diseo de planes de conservacin encaminados a reducir el riesgo de extincin. Por otro lado, la fragmentacin y prdida del hbitat disminuyen el tamao de las poblaciones y favorecen la depresin endogmica y la reduccin de la diversidad gentica. La suma de estos factores incrementa el riesgo de extincin de las especies. Tradicionalmente los planes de conservacin se basan en el conocimiento demogrfico de las poblaciones y en estudios genticos. Sin embargo, son escasos los estudios en ccadas que consideran conjuntamente los factores demogrficos y los genticos. En el presente estudio se plantea la realizacin de un anlisis gentico-demogrfico que permita conocer el estado en que se encuentra C. mexicana. El objetivo fue conocer la demografa de C. mexicana e identificar la diversidad gentica existente, bajo dos condiciones ambientales contrastantes. El estudio se efectu en 13 parcelas permanentes; ocho ubicadas en un sitio conservado y 5 en otro con actividad ganadera (con disturbio). Se tomaron datos en dos pocas, (marzo y septiembre), coincidentes con el desarrollo de sus estructuras reproductivas, durante los aos 2009 y 2010. Se cuantificaron el: nmero de semillas producidas, reclutamiento; la frecuencia de individuos en: plntula, juveniles, adultos no reproductivos y adultos reproductivos. El efecto de los sitios conservado y con disturbio, en la dinmica de C. mexicana fue analizado con modelos de matrices de transicin por etapa de crecimiento. Para el anlisis de la diversidad gentica, se utilizaron marcadores moleculares ISSR que exploran la variacin no sujeta a la seleccin natural. Los resultados obtenidos indican que ambos sitios mantienen un comportamiento similar en su tasa de crecimiento poblacional con una mayor a 1. Es decir que las poblaciones se mantienen a travs del tiempo. La transicin con mayor valor de elasticidad fue la de adultos no reproductivos para ambos sitios. Para el anlisis de diversidad gentica, se tiene como avance la extraccin de ADN y la amplificacin con los ISSRs del 15% de los individuos de los sitios de muestreo.

1. Introduccin. 1.1.1 La fragmentacin 2

La fragmentacin del hbitat es una de las amenazas ambientales ms graves y notorias que enfrenta la supervivencia de las poblaciones a largo plazo. Cuando se limita a especies de hbitats remanentes, se requiere de una comprensin cuantitativa de los efectos demogrficos y genticos, para cualquier actividad de conservacin (Bennet 2003). De ah la importancia de desarrollar modelos que integren los factores demogrficos y genticos que permitan evaluar la persistencia de las especies a largo plazo (Lande 1988, lvarez-Buylla et al. 1996). En general, las poblaciones ubicadas en ecosistemas fragmentados son ms propensas a la extincin debido al aislamiento de las poblaciones vecinas, a la prdida de dispersores y a un aumento de competencia por recursos con especies colonizadoras. En algunas especies del sotobosque, esto ha contribuido a que el reclutamiento de plantas jvenes sea prcticamente nulo (Jules 1998). La fragmentacin ejerce una presin de seleccin particularmente sobre las categoras menos adaptadas de una poblacin por lo que, consecuentemente, induce cambios demogrficos que incrementan el riesgo de extincin de las poblaciones. A largo plazo, conduce a una disminucin del tamao poblacional y, por lo tanto, a un incremento de la endogamia con la consecuente prdida de variacin gentica (Barrett y Kohn 1991). Es por todo ello que el conocimiento de los atributos demogrficos y genticos es primordial para el manejo de especies vulnerables a la estocasticidad ambiental y con distribucin restringida (Saunders et al. 1991, Esparza 2004, Gibson et al. 2008), como se presenta en algunas especies de ccadas como Ceratozamia mexicana. 1.1.2 La demografa

Los estudios demogrficos se enfocan sobre los nacimientos, muertes y la migracin de los individuos dentro y entre las poblaciones (Begon 2006). Su anlisis involucra la dimensin de estos eventos en el espacio, el tiempo y las condiciones del medio que las rodea. Las investigaciones sobre la dinmica poblacional proporcionan mayor informacin si se comparan condiciones de manejo contrastantes, particularmente el efecto del disturbio sobre la estructura poblacional (Snchez-Velsquez y Pineda-Lpez 2009). Se considera al disturbio como un evento discreto y puntual de mortalidad, desplazamiento o dao de uno o ms individuos que propicia directa o indirectamente una oportunidad para el establecimiento de nuevos individuos (Sousa 1984). Los modelos matriciales han mostrado ser una herramienta til para describir la dinmica de las poblaciones (van Groenendael et al. 1988). La importancia de estos modelos radica en la relativa facilidad de implementacin, adems de que permite procesar datos y hacer comparaciones 3

ecolgicas tericas o prcticas (Salguero-Gmez y De Kroon 2010). Estos modelos asumen que las poblaciones pueden subdividirse en clases donde los individuos comparten parmetros demogrficos. Las tasas de crecimiento poblacional se calculan a partir de la permanencia de los individuos dentro de las clases, la transicin entre estadios y la fecundidad (De Kroon et al. 2000). 1.1.3 La gentica poblacional

Los estudios genticos toman en cuenta: el tamao de las poblaciones, el sistema reproductivo de las especies y la dispersin de polen y semillas (Loveless y Hamrick 1984, Loveless et al. 1998). Conocer la diversidad gentica de las especies nos permite determinar la viabilidad de las poblaciones a largo plazo y por lo tanto, planear estrategias de conservacin y aprovechamiento adecuadas (Alejandre et al. 1990). Los estudios genticos que se han realizado hasta la fecha en poblaciones de ccadas han empleado por lo regular marcadores aloenzimticos (Gonzlez-Astorga et al. 2009). Estos presentan limitaciones para obtener estimados precisos de la diversidad gentica (de Vicente y Fulton 2003). En la actualidad, los estudios de diversidad gentica en otras especies vegetales emplean marcadores moleculares tales como el ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD), microsatlites anclados o repeticiones de secuencia corta (SSR), polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLPs) y microsatlites (SSRs) (Avise 2001, Khan et al. 2005, Martosa et al. 2005, Chen et al. 2008). Dentro de ellos, los marcadores ISSRs tienen la ventaja de ser mas reproducibles que los RAPDs, menos costosos que los AFLPs y menos complejos que los SSRs (Reddy et al. 2002), por lo que representan una tcnica rpida, confiable y eficiente. Estos marcadores dominantes y multiallicos se basan en el uso de la PCR y utilizan un solo iniciador de 14 pb o ms, complementario a dos microsatlites cercanos presentes en el genoma (Zietkiewicz et al. 1994). Los ISSRs son un tipo de marcador gentico que permiten registrar los niveles de variacin en las regiones microsatlite que se encuentran dispersas en varios genomas, particularmente el nuclear. Una de sus principales ventajas es que detecta una alta diversidad, requiere pocas cantidades de ADN y es altamente reproducible (Gonzlez y Aguirre 2007). 1.1.4 Las ccadas

Las ccadas constituyen uno de los grupos vegetales con mayor cantidad de especies registradas como vulnerables, amenazadas o en peligro de extincin (Donaldson 2003, Piero et al. 2008). Esto se debe a su rareza, distribucin restringida, grupos reducidos, extraccin ilegal de plantas o semillas y a la destruccin y fragmentacin de su hbitat (Vovides et al. 1997). 4

No obstante la importancia de las ccadas como grupo, existen pocos estudios que integran aspectos demogrficos y genticos en estas plantas. Hasta la fecha se han publicado slo una veintena de estudios (Piero et al. 2008). En el caso de C. mexicana, aunque mantiene un estatus de amenazada (NOM-ECOL-059-2001), no se cuenta con suficientes estudios demogrficos y/o genticos para la especie. Existen razones prcticas para conservar a C. mexicana: a) Es una especie pancrnica, es decir, ha permanecido por millones de aos inalterada, por lo tanto, es importante conocer sus estrategias de supervivencia. b) Su valor econmico potencial como planta ornamental, medicinal e industrial. c) La alteracin de su hbitat puede impactar negativamente en esta especie y en aquellas con las que interacta. Algunos factores que pueden agudizar la condicin vulnerable de C. mexicana son: a) b) c) d) e) f) g) Restriccin geogrfica. Fragmentacin de su hbitat. Lento crecimiento. Dioecia y falta de sincrona en la maduracin de sus estructuras reproductivas. Polinizacin especializada. Reduccin de sus poblaciones a travs del tiempo (IUCN 2010). Fuerte extraccin y comercio ilegal de plantas.

Considerando estos factores se han planteado las siguientes preguntas: Cmo influye la perturbacin del hbitat sobre la estructura poblacional de la especie? Qu etapa del desarrollo de la planta tiene mayor influencia en la tasa de crecimiento Cmo afecta el disturbio los niveles y patrones de variacin de la especie?

poblacional?

Hiptesis Si la fragmentacin modifica la estructura, dinmica y niveles de diversidad gentica en poblaciones vegetales, entonces es de esperar que se presenten diferencias en los atributos de elasticidad, tasa de crecimiento poblacional y variacin en los niveles de diversidad gentica en las dos condiciones contrastantes de disturbio en la poblacin de C. mexicana.

1.3

Objetivo General

Evaluar la dinmica poblacional y niveles de diversidad gentica en dos condiciones contrastantes de historia de vida (con y sin disturbio) de la poblacin de C. mexicana Brongn. con el fin de implementar estrategias que permitan su conservacin y manejo sustentable.

