ACCIONDE LOS MICROORGANISMOS SOBRE DIVERSOS SUSTRATOS: ACCION DE AGENTES FISICOS Y QUIICOS

INTRODUCCION Obsevar la sensibilidad de los microoganismos frente a diversos antibiticos Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. De la amplia variedad de pruebas bioqumicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microorganisos. Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

OBJETIVOS: Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar -aplicando mtododistintos microorganismos. Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioqumcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar. Entender los principios bioquimicos de las pruebas. Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioqumias Conocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismos Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioqumicas.

FUNDAMENTO TEORICO AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRRO (TSI) Para azucares

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3.0 Pluripeptona 20.0 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Glucosa 1.0 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: Instrucciones Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

7.3 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

Incubacin
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico. Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 Pico/Fondo A/A A/A Produccin de gas + + Produccin decido sulfhdrico -

P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 A: cido K: alcalino RESULTADOS II RESULTADOS

K/A K/A K/A K/A K/K

+ + -

+ + + -

Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada. Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada. Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glcidos es fermentado La aparicin de burbujas en el taco indica que la fermentacin se ha efectuado con produccin de gas. Un ennegrecimiento en el medio indica la produccin de cido sulfhdrico.

A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada B Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico y gas C Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico D Ninguno de los tres azcares es fermentado RESULTADO III

La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cido producida por fermentacin ser baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita. Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido (que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar al color amarillo (cido). La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse la produccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie. Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies deSalmonella). Pico cido/fondo cido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no.E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. AGAR LISINA HIERRRO (LIA) PARA POTEINAS Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de

bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.04 Prpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0 pH final: Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin. 6.7 0.2

Siembra
Por puncin profunda