1.4 Objetivos especficos

Describir y comparar la dinmica poblacional de C. mexicana bajo dos condiciones contrastantes de disturbio. Identificar la contribucin relativa de cada etapa del ciclo vital en la tasa de crecimiento poblacional bajo dos condiciones de disturbio. Determinar los niveles y patrones de la variacin gentica en la poblacin de C. mexicana Efectuar un diagnstico del estado de conservacin en que se encuentra la poblacin de C. bajo dos ambientes contrastantes. mexicana e implementar una estrategia de manejo y conservacin de la especie desde un punto de vista gentico y ecolgico

1.5 Literatura Citada

Alejandre-Rosas, J.A., M.Y. Snchez-Tinoco y M. Vzquez-Torres. 1990. Estructura Poblacional de Ceratozamia mexicana Brongn. (Zamiaceae) en un bosque del centro de Veracruz. La Ciencia y el Hombre. Universidad Veracruzana.5: 93-112. Alvarez-Buylla, E.R., R. Garca-Barrios, C. Lara-Moreno y M. Martnez Ramos. 1996. Demographic and Genetic Models in Conservation Biology: Aplications and Perspectives for Tropical Rain Forest Tree Species. Annual Review of Ecology and Systematics. 27: 387-421. Avise, J.C. 2001. Molecular Markers, Natural History and Evolution. Kluwer. Academic Publishers. Norwell, Massachusetts, USA. Barrett, S.C.H. y J.R. Kohn. 1991. Genetic and Evolutionary Consequences of Small Population Size in Plants: Implications for Conservation. Pages 3-30 In D.A. Falk y K.E. Holsinger editors. Genetic and Conservation of Rare Plants. Oxford University Press. New York, New York. USA. 6

Begon, M., C. R. Townsend y J.L. Harper. 2006. Ecology From Individuals to Ecosystems. 4th ed. Blackwell Publishing, Malden MA. USA. Bennett, A.F. 2003. Linkages in the Landscape: The Role of Corridors and Connectivity in Wildlife Conservation. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. Chen Y., R. Zhou, X. Lin, K. Wu, X. Qian, y S. Huang. 2008. ISSR Analysis of Genetic Diversity in Sacred Lotus Cultivars. Aquatic Botany. 89: 311316. De Kroon, H., J. Van Groenendael, y J. Ehrlen. 2000. Elasticities: A Review of Methods and Model Limitations. Ecology. 81(3): 607618. De Vicente, M.C. y T. Fulton. 2003. Tecnologas de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Gentica de Plantas: Mdulo de Aprendizaje. Instituto Internacional de Recursos Fitogenticos (IPGRI), Roma, Italia. Donaldson, J.S. 2003. Cycads. Status Survey and Conservation Action Plan. IUCN/SSC Cycad Specialist Group. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. Esparza O. L.G. 2004. Qu sabemos de la Rareza de Especies Vegetales? Un enfoque Gentico Demogrfico. Boletn de la Sociedad Botnica de Mxico. 75:17-32. Gibson, J. P., S. A. Rice, y C.M. Stucke. 2008. Comparison of Population Genetic Diversity Between a Rare, Narrowly Distributed Species and a Common, Widespread Species of Alnus (betulaceae). American Journal of Botany. 95(5): 588596. Gonzlez-Astorga, J., A.P. Vovides, D. Cabrera-Toledo, y F. Nicolalde-Morejn. 2009. Diversity and Genetic Structure of the Endangered Cycad Dioon sonorense (Zamiaceae) from Sonora, Mexico: Evolutionary and Conservation Implications. Biological Journal of the Linnean Society. 36: 891-899. IUCN. 2010. www.iucnredlist.org Jules, E.S. 1998. Habitat Fragmentation and Demographic Change for a Common Plant: Trillium in Old-Growth Forest. Ecology. 79(5):16451656. Khan, I. A., F.S. Awan, A. Ahmad, Y.B. Fu, y A. Iqbal. 2005. Genetic Diversity of Pakistan Wheat Germplasm as Revealed by RAPD Markers. Genetic Resources and Crop Evolution. 52: 239244. Lande, R. 1988. Genetics and Demography in Biological Conservation. Science. 241: 1455-1460. Loveless, M.D., y J.L.Hamrick. 1984. Ecological Determinants of Genetic Structure in Plant Populations. Annual Review Ecology and Systematic. 15: 65-95. Loveless, M.D., J.L. Hamrick, yR.B. Foster. 1998. Population Structure and Mating System in Tachigali versicolor, a Monocarpic Neotropical Tree. Heredity. 81: 321-335.

Martosa, V., C. Royob, Y. Rharrabtia, y L.F. Garcia del Moral. 2005. Using AFLPs to Determine Phylogenetic Relationships and Genetic Erosion in Durum Wheat Cultivars Released in Italy and Spain Throughout the 20th Century. Field Crop Research. 91: 107116. NOM-059-ECOL-2001. 2002. Proteccin Ambiental de Especies Nativas de Mxico de Flora y Fauna Silvestre. Categoras de Riesgo y Especificaciones para su Inclusin, Exclusin o Cambio. Lista de Especies en Riesgo, 2nd seccin. Secretaria del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Mxico. Piero, D., et al. 2008. La diversidad Gentica como Instrumento para la Conservacin y el Aprovechamiento de la Biodiversidad: Estudios en Especies Mexicanas. Pginas 437-494 in: Capital natural de Mxico, vol. I: Conocimiento Actual de la Biodiversidad. CONABIO, Mxico. Reddy, M.P., N. Sarla, y E.A. Siddiq. 2002. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Polymorphism and its Application in Plant Breeding. Euphytica. 128: 917. Salguero-Gmez, R., y H. De Kroon. 2010. Matrix Projection Models Meet Variation in the Real World. Journal of Ecology. 98: 250254 Snchez-Velsquez, L. R. y M.R. Pineda-Lpez. 2009. Comparative Demographic Analysis in Contrasting Environments of Magnolia dealbata: an Endangered Species from Mexico. Population Ecology. 52 (1): 203-210. Saunders, D.A., R.J. Hobbs, y C.R. Margules. 1991. Biological Consequences of Ecosystem Fragmentation: A Review. Conservation Biology. 5(1): 18- 32. Sousa, W.P. 1984. The Role of Disturbance in Natural Communities. Annual Review of Ecology and Systematics. 15: 353- 391. Van Groenendael, J., H. De Kroon, y H. Caswell. 1988. Projection Matrices in Population Biology. Tree. 3: 264-269. Vovides, P. A., V. Luna y G. Medina. 1997. Relacin de Algunas Plantas y Hongos Mexicanos Raros, Amenazados o en Peligro de Extincin y Sugerencias para su Conservacin. Acta Botnica Mexicana. 39: 1-42. Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome Fingerprinting by Simple Sequence Repeat (SSR) Anchored Polymerase Chain reaction Amplification. Genomics. 20:176183.

Captulo II

Efecto del ambiente sobre la dinmica poblacional de Ceratozamia mexicana Brongn.

Este captulo fue editado conforme a la revista Plant Ecology.

Resumen Las ccadas son plantas dioicas seminferas muy antiguas. La mayora de sus especies estn consideradas como vulnerables, amenazadas o en peligro de extincin. La destruccin y fragmentacin del hbitat as como la extraccin y comercio ilegal de plantas son los factores de riesgo que ms influyen en la reduccin de sus poblaciones. C. mexicana es una especie endmica amenazada del centro de Veracruz, de acuerdo a la NOM ECO 059 1994 y con poblaciones decrecientes con base en la IUCN. Los cambios ambientales pueden influenciar las probabilidades de supervivencia, crecimiento y reproduccin de los individuos. Cuando se comparan condiciones contrastantes, los estudios sobre la dinmica poblacional permiten comprender mejor los patrones demogrficos. Este trabajo tuvo como objetivo estudiar la demografa de C. mexicana en dos sitios contrastantes: con y sin disturbio ambiental. Se establecieron 13 parcelas permanentes, 8 en un sitio sin acceso al trnsito de personas y 5 dentro de un potrero con libre acceso tanto para personas como para el pastoreo de ganado vacuno y caprino. Se compar la estructura poblacional mostrando que no existen diferencias significativas en la proporcin de individuos dentro de cada categora para las distintas condiciones de perturbacin. A partir de las proyecciones matriciales, se calcularon las tasas de crecimiento poblacional para cada sitio. En ambos casos, las subpoblaciones mostraron una tendencia a mantenerse estables a travs del tiempo con una de 1.001 0.11 para el sitio conservado y de 1 0.14 para el sitio con disturbio. Los componentes de la elasticidad, obtenidos a partir de la matriz E fueron: L = 0.92, G = 0.08 y F = 0.0008 para la poblacin conservada y L = 0.95, G = 0.05 y F = 0 para la perturbada. Cuando se incrementa la supervivencia de las semillas se observa un incremento significativo en la tasa de crecimiento poblacional y una distribucin diferente de los parmetros de elasticidad ( = 1.17 0.11, L = 0.72, G = 0.22 y F = 0.32). No obstante que, tanto para el sitio conservado como para el sitio con disturbio, la permanencia de la poblacin est explicada por la persistencia de los adultos no reproductivos (0.823 y 0.943 reproductivos (0.172 y 0.056 respectivamente). En conclusin, la introduccin de plantas que hayan transitado las primeras etapas del ciclo de vida incrementa el reclutamiento de semillas y plntulas con el consecuente incremento de , aunado a la conservacin de los adultos. respectivamente) seguido de los adultos

10

2.1

Introduccin

La rareza en especies vegetales, se refiere a aquellas plantas que localmente pueden ser abundantes pero que regionalmente son escasas (Schemeske et al. 1994). De esta forma, una especie rara es la que tiene restricciones en el tamao de sus poblaciones y en su hbitat. Las poblaciones de especies raras estn influenciadas por una gran cantidad de factores determinsticos y estocsticos (Esparza 2004). Al respecto, el disturbio incrementa la estocasticidad ambiental, con el consecuente impacto sobre la estructura de las poblaciones vegetales (Salguero-Gmez y De Kroon 2010). Esta informacin toma una mayor dimensin cuando se trata de especies endmicas y amenazadas como C. mexicana (Vovides et al. 1997). Desde la perspectiva de la ecologa vegetal es de gran importancia comprender el efecto de los factores ecolgicos sobre los procesos demogrficos para tomar medidas adecuadas de conservacin. Algunos procesos demogrficos de importancia son: las tasas de natalidad, crecimiento, reproduccin, fecundidad y mortalidad, pues describen el desarrollo de los individuos a travs del ciclo de vida (Gustafsson 2003, Franco y Silvertown 2004). La dinmica poblacional puede representarse esquemticamente mediante el empleo de modelos matriciales, estos modelos se usan para predecir la distribucin de los individuos en diferentes categoras de historia de vida y las tasas de recambio poblacional (Caswell et al. 2004). En algunos casos, determinar la edad cronolgica de los individuos especialmente en plantas de larga vida, resulta difcil; por lo que los modelos matriciales adoptan como indicadores de transicin de estados, atributos relacionados con el desarrollo como la altura y el dimetro (Lefkovitch 1965). El uso de modelos matriciales ha mostrado ser una herramienta til para los estudios poblacionales. Estos modelos son apropiados para el anlisis de los ciclos de vida de plantas perennes y proporciona una base slida para el anlisis comparativo (Franco y Silvertown 2004). A travs de las proyecciones matriciales es posible calcular la tasa de crecimiento poblacional y estimar la elasticidad para determinar las fases del ciclo de vida de las plantas que presentan mayor vulnerabilidad (Caswell et al. 2004). Es de gran importancia conocer la supervivencia, fecundidad y persistencia diferencial de los individuos por categoras dentro de una poblacin para inferir su adecuacin y estabilidad a travs del tiempo (Metcalf y Pavard, 2006). Identificar las categoras con mayor sensibilidad permite tomar medidas adecuadas de conservacin y manejo. Los estudios poblacionales que involucran condiciones contrastantes de manejo permiten una mejor comprensin de los parmetros demogrficos (Snchez-Velsquez y Pineda-Lpez 2009). 2.2 Antecedentes. 11

Las ccadas son un grupo vegetal importante pues son consideradas fsiles vivientes (Vovides 1991). Mxico es el segundo pas con mayor diversidad de ccadas en el mundo (Vovides 2002), por lo que se consideran una prioridad de conservacin nacional y se encuentran protegidas por leyes nacionales e internacionales (NOM-059-ECOL-2001, IUCN 2003). Sin embargo, debido a su longevidad, existen pocos estudios de proyeccin matricial (Tabla 1). Tabla 1.Comparacin de la tasa de crecimiento poblacional de varias especies de ccadas y componentes de elasticidad: Estasis (L), crecimiento (G) y fecundidad (F). Modificada de Octavio-Aguilar et al 2008.
Especies Encephalartos villosus Encephalartos cycadifolius1 Zamia amblyphyllidia (19821983)2 Z. amblyphyllidia (19831984)2 3 Dioon sonorense D. edule (Monte Oscuro conservado)4 D. edule (Monte Oscuro perturbado)4 Ceratozamia mirandae (Tres Picos conservado)5 C. mirandae (La Sombra perturbado)5 C. mexicana (conservado)6 C. mexicana (con disturbio)6 C. mexicana (incorporacin de semillas)6
1

1.047 1.000 0.966 0.999 1.098 0.999 0.995 1.039 0.860 1.001 1.000 1.171

Elasticidad
L
0.806 0.986 0.958 0.95 0.608 0.839 0.966 0.195 0.048 0.920 0.950 0.720

G
0.173 0.014 0.042 0.05 0.333 0.161 0.034 0.499 0.783 0.08 0.05 0.220

F
0.021 0 0 0 0.059 0 0 0.306 0.169 0.0008 0 0.320

1. Raimondo y Donaldson (2003). 2. Negrn-Ortiz et al. (1996). 3. lvarez-Ypiz et al. 2010. 4. Octavio-Aguilar et al. 2008. 5. Prez-Farrera et al 2006. 6. Este estudio. En estos trabajos se observa que las poblaciones tienden a mantenerse sin variacin a travs del tiempo, aunque el disturbio disminuye ligeramente la tasa de crecimiento poblacional para Ceratozamia mirandae y Dioon edule (Prez-Farrera et al 2006, Octavio-Aguilar et al 2008). De acuerdo a Lpez-Gallego (2008, 2010), la disminucin de la calidad del hbitat al fraccionarse afecta directamente la supervivencia y la fecundidad de Zamia melanorrhachis. Este fenmeno se repite para C. mirandae y D. edule en los estudios mencionados, repercutiendo directamente sobre la distribucin de la elasticidad para los atributos de fecundidad, transicin y permanencia de las

12

poblaciones. De manera general, a mayor perturbacin mayor elasticidad para la permanencia de los adultos y menor transicin entre categoras. Ceratozamia mexicana Brongn. es una especie longeva de lento crecimiento que raramente crece ms de 1m de altura, su tallo es semihipogeo y en ocasiones ramificado (Vovides et al. 2003), esta especie es dioica. Los machos liberan el polen desde fines de febrero hasta junio. La polinizacin es efectuada por Langridos especficos (Vovides 1991). Las hembras desarrollan un megastrbilo a partir del mes de septiembre y 13 meses ms tarde se inicia la liberacin de las semillas. Las semillas se dispersan principalmente por gravedad y en menor medida por algunos roedores (PrezFarrera et al 2000). Las semillas inician su germinacin en el mes de agosto a partir de los 10 meses posteriores a su dispersin (Snchez-Tinoco et al. 2000). Los megastrbilos contienen en promedio 80 semillas 10 y cada una de ellas mide 26 mm 2 de largo y 16 mm 1 de ancho (Rivera observacin particular). No hay antecedentes de la existencia de un banco de semillas en C. mexicana aunque la informacin existente sugiere que la semilla requiere de un proceso de posmaduracin de 12 meses (Snchez-Tinoco et al. 2000). En este trabajo evaluamos el impacto del disturbio sobre la dinmica demogrfica de C. mexicana, especie amenazada con poblaciones decrecientes de acuerdo a la lista roja del IUCN (IUCN 2010). La importancia de este estudio radica en el contraste de dos localidades con diferente grado de perturbacin y su efecto sobre la tasa de crecimiento poblacional y la distribucin de la elasticidad para la especie en cuestin. Adems, utilizamos herramientas matriciales para una especie longeva y aparentemente resistente a la variacin ambiental. 2.3 Preguntas de investigacin:

Cmo influye la condicin de disturbio sobre la estructura y dinmica poblacional de C. mexicana? Cul de las etapas de desarrollo de la planta influye ms en la tasa de crecimiento poblacional? 2.4 Hiptesis:

Si la fragmentacin modifica la demografa de C. mexicana, entonces se espera que haya diferencias en los atributos de elasticidad y tasa de crecimiento poblacional, cuando son comparadas dos condiciones contrastantes de disturbio que afecten a la especie. 2.5 Objetivo general:

Comparar el comportamiento demogrfico de C. mexicana bajo dos condiciones contrastantes de disturbio. 13

2.5.1

Objetivos especficos:

1) Conocer la demografa de C. mexicana bajo dos condiciones contrastantes de disturbio durante un perodo de 2 aos. 2) Identificar en dos condiciones de disturbio la contribucin de cada etapa de crecimiento en la tasa de crecimiento poblacional.

2.6
2.6.1

Materiales y Mtodos rea de estudio

El estudio se llev a cabo en una poblacin de C. mexicana con dos subpoblaciones con diferente grado de disturbio en la localidad de Coacoatzintla, Veracruz (19 39 37N y 96 57 W) a una altitud de 1460 msnm. El clima es templado hmedo con una temperatura media anual de 18 C y una precipitacin de 1780 mm (INEGI 2006, Fig. 1). El sitio conservado tiene un rea aproximada de 4 ha con accesos restringido, el sitio con disturbio tiene un rea similar y se encuentra inmerso en un potrero.

Figura 1. Ubicacin geogrfica de Coacoatzintla, Ver.

2.6.2

Datos de campo 14

Sitio conservado. Se seleccionaron mediante un muestreo sistemtico 8 parcelas experimentales de 25 m2. El primer par de parcelas se localiz a los 1550 msnm y de all cada 50 m de altitud aproximadamente, hasta los 1700 msnm, correspondientes a los lmites altitudinales inferior y superior, respectivamente en los que se encuentra esta especie (Google Earth 2010, Fig. 2).

Figura 2. Sitio conservado. La flecha amarilla indica la ubicacin de las parcelas en estudio.

Sitio con disturbio. El estudio se centr en dos potreros con presencia de remanentes de vegetacin en la cuales poda encontrarse C. mexicana; para estos casos las parcelas no fueron aleatorizadas sino que el muestreo fue dirigido exclusivamente a las zonas donde se presentaba la planta. De igual manera se localizaron 8 parcelas de 25 m2 para facilitar el contraste (Google Earth 2010, Fig. 3). Para comparar la estructura de las subpoblaciones se realiz una prueba de 2 entre la distribucin de individuos por categora para cada sitio.

Figura 3. Sitio con disturbio. La flecha amarilla indica la ubicacin de las parcelas, las flechas rojas potrero.

15

El estudio se inici en febrero de 2009, ya que en esa poca del ao se pueden encontrar estrbilos masculinos maduros y femeninos diferenciados (Snchez-Tinoco et al. 2000). El sexo de los individuos se determin por la presencia de los estrbilos o por su base persistente del ciclo anterior. Con esta informacin se estim la proporcin sexual poblacional. Debido a la naturaleza hipgea de la planta, se determin utilizar el dimetro del tronco como una medida correlacionada con los atributos de vida de la especie. En cada parcela se etiquetaron todas las plantas y se clasificaron con base en su etapa de crecimiento: 1. 2. 3. 4. 5. Semillas: Observadas y estimadas a partir del nmero de conos femeninos, el Plntulas: Se contabilizaron todos los individuos que presentaban una o dos hojas Juveniles: Todas aquellas plantas con ms de 6 foliolos y con un dimetro menor a Adultos reproductivos: Individuos con estructuras reproductivas o vestigios de las Adultos no reproductivos: Individuos mayores de 34 cm de periferia pero sin promedio de semillas por cono y la viabilidad de las semillas para cada sitio y periodo. con 6 fololos o menos y estaban unidas a la semilla. 34 cm, talla correspondiente al primer evento reproductivo registrado. mismas. estructuras reproductivas o vestigios visibles. 2.6.3 Diseo Experimental 2.6.3.1 Densidad poblacional y distribucin espacial

La densidad poblacional se calcul con base en el nmero de plantas por hectrea, a partir del promedio de plantas por cuadrante (juveniles y adultos en 25 m2) en todas las parcelas de cada sitio. Se utiliz la ecuacin:

Donde Dm equivale a la densidad promedio, a = rea de la unidad muestral, M= es nmero de unidades muestrales, A = sumatoria de las reas y ni = nmero de muestras. Para determinar el patrn de distribucin poblacional, se utiliz el ndice de agregacin espacial propuesto por Clark y Evans (1954) para cada categora: rE = [
i =1 N

Min(d ij ) N

] 16

Donde rE es la distancia media observada, Min dij= distancia entre el individuo i y el individuo j y N = total de distancias obtenidas. La distancia esperada del vecino ms cercano sobre la base de una distribucin completamente al azar se define por:
rA = 0.5 A N

Donde rA= distancia esperada en una distribucin aleatoria, A=distancia promedio y N = total de datos. Para definir si la subpoblacin se distribuye al azar se establece la relacin entre rA y rE de la siguiente forma: Ir = rE rA

Donde Ir= ndice de agregacin espacial. Si la distancia media observada es igual a la distancia esperada en una distribucin aleatoria, entonces la relacin Ir ser igual a 1 (distribucin al azar); si la distancia observada es menor que la distancia aleatoria Ir < 1 y la distribucin es agrupada. Finalmente si Ir > 1 la distribucin es homognea. El nivel de significancia para Ir estar dado por la siguiente ecuacin:

Donde rA es la distancia esperada en una distribucin aleatoria, rE es la distancia media observada al vecino ms cercano y E es el error estndar de la distancia media del vecino ms cercano. De acuerdo a los autores, c equivale a la desviacin estndar de una curva de distribucin normal por lo que se puede comparar por medio de una prueba de 2 de dos colas entre los valores esperados en una distribucin aleatoria (la unidad) y los observados en el campo. 2.6.3.2 Evaluacin de la fecundidad poblacional

Para establecer la fecundidad para cada condicin de disturbio, se estim el promedio de semillas por cono y se evalu la viabilidad de las mismas mediante la prueba bioqumica de cloruro de tetrazolio (Benito-Matias et al. 2004, ISTA 1996). Para ello se tomaron 120 semillas provenientes del sitio conservado y 120 del con disturbio, colectadas durante el perodo de desintegracin del megaestrbilo en septiembre de 2009. Las semillas fueron desinfestadas por inmersin en una solucin de hipoclorito de sodio al 10% durante 10 min. Posteriormente se le dio un hidroacondicionamiento durante 24 horas (Marn et al. 2007). Las semillas hidratadas fueron 17

seccionadas longitudinalmente con un escalpelo, de tal forma que quedaran expuestos tegumento y embrin. Se colocaron en cajas petri en solucin de cloruro de tetrazolio al 1% durante 4 horas hasta la pigmentacin de las estructuras seminales. Se asume que las semillas no coloreadas son inviables. En el campo, se contabilizaron el nmero de conos femeninos y masculinos, la mortalidad de las semillas y el reclutamiento por sitio y periodo, a fin de establecer la existencia de un banco de semillas. 2.6.3.3 Matrices de transicin, sensibilidad y elasticidad

A partir de los registros se estableci la tasa de permanencia por categora (nx/nx-1), la tasa de transicin al siguiente estadio (nt/nx-1) y la tasa de regresin del estado reproductivo al no reproductivo (nrxr/nrx-1), donde: nx es el nmero de individuos en una categora al tiempo x, nx-1 es el nmero de individuos de una categora al tiempo x-1, nt es el nmero de individuos que transitan de una categora a la siguiente, nrxr es el nmero de adultos reproductivos que regresan al estado no reproductivo al tiempo x y nrx-1 es el nmero de adultos reproductivos al tiempo x-1. La fecundidad se estim como el producto algebraico de la proporcin de hembras / total de adultos reproductivos, el promedio de semillas por cono, la tasa de viabilidad de las semillas para cada condicin y la supervivencia de las semillas en campo para cada periodo (Raimondo y Donaldson 2003). Con estos datos se construy una matriz de Lefkovich (L) durante el periodo Marzo 2009Septiembre 2010 para cada sitio. La tasa finita de crecimiento poblacional (), la proyeccin temporal y las matrices de sensibilidad y elasticidad, fueron estimadas a partir de las matrices de Lefkovich utilizando el programa RAMAS/stage (Ferson 1990). Este programa asume que el tamao poblacional despus de una generacin corresponde al producto de la matriz de transicin L por el vector inicial N0, es decir la cantidad de individuos observados al finalizar el estudio (t0) para cada categora. El proceso se repite hasta que la proporcin de individuos por categora permanece estable, lo que corresponde al vector derecho (w). La tasa finita de crecimiento poblacional () se obtiene a partir de la proyeccin matricial con la siguiente frmula: Nt/Nt-1, donde Nt corresponde al nmero total de individuos en la poblacin al tiempo t y Nt-1 es el nmero de individuos al tiempo t-1 (Caswell 1989; 2001; Caswell y Trevisan 1994, Silvertown et al. 1995).

18

Las matrices de sensibilidad se construyen a partir de los vectores w y v. El vector izquierdo (v) representa los valores proporcionales reproductivos para cada clase y se obtiene por la iteracin de la matriz L transpuesta por el vector inicial N0 hasta la estabilidad. Una vez obtenidos los vectores se multiplican de la siguiente forma: v1w1 + v2w2 + .... + viwj, esta suma corresponde al valor escalar vw. Los elementos de la matriz de sensibilidad S se obtienen con la ecuacin: Sij=viwj/vw. Finalmente, los elementos de la matriz de elasticidad se obtienen con la ecuacin: Eij=(Lij/)Sij, donde Eij corresponde al elemento ij-esimo de la matriz de elasticidad, Lij es el elemento ij-esimo de la matriz L, Sij es el elemento ij-esimo de la matriz de sensibilidad y es la tasa finita de crecimiento poblacional obtenida por la iteracin inicial de la matriz L (De Kroon et al. 1986, Caswell 1989, 2001). Los valores de elasticidad se definen como los cambios proporcionales en la tasa de crecimiento poblacional atribuidos al cambio en uno de los elementos de la matriz de transicin L (De Kroon et al. 1986, Benton y Grant 1999). La suma de todos los elementos de la matriz E corresponde a la unidad. Los lmites de confianza para se determinaron usando el mtodo analtico, el cual asume que los errores de los elementos Lij-esimos son pequeos y con una distribucin normal, por lo que tambin tendr una distribucin normal, en cuyo caso el intervalo de confianza (al 95%) es aproximadamente dos veces el error estndar ( + 2). As, las varianzas para las probabilidades de transicin fueron estimadas con la frmula Var Lij = Lij [1-Lij] / n, donde Lij es la probabilidad de transicin del estado j al estado i en la matriz L y n es el nmero de individuos usados para calcular dicha transicin. Con esta nueva matriz se iter hasta obtenerse la varianza de en estructura estable. Una vez estimada la varianza, es calculada como la raz cuadrada del estimado (Alvarez-Buylla & Slatkin 1991-94). 2.7 Resultados 2.7.1 Caracterizacin poblacional Para el sitio conservado al finalizar el estudio, los individuos se distribuyen de la siguiente forma: 1204 semillas, 175 plntulas, 48 juveniles, 77 adultos no reproductivos y 23 adultos reproductivos. Se observaron cambios en la distribucin de sexos a lo largo del estudio dando como resultado una proporcin sexual de 1.17 machos por cada hembra (Tabla 2). En cuanto al sitio con disturbio, la distribucin al final del estudio fue de 666 semillas, 175 plntulas, 6 juveniles, 24 adultos no reproductivos y 23 adultos reproductivos, con una proporcin sexual de 0.94 machos por cada hembra (Tabla 2). 19

La proporcin de individuos en cada categora no difiere significativamente entre las poblaciones (2 = 0.001, p = 0.99). Tabla 2. Frecuencia de individuos reproductivos durante el perodo marzo de 2009/septiembre 2010. Sitio Sexo Perodo de registro de datos
Marzo 2009 12 21 7 7 Septiembre 2009 15 13 4 4 Marzo 2010 12 19 4 3 Septiembre 2010 14 9 2 2

Total
53 62
17 16

Hembras Conservado Machos Hembras Disturbio Machos

2.7.2 Densidad poblacional y distribucin espacial En el sitio conservado la densidad promedio (Dm) equivale a 6,900 ind. / ha, mientras que en el sitio con disturbio se tuvo una Dm = 3,600 ind. / ha. La distribucin espacial fue calculada para cada categora dentro de las subpoblaciones. En el sitio conservado las plntulas se distribuyen de forma agregada (Ir = 0.218, c = 1.9, p < 0.05), mientras que los juveniles (Ir = 2.66, c = 10.8, p < 0.01), adultos no reproductivos (Ir = 4.12, c = 26.5, p < 0.01) y adultos reproductivos (Ir = 8.37, c = 37.1, p < 0.01) mostraron un patrn de distribucin espacial aleatorio pues en todos los casos difieren de la unidad. Para el sitio con disturbio se repiti el mismo patrn, las plntulas se agregan (Ir = 0.319, c = 2.1, p < 0.05), mientras que el resto de las categoras se distribuyen aleatoriamente (juveniles Ir = 3.08, c = 14.7, p < 0.01; adultos no reproductivos Ir = 5.65, c = 32.9, p < 0.01; adultos reproductivos Ir = 7.26, c = 44.3, p < 0.01). 2.7.3 Evaluacin de la fecundidad poblacional El 78 % de las semillas de ambas poblaciones mostraron embriones con diferentes grados de coloracin y en diferentes etapas de desarrollo. El promedio de semillas por cono para la poblacin conservada fue de 86 56.5, con un coeficiente del 0.46 hembras / total de adultos reproductivos y una supervivencia del 0.9 % del total de las semillas observadas en el campo. El producto algebraico de estos valores es igual a 0.278, lo que equivale a la fecundidad relativa de la poblacin. Para la poblacin perturbada el promedio de semillas por cono fue de 55.5 19.1, con un coeficiente hembras / total de adultos reproductivos de 0.51 y una supervivencia del 0.01 % para las semillas en el campo. La fecundidad relativa para la poblacin perturbada equivale a 0.221 20

2.7.4 Matrices de transicin, sensibilidad y elasticidad La tasa de crecimiento () para la subpoblacin conservada, calculada a partir de la matriz L (Tabla 3a), fue de 1.001 0.11. Los componentes de la elasticidad, obtenidos a partir de la matriz E (Tabla 3b) fueron: estasis (L) = 0.92, transicin (G) = 0.08 y fecundidad (F) = 0.0008. Para la subpoblacin perturbada, la proyeccin matricial a partir de la matriz L (Tabla 3c) arroja una = 1 0.14. La matriz E (Tabla 3d) muestra los siguientes valores de elasticidad: L = 0.95, G = 0.05 y F = 0. Con estos resultados es posible definir las etapas del desarrollo para C. mexicana con mayor incidencia sobre la tasa de crecimiento poblacional. Tanto para el sitio conservado como para el con disturbio la elasticidad mayor corresponde a los adultos no reproductivos (0.823 y 0.943 respectivamente) seguido de los adultos reproductivos (0.172 y 0.056 respectivamente). Tabla 3. Matrices de Lfkovich (a) y de elasticidad (b) para el sitio conservado y para el sitio con disturbio (c y d: Lfkovic y elasticidad respectivamente). 0 = semillas, 1 = plntulas, 2 = juveniles, 3 = Adultos no reproductivos, 4 = adultos reproductivos.
a) 0 1 2 3 4 b) 0 1 2 3 4 0 0,001 0,163 1 0,487 0,054 2 3 c) 4 0,278 0,001 0,327 0,274 0,221

0 1 8E-06 8E-03 8E-03 8E-03

0,731 0,857 0,269 0,906 0,455 0,943 0,929 0,094 0,546 0,143 0,057 0,071 d) 2 3 4 8E-03 3E-86 3E-83 8E-84 3E-84 0,002 1,9E-11 8E-03 0,745 0,077 0,889 0,053 0,078 0,094 3,2E-12 0,053 0,004

2.8 Discusin 2.8.1 Estructura poblacional La fragmentacin del hbitat por el cambio del uso de suelo no modifica la estructura poblacional de manera evidente, segn lo manifiestan los resultados de la prueba de 2. Esto contrasta con lo reportado por Prez-Farrera y colaboradores en el 2006 para Ceratozamia mirandae. La principal diferencia entre estos estudios radica en la forma en que se establecieron las categoras del ciclo de vida, mientras que para C. mirandae se construyeron a partir de la altura del tallo, para C. mexicana se realizaron mediante el dimetro del tronco.

21

Las transiciones entre categoras basadas en la talla son notorias en menor tiempo, por lo que cualquier incidencia ambiental rpidamente se ve reflejada en la cantidad de individuos por categora. Por el contrario, la naturaleza hipogea del tronco de C. mirandae no nos permite definir transiciones rpidas basadas en la talla, aunque tiene la ventaja de establecer categoras directamente relacionadas con la forma de vida de la planta, considerada longeva y persistente, lo que nos muestra una mejor correlacin con la dinmica de las poblaciones (Zuidema et al. 2010). Estadsticamente, las subpoblaciones son dominadas por individuos jvenes (semillas y plntulas) que posteriormente mueren por desecacin, lo que conlleva un bajo reclutamiento de plntulas y juveniles, constituyendo una curva de supervivencia tipo III idntica a las reportadas para Zamia amblyphyllidia (Negrn-Ortiz et al. 1996), Encephalartos cycadifolius, Encephalartos villosus (Raimondo y Donaldson 2003), Ceratozamia mirandae (Prez-Farrera et al. 2006) y Dioon edule (Octavio-Aguilar et al. 2008). Por otro lado, la proporcin sexual para ambas condiciones de disturbio no difiere significativamente, es decir, observamos aproximadamente la misma cantidad de machos y hembras. Sin embargo, cuando se mira a detalle la variacin estacional en la proporcin de hembras es alta en el sitio conservado, aunque permanece estable en el sitio con disturbio (Tabla 2), esta situacin ya haba sido reportada por Alejandre-Rosas y colaboradores en 1990. Esta variacin en la proporcin sexual est dada por las diferencias estacionales en la maduracin de los estrbilos masculinos (febrero-junio) y femeninos (septiembre). En contraste, la mayor parte de los trabajos en ccadas reportan una disminucin del nmero de hembras reproductivas en condiciones de disturbio (Prez-Farrera et al. 2000, Prez-Farrera et al. 2006). Esto se debe a que las plantas requieren suficientes recursos para la produccin de los estrbilos, lo que se correlaciona directamente con la estocasticidad ambiental (Vovides 1990). La periodicidad de los eventos reproductivos y una alta persistencia de las estructuras reproductivas femeninas de C. mexicana nos permiten establecer proporciones sexuales ms realistas. Recordemos que los adultos no reproductivos constituyen una fuente de informacin no disponible, situacin que en D. edule, subestima la fecundidad poblacional (Octavio-Aguilar et al. 2008). De esta forma, una de las mayores contribuciones de este trabajo consiste en demostrar que la proporcin machos-hembras, an en condiciones perturbadas, permanece estable en el tiempo. Aunque hay que reconocer la disminucin en el nmero de adultos reproductivos y por lo tanto el descenso en la fecundidad poblacional cuando hay actividades agropecuarias. . 22

2.8.2 Densidad poblacional y distribucin espacial La distribucin espacial de plntulas de C. mexicana es del tipo agregado, situacin que se debe principalmente a la forma de dispersin de las semillas. Por un lado, stas tienden a caer en torno a la planta progenitora y all germinan, formando grupos importantes. Por otro lado, debido a las pronunciadas pendientes las semillas pueden descender por gravedad y si llegan a un lugar propicio para germinar all se acumulan. Est reportado que este tipo de dispersin es la ms comn en Dioon edule, C. mirandae y C. matudai (Prez-Farrera et al. 2000, Prez-Farrera et al. 2006 y Octavio-Aguilar 2008). Sin embargo, la distribucin espacial de juveniles, adultos no reproductivos y adultos reproductivos, cuando se evalan de manera independiente manifiestan una distribucin aleatoria. En plantas de larga vida, se ha reportado una alta mortalidad denso-dependiente durante los estados tempranos del ciclo de vida (Alvarez-Buylla et al. 1996, Pino et al. 2007). En estas condiciones se esperara que las plntulas compitieran por los recursos del ambiente. Pero en las ccadas, la mortalidad no depende de la competencia sino de factores aleatorios como la desecacin, la pendiente o la concentracin de potasio en el suelo (Prez-Farrera et al. 2000, Prez-Farrera et al. 2006, lvarez-Ypiz et al. 2010). Debemos indicar que la sequa en el periodo estudiado fue particularmente severa. Por esta razn, aquellos individuos que sobreviven a las etapas iniciales del ciclo de vida se establecen de manera aleatoria. 2.8.3 Matrices de transicin, sensibilidad y elasticidad La distribucin de la elasticidad en las diferentes etapas del desarrollo vara en relacin a la forma de vida de las especies. En especies arbreas la elasticidad se explica principalmente por la persistencia de los individuos (L), mientras que en las plantas anuales el mayor componente de elasticidad se expresa por la fecundidad (F) (Silvertown et al. 1993, 1995). Adems de la forma de vida, el disturbio tambin modifica la distribucin de los patrones de elasticidad tanto en plantas de corta vida Zea diploperennis (Snchez-Velsquez et al. 2002), como en las ccadas: Ceratozamia mirandae (Prez-Farrera et al. 2006), Dioon edule (OctavioAguilar 2008). Considerando su forma de vida, C. mexicana se comporta como una planta longeva y de alta persistencia, con gran contribucin a por parte de la persistencia y un componente de fecundidad muy bajo, independientemente del disturbio. Para que C. mexicana se comportara de manera similar a C. mirandae en condiciones conservadas (Tabla 1) sera necesario incrementar la supervivencia de las semillas, lo que podra lograrse en condiciones de cultivo sustentable. 23

Como ejercicio, proyectamos con una matriz de transicin donde la supervivencia de las semillas se increment al 98 %, valores reportados para D. edule en viveros sustentables (Vovides 1990). En estas condiciones hipotticas, la tasa de crecimiento poblacional () resulta significativamente mayor que la unidad (1.17 0.11) y la elasticidad se distribuye de la siguiente forma: L = 0.72, G = 0.22 y F = 0.32 (Tabla 1), lo que constituye una buena expectativa de manejo, un incremento en el reclutamiento de juveniles y una contribucin de la fecundidad similar a la reportada para C. mirandae (Prez-Farrera et al. 2006). Aunque los datos muestran que la persistencia de los adultos es suficiente para el mantenimiento de la poblacin, resulta una buena estrategia de manejo la reintroduccin de individuos que hayan sobrevivido a las primeras etapas del desarrollo, evitando el impacto de la estocasticidad ambiental que resulta mayor que el disturbio.

2.9

Conclusiones

La proporcin de hembras en las poblaciones de ccadas ha sido subestimada por largo tiempo. Esto se debe a la lentitud con que se producen las estructuras reproductivas y a la estocasticidad ambiental. Sin embargo, cuando existe una periodicidad en la produccin de conos femeninos y masculinos queda de manifiesto que las proporciones sexuales son similares. Las poblaciones naturales de C. mexicana son estables a lo largo del tiempo debido a la persistencia de los adultos, independientemente de las condiciones de disturbio. Sin embargo, la alta mortalidad de las semillas debido a factores ambientales, disminuye significativamente el potencial de crecimiento de las poblaciones, incluso en mayor medida que el disturbio. Por lo anterior, resulta una estupenda estrategia de manejo la reintroduccin de plantas que hayan superado las primeras etapas del desarrollo, asegurando as el reclutamiento de juveniles y plntulas, aunado a la conservacin de los adultos como fuente de semillas para los cultivos sustentables.

2.10 Literatura Citada

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28

Captulo III

Comparacin de la diversidad gentica de Ceratozamia mexicana (Brongn.) en condiciones contrastantes de disturbio.

29

Resumen
Las consecuencias de la fragmentacin del hbitat pueden aumentar el riesgo de extincin de muchas especies endmicas y de hbitat restringido, como es el caso de Ceratozamia mexicana. Los efectos de la fragmentacin inciden en la disminucin en el tamao de las poblaciones y en su aislamiento; altera diversas interacciones ecolgicas como el mutualismo planta-polinizador. Altera tambin las tasas de crecimiento vegetal e influencia negativamente el xito reproductivo de los individuos. En los remanentes de vegetacin pueden ocurrir en corto plazo el apareamiento entre individuos emparentados y por ende el riesgo de la depresin endogmica. A largo plazo esta circunstancia puede reducir la capacidad de supervivencia, capacidad adaptativa, fertilidad y vigor de las nuevas generaciones. Es decir, uno de los principales efectos gentico de la fragmentacin es la prdida de la diversidad gentica. El estudio de la diversidad gentica ha sido una herramienta importante en la definicin de estrategias de conservacin. Por ello es de gran relevancia su implementacin en especies amenazadas, como es el caso de C. mexicana. Los marcadores moleculares han desempeado un papel clave en dichas evaluaciones por ser precisos, rpidos y confiables. Estos marcadores tienen aplicacin en reas como la conservacin de la diversidad, la demografa y la ecologa de las especies en peligro. En la actualidad se dispone de una amplia gama de marcadores moleculares con potencial para aplicarse con diferentes propsitos. Para estudios de diversidad gentica, los marcadores ISSR han mostrado ser de gran utilidad porque detectan los niveles de variacin y por ser altamente reproducibles. As mismo se les localiza en regiones codificadoras y no codificadoras y son generalmente muy polimrficos debido al alto nivel de variacin en el nmero de repeticiones. El presente trabajo tiene como objetivo la evaluacin de la diversidad gentica de C. mexicana a partir de marcadores ISSR, en dos sitios con condiciones de crecimiento contrastantes, con el propsito de generar una propuesta que coadyuve a su conservacin. Para tal, efecto fueron establecidas 13 parcelas permanentes, 8 en un sitio conservado y 5 en otro con actividad ganadera (con disturbio). En total se contabilizaron 183 individuos de C. mexicana en diferentes etapas de crecimiento, para la realizacin del estudio. De estas plantas se tomaron fololos de hojas jvenes completamente desarrolladas, se lavaron, etiquetaron y embolsaron en recipientes plsticos y se colocaron en hielera. En el laboratorio fue extrado el ADN de las muestras por el mtodo de CTAB. De algunos de los individuos se amplificaron por PCR a partir del uso de 3 iniciadores BCU. Los productos de las amplificaciones fueron separados en geles de agarosa y teidos para su observacin con bromuro de etidio. De las bandas obtenidas se efectu una base de datos que fue procesada por un anlisis de varianza molecular. A la fecha se ha extrado el ADN del 15% de los individuos y se cuenta con las imgenes de los geles correspondientes.

3.1 Introduccin. 30

La fragmentacin y prdida del hbitat disminuye el tamao de las poblaciones y su diversidad gentica; favorece el aislamiento y la vulnerabilidad de las poblacionEl conocimiento de la diversidad gentica, por lo tanto, es fundamental para la sustentabilidad de las especies pues acta como amortiguadora ante la estocasticidad ambiental y permite la adaptacin, evolucin y supervivencia de las poblaciones (Rajora y Mosseller 2001). El concepto de diversidad gentica se refiere a todas aquellas variaciones heredables que ocurren en cada organismo, entre los individuos de una poblacin y entre las poblaciones dentro de una especie. Por lo que su conocimiento y comprensin es importante para la conservacin y la gentica evolutiva (Piero et al. 2008). La diversidad gentica al igual que la diversidad biolgica, se ve afectada por la fragmentacin, y la destruccin de hbitats por actividades antrpicas, cambio climtico, sobreexplotacin e introduccin de especies exticas (Lande 1988). Por lo tanto, la distribucin de la diversidad gentica entre y dentro de poblaciones es influenciada por la interaccin de su forma de reproduccin y diversos fenmenos ecolgicos. La estructura gentica es generada por la dispersin, sobrevivencia y reproduccin de individuos en la poblacin a travs del tiempo; una apreciacin de la gentica evolutiva de una especie debe tomar en cuenta no solamente los eventos genticos como la fecundacin y el sistema de apareamiento, sino tambin las caractersticas ecolgicas e historia de vida y la influencia de la dinmica ecolgica y evolutiva de la poblacin (Loveless et al. 1998). El sistema de reproduccin de las plantas y los mecanismos de dispersin de polen y semillas son fundamentales en la distribucin de la variacin gentica (Hamrick 1983, Hamrick y Loveless 1986). Dado lo anterior, es preciso tomarlos en cuenta en programas de conservacin, ya que permiten adoptar modelos genticos y estadsticos adecuados (Souza et al. 2003). En las ltimas dcadas ha habido un creciente inters en el uso de marcadores moleculares para el estudio de la diversidad gentica. Estos marcadores han propiciado mtodos de evaluacin gentica tanto a nivel individual como de poblaciones (Cruzan 1998). La diversidad gentica puede medirse a travs de marcadores morfolgicos, pero estos son influenciados por el ambiente y son numricamente limitados (de Vicente 2003). Otros marcadores de gran utilidad en estudios de diversidad gentica, han sido los bioqumicos; aunque tambin son afectados por el ambiente y el tejido vegetal. As mismo, son pocos los sistemas enzimticos polimrficos (Faleiro 2007). El uso de marcadores moleculares ha impulsado fuertemente la dinmica de los estudios de ecologa, evolucin y diversidad gentica; son herramientas que permiten obtener una detallada descripcin de genes, individuos o poblaciones, prcticamente sin interferencia (Bachmann 1994).

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Los marcadores moleculares detectan polimorfismos en la secuencia del ADN del ncleo, mitocondria o cloroplasto. Existen diferentes tipos de estos marcadores y se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o mltiples y son de tipo dominante o codominante (Parker et al. 1998). Los anlisis genticos basados en frecuencias allicas han dominado con mucho las aplicaciones de marcadores moleculares en ecologa y conservacin. Estos datos permiten diferenciar genticamente la composicin de distintas poblaciones de una especie y describir el nivel de diferenciacin a travs de ndices de distancia o de fijacin (Godoy 2009). Existe un consenso entre los investigadores de que estos estudios han aportado grandes contribuciones a la comprensin de la dinmica de la biodiversidad en el tiempo y el espacio (Francisco-Ortega 2004). Los estudios moleculares son muy tiles para evaluar la capacidad de respuesta de las poblaciones y especies ante los cambios ambientales, evaluar riesgos de prdida de especies, poblaciones y recursos genticos; conocer la riqueza gentica y su distribucin geogrfica; planear las estrategias de aprovechamiento y conservacin de poblaciones, especies y recursos genticos; conocer las causas de la prdida de la diversidad gentica; evaluar los riesgos de introduccin de enfermedades, plagas y especies exticas sobre las poblaciones, especies nativas y recursos genticos (Oliveira et al. 2006, Piero et al. 2008). 3.2 Antecedentes Los estudios de diversidad gentica en ccadas, son de gran relevancia en trminos de conservacin, debido a que se encuentran en un estatus de amenazadas y en peligro de extincin, (Donaldson et al. 2003). Pese a ello, no se tienen actualmente suficientes estudios sobre gentica poblacional. Entre los estudios reportados, destacan los realizados en Dioon (Gonzlez-Astorga et al. 2003, 2005, 2009, Octavio-Aguilar et al. 2008, 2009, Cabrera-Toledo et al. 2008), Zamia (Gonzlez-Astorga et al. 2006) y Microcycas (Pinares et al. 2009). Los resultados encontrados para las especies de Dioon (1.8 alelos por locus; 70.2% de loci polimrficos y heterocigosidad esperada de 0.286) han indicado parmetros genticos elevados comparados con otras especies endmicas y con distribucin restringida (Gonzlez-Astorga et al. 2003). De igual forma los valores de diferenciacin gentica promedio encontrados para el gnero Dioon (G = 0.157) han variado cuando se comparan con otras ccada. Esto puede estar
ST

determinado por la alta especificidad de polinizadores, el aislamiento gentico por distancia (Gonzlez-Astorga et al. 2003), el efecto reciente de cuellos de botella (Gonzlez-Astorga et al.

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2005), as como la fragmentacin diferencial tanto natural como antropognica que han sufrido estas poblaciones (Piero et al. 2008) En el gnero Ceratozamia se ha detectado, mediante marcadores AFLPs, una variacin de 24.3% dentro de la especie as como una baja correlacin entre las distancias genticas y las geogrficas (De Castro et al. 2006). Con el uso de regiones no codificantes de cloroplastos y genomas nucleares (ITS y trnL-F) se ha encontrado que existe una baja variacin entre las especies de Ceratozamia (Gonzlez y Vovides 2002). Los datos moleculares sugieren que el aislamiento y especiacin del gnero es relativamente reciente porque las secuencias de DNA muestran bajos niveles de divergencia (Vovides et al. 2004). Sin embargo no se cuenta en C. mexicana con un estudio sobre su diversidad gentica que permita asociarlo a planes de manejo y estrategias de conservacin, que mantengan y preserven su diversidad (Prez-Farrera et al. 2006). Se requiere para ello del conocimiento de patrones ecolgicos en ambientes diferentes como densidad de poblacin, distribucin espacial, estructura poblacional, edad, fecundidad entre otros comprendidos en los estudios demogrficos. (Snchez-Velsquez et al. 2002, Quintana-Ascencio et al. 2003, Pic y Quintana-Ascencio 2005). La complementariedad de estudios demogrficos y genticos proporcionar una herramienta de gran vala en la puesta en marcha de acciones de proteccin de los recursos naturales. 3.2.1 Anlisis de la diversidad gentica Las poblaciones naturales y domesticadas de especies forestales y longevas se caracterizan por sus elevados niveles de diversidad gentica, causados por mutaciones y recombinaciones. Pero puede verse afectada esta diversidad por los procesos que conducen a la erosin y la deriva gentica (Beja-Pereira y Almeida 2005). Los anlisis de diversidad gentica pueden incluir los siguientes pasos: 1. La descripcin de la diversidad. Dentro de una poblacin, entre poblaciones y en zonas o regiones. 2. El clculo de las distancias (geomtrica o gentica) entre todos los pares de clases analizadas en el estudio. 3. La expresin de estas relaciones con un mtodo de ordenacin y/o clasificacin disponible. Algunos de estos mtodos permitirn comparar los resultados con otros tipos de datos, como los geogrficos (de Vicente 2004). La presencia o carencia de la diversidad gentica es explorada en la actualidad por los marcadores moleculares a travs de los polimorfismos expresados en los geles. Estos polimorfismos genticos permiten calcular las frecuencias allicas y genotpicas.

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El conocimiento de la diversidad gentica dentro y entre poblaciones es esencial para el establecimiento de prcticas de conservacin en plantas amenazadas. Varios aspectos de la biologa de la conservacin, como la prdida de diversidad gentica y restauracin de las poblaciones, slo pueden ser abordadas por estudios detallados de gentica poblacional (Hamrick y Godt, 1996).

3.2.2 Marcadores genticos en ccadas El uso de marcadores moleculares en ccadas ha sido extenso y con diferentes propsitos (Caputo et al. 1991, Moretti et al. 1993, Treutlein y Wink 2002, Gonzlez y Vovides 2002, Hill et al. 2003, Kokubugata et al. 2004, Bogler et al. 2004, Chaw et al 2005, De Castro et al. 2006, Sass et al 2007, Wu et al. 2007, Zgurski et al 2008 y Gonzlez et al 2008). La aplicacin de estos marcadores ha sido para estudios filogenticos principalmente. Para el anlisis de la ccadas han sido escasos (Zhou et al 1999). Una compilacin de los principales anlisis moleculares en estas plantas es presentada en la Tabla 4. En esta se pueden observar los ms utilizados recientemente, microsatlites e ISSRs (repeticin de secuencias inter simples, por sus siglas en ingls). Estos marcadores han mostrado una gran utilidad pues permiten analizar la variacin neutral que no es eliminada por la seleccin natural.
Tabla 4. Marcadores genticos usados para analizar la variacin gentica en ccadas

diversidad gentica en

Marcador

Estrategia

Autores
Byrne y James 1991 Gonzlez-Astorga et al. 2003 Gonzlez-Astorga et al. 2005 Gonzlez-Astorga et al. 2006 Octavio-Aguilar et al. 2009 Keppel et al. 2008 Byrne et al. 1997 Gonzlez y Vovides 2002 Xiao et al. 2004 Gangopadhyay et al. 2007 Chaiprasongsuk et al. 2007 Zhang et al 2008

Alozimas

12-15 loci 6PGD, PGM, MDH, GDH, IDH DraI, HindIII, EcoRI y BamHI. ITS 1,2,3,4 11 Iniciadores de la UBC 807-857 10 decmeros OPA, OPB 8 Iniciadores OPA, OPB, OPJ De 8 A 17 alelos por microsatlite

rDNA ISSR ISSR y RAPD RAPDS DNA repetitivo

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Los ISSRs son un tipo de marcador gentico basado en PCR (reaccin en cadena de la polimerasa, por sus siglas en ingls) que permite obtener los niveles de variacin en regiones microsatlite que se encuentran dispersos en varios genomas particularmente el nuclear. Su aplicacin ms importante ha sido para evaluar la diversidad gentica incluso entre individuos muy cercanos (Fang and Roose 1997, Esselman et al 1999). Los ISSRs son marcadores semiarbitrarios amplificados por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de la presencia de un oligonucletido o iniciador complementario a un microsatlite (Kantety et al. 1995). Estos marcadores, estn diseados para unirse a trinucletidos (evitando los mononucletidos presentes en el cloroplasto). Los iniciadores de ISSRs incluyen una secuencia repetida y un par de bases arbitrario en el extremo 3, utilizando un iniciador a la vez por reaccin de amplificacin. Estas repeticiones sucesivas de secuencias simples como (CT)n (CA)n, se encuentran ubicadas entre secuencias no repetitivas del genoma nuclear eucarionte (Gonzlez y Aguirre, 2007). Cuando dos secuencias repetidas se presentan dentro de una distancia amplificable y con una orientacin invertida, el decanucletido complementario puede inducir la amplificacin del segmento de DNA intermedio. La molcula generada, con un tamao particular (peso molecular), se considera un locus, que representa el segmento de DNA entre los microsatlites. Al analizar electroforticamente una muestra se genera un patrn caracterstico de productos de PCR de un individuo que se considera una huella digital gentica. El polimorfismo entre individuos de la misma poblacin puede detectarse, ya que el anlisis es sensible a la presencia/ausencia del elemento genmico reconocido por el iniciador y a la longitud de la secuencia intermedia amplificada (Zietkiewicz et al., 1994). La aplicacin de ISSRs en ccadas ha estado encaminada a la deteccin del sexo en Cycas circinalis (Gangopadhyay et al. 2007). Tambin se han empleado estos marcadores en la deteccin de diversidad gentica en Cycas guizhouensis. En esta especie se detecto baja diversidad a nivel poblacional (P= 14.21 y HE= 0.059) y a nivel de especie (P=35.9 y HE= 0.108). El grado de diferenciacin entre poblaciones fue elevado (GST= 0.4321) (Xiao et al. 2004). Se trabaj con Ceratozamia mexicana Brongn., una especie endmica de la regin. El gnero Ceratozamia ha sido uno de los ms ricos en especies y Mxico es el centro de diversificacin (Whitelock 2004). Distribuyndose desde el norte del pas hasta Honduras. Sin embrago C. mexicana es originario del noroeste de Xalapa en Veracruz (Whitelock 2002). De estas plantas se tomaron muestras de fololos completamente desarrollados, sanos, limpias y brillantes. Tomando en cuenta todo lo anterior se emprendi el presente trabajo con el fin de contribuir al conocimiento de la diversidad gentica en la poblacin de C. mexicana. 35

3.3 Preguntas de Investigacin La modificacin que ha sufrido el hbitat natural de C. mexicana, ha impactado significativamente en su diversidad gentica? La poblacin de C. mexicana se encuentra en equilibrio Hardy-Weinberg? Las condiciones contrastantes del ambiente y la distancia geogrfica reflejarn diferencias genticas? 3.4 Hiptesis La poblacin de Ceratozamia mexicana localizada en Coacoatzintla Veracruz bajo dos condiciones de manejo se encuentra en equilibrio gnico Hardy-Weinberg. El disturbio ha sido tan reciente, para una especie longeva como C. mexicanca, que no deberan existir diferencias significativas entre las subppoblaciones con diferentes condiciones de manejo. 3.5 Objetivo General Determinar los niveles y patrones de variacin, en dos sitios con diferente grado de disturbio en la poblacin de Ceratozamia mexicana de Coacoatzintla, Ver. 3.5.1 Objetivos especficos

Evaluar mediante marcadores moleculares ISSR la estructura gentica de C. mexicana Evaluar los patrones de variacin gentica de C. mexicana mediante marcadores moleculares ISSR Contribuir a la estrategia de conservacin de C. mexicana, una especie vulnerable 3.6 Materiales y mtodos 3.6.1 rea de estudio El presente trabajo se desarroll en la poblacin de C. mexicana que se localiza en el cerro de Coacoatzintla a 8 km de Xalapa, Ver. (Figura 1). Esta poblacin, endmica del centro del estado de Veracruz, se encuentra ubicada en la parte montaosa y forma parte del sotobosque del bosque mesfilo de montaa. Esta poblacin se localiza en la zona montaosa central del Estado, entre las coordenadas 19 39 latitud norte y 96 56 longitud oeste, a una altura de 1460 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte con Tonayn, al noreste con Miahuatln, al este con Naolinco, al sureste con Jilotepec, al sur con Banderilla y al oeste con Tlacolulan. Su distancia aproximada por carretera a la capital del estado es de 11.5 Km. Esta regin se caracteriza por poseer un clima templado-hmedo-regular 36

(temperatura media anual de 16C) y lluvias abundantes en el verano. Su precipitacin media anual es de 1,780.3 milmetros y se caracteriza por presentar suelos volcnicos poco profundos y ricos en materia orgnica. El municipio cuenta con una superficie total de 3,083.232 hectreas, de las que se siembran 1,026.782 en las 489 unidades de produccin. Los principales productos agrcolas y la superficie correspondiente en hectreas que se cosecha son maz con 700.00 y 70.00 de papa. Existen 188 unidades de produccin rural con actividad forestal, de las que 28 se dedican a productos maderables. Se seleccionaron en la poblacin de estudio dos sitios bajo condiciones contrastantes de manejo (Figura 4, Google eart 2010). El primero de ellos se ubic en la parte Noreste, que se encuentra del lado del litoral y con mayor vegetacin, humedad y abundancia de C. mexicana. Este sitio con escasa intervencin humana se localiz en un gradiente altitudinal que oscil entre los 1490 msnm y los 1710 msnm. No se encontraron ejemplares de C. mexicana por arriba de los 1710msnm. El segundo sitio se ubic en la parte suroeste del cerro dentro de los 1490 msnm. Este sitio con manejo ganadero, se caracteriz por presentar afectaciones por desmonte y suelos ms pobres, con mayor disturbio (menor densidad de poblacin).

Figura 4. Ubicacin de los sitios de estudio en las faldas oriental y occidental del Cerro Coacoatzintla, Ver.

Se seleccion un rea representativa de la poblacin en estudio. En ella se ubicaron 4 parcelas contiguos, de 10x10 m. Todas las plantas que se ubicaron dentro de estas parcelas fueron etiquetadas y evaluadas con base en su condicin reproductiva. De igual forma se colectaron muestras de tejido foliar de cada una de las plantas sexualmente diferenciados (Figura 5 a y b) por parcela (este nmero vari de 15-19 individuos para efectuar los estudios moleculares 37

correspondientes) durante la poca del ao en la que se desarrollan las estructuras reproductivas (estrbilos).

Figura 5. Estrbilos de individuos de C. mexicana a) macho y b) hembra

(Foto: Iglesias 2006)

3.6.2. Colecta de material biolgico El material foliar colectado se manej en todos los casos con cuidado para que no perdiera su viabilidad. Las muestras se etiquetaron y envasaron para su traslado al INBIOTECA, para su procesamiento y estudio. Finalmente se separaron en cantidades equivalentes para su estudio molecular. Las muestras foliares se conservaron a -20 C hasta su uso. Se tomaron adicionalmente datos de relativos a: fecha de colecta del material, nmero de referencia y sexo del individuo. 3.6.3 Extraccin del ADN genmico Se sigui el protocolo de extraccin de ADN genmico, propuesto por Doyle y Doyle (1987), modificado por Stewart y Va (1993), basado en el uso del CTAB (Bromuro cetil-trimetil amonio). En la Figura 6 se presenta una sntesis del procedimiento seguido. Las muestras foliares colectadas se lavaron con agua destilada y se secaron por completo. Posteriormente se procedi a macerar 50mg de tejido foliar de cada individuo en estudio y se colocaron en tubos eppendorf debidamente etiquetados.

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Figura 6. Procedimiento empleado para la extraccin de ADN en C. mexicana.

Se aadi 600 L de solucin de extraccin previamente calentada a 70C en bao mara a cada uno de los tubos conteniendo el tejido vegetal. Estos se agitaron con ayuda del vortex. Seguidamente se centrifugaron (1000 x g) las muestras a 4C por 5 min. Luego 500 L del sobrenadante se transfirieron a otro tubo eppendorf al cual se le adicion 700 L de solucin de alcohol isoamlico. Posteriormente, se incubaron las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 20 min a 4C a 1000 x g. La pastilla de ADN se lav con 1 mL de etanol al 70 % fro y se someti a centrifugacin por 5 min a 14,000 rpm y 4C. Se elimin el etanol y finalmente la pastilla se resuspendi en 100 l de buffer TE 10:1. Las muestras se mantuvieron bajo condiciones en congelacin a -20C hasta su anlisis.

3.7 Diseo Experimental 3.7.1 Determinacin de la concentracin y pureza del ADN La cuantificacin del ADN total se realiz por espectrofotometra, para lo cual se utiliz un espectrofotmetro (modelo Perkin Elmer). La cuantificacin se realiz determinando la absorbancia a 260 nm, para calcular el contenido de ADN presente en cada una de las preparaciones obtenidas. Para dicha determinacin del contenido de ADN presente se aplic la frmula propuesta por Valadez y Gnter (2000). Anexo 1. La determinacin cualitativa del ADN total de C. mexicana se realiz por separacin electrofortica en geles de agarosa al 0.8% en tampn TBE 0.5 X a 130 voltios durante 60 minutos 39

con una fuente de voltaje (modelo CONSORT E714). Al trmino de la electroforesis los geles fueron teidos con bromuro de etidio (10 mgml-1) y para su anlisis se visualizaron en un transiluminador de luz UV (modelo CONSORT SP-TF12). Se tomaron imgenes digitales de los geles bajo luz ultravioleta con una cmara digital (marca Fine Pix s1000df), de 10 megapixeles con lente ptico de 12X. 3.7.2 Marcadores ISSRs Se seleccionaron seis iniciadores ISSRs (UBC-834, UBC-841, UBC-856, UBC-888 UBC-890 y UBC-891) de la Universidad de Columbia Britnica de Canad (British Columbia University, Vancouver, Canad) reportados como los ms polimrficos y universales para diferentes especies vegetales (Anexo 2). La estandarizacin del protocolo de amplificacin de la tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, Abrev. en ingls, Polimerase Chain Reaction) para los oligonucletidos antes mencionados se realiz con base en los protocolos recomendados para ISSRs en diferentes gneros (Sofalian et al. 2008; Pivoriene et al. 2008; Pollegioni et al. 2006). Se utiliz el protocolo ISSR establecido por Snchez-Coello et al (datos no publicados) modificado, para obtener productos amplificados de 6 individuos sexualmente diferenciados de C. mexicana (3 individuos de cada sitio) con el iniciadores UBC 834 (Anexo 3). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Eppendorf (modelo AG) siguiendo el programa de amplificacin propuesto (Anexo 4) para UBC 834, modificado por Snchez-Coello et al. (datos no publicados). Las reacciones de amplificacin se realizaron por duplicado.Las separaciones se realizaron en una cmara de electroforesis horizontal (marca CONSORT) durante 1 h a 100 V con una fuente de voltaje (marca CONSORT E714). Se utilizaron marcadores de peso molecular de 100 pb (marca Promega). Los geles se tieron en solucin de bromuro de etidio (1gml-1) bajo agitacin lenta durante 20 minutos. Los fragmentos amplificados se observaron en un transiluminador de luz UV (marca CONSORT SP-TF12). Se tomaron imgenes digitales de los geles bajo luz ultravioleta con una cmara digital (marca Fine Pix s1000df), de 10 megapixeles con lente ptico de 12X. 3.7.3 Registro y anlisis estadstico de datos moleculares. Para el registro de los datos moleculares obtenidos se tomarn en cuenta solamente los fragmentos resueltos claramente y de forma reproducible en los geles. Los tamaos de los fragmentos se calcularn a partir de los datos de marcadores de peso molecular conocidos y las bandas totales, monomrficas y polimrficas se contabilizarn. Se determinar el rango en pb de los productos 40

amplificados por cada iniciador. Se crear sobre esta base una matriz binaria de datos moleculares para los marcadores ISSRs. Para ello se asumir que las bandas que migran en el gel a la misma altura son similares. La presencia de una banda se indicar por un nmero uno (1) y la ausencia como cero (0). Se generar a partir de ello una matriz de datos binarios que se procesar estadsticamente mediante el programa NTSYS-PC, versin 2.0 (Rohlf 1998). Se aplicar el software TFPGA (Miller 1997) para el anlisis de los datos obtenidos. Con este software se podrn obtener los parmetros de diversidad gentica: porcentaje de loci polimrficos (P), nmero de alelos por locus, nmero efectivo de alelos por locus (Ae) y heterocigosidad esperada (HE). La medida de la diversidad gentica (diversidad gentica total, HT; el coeficiente de diferenciacin de genes Gst) se medir por la las estadsticas de diversidad de genes de Nei (1973). La identidad gentica de Nei, de 0 a 10 y la distancia D, de 0 al infinito se calcular para cada par de la poblacin. El ndice de diversidad de Shannon se calcular Ho= -pi log2(pi) (Lewontin 1972) en cada pi representa la frecuencia de un fragmento dado ISSR. Ese ndice se usar para medir la diversidad total (Hsp) y la media de la diversidad intrapoblacin (Hpop). La proporcin de la diversidad entre subpoblaciones se calcular como: (Hsp-Hpop)/Hsp. El AMOVA (anlisis molecular de varianza) se usar para estimar la distribucin jerrquica de la variacin. Adems, para la prueba de correlaciones supuestas entre las distancias genticas (D) y las distancias geogrficas se llevar a cabo una prueba de Mantel entre las subpoblaciones mediante el clculo de 10 000 permutaciones. El programa Arlequin (Schneider et al. 2000) se usar para probar los valores significativos de pares distancias genticas. Las estimaciones de flujo gnico (Nm) se calcularn como Nm = (1 GST) / 4 GST.

3.8 Resultados A la fecha se ha podido extraer DNA de 58 individuos de cada uno de los sitios de estudio (con y sin disturbio) de los 183 que integrarn la poblacin. Para el caso del sitio conservado sern 138 mientras que para el que muestra disturbio 45. Los iniciadores usados han sido el UBC 834 y el UBC 841 (Figura 7 y 8). Los geles obtenidos se integrarn a una base de datos para posteriormente iniciar la integracin del anlisis de varianza molecular. Los resultados preliminares obtenidos del anlisis de los perfiles ISSRs de los 3 individuos provenientes de los sitios conservados y con disturbios, respectivamente, utilizando el iniciador UBC 834, mostraron la presencia de un total de 9 bandas.

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Figura 7. Separacin por electroforesis de productos PCR (ISSR-UBC 834) en DNA de Ceratozamia mexicana. NC= individuos tomados en el sitio con disturbio; C= individuos provenientes del sitio conservado.

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Figura 8. Separacin por electroforesis de productos PCR (ISSR-UBC 841) en DNA de Ceratozamia mexicana. NC= individuos tomados en el sitio con disturbio; C= individuos provenientes del sitio conservado.

3.9 Literatura Citada

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43

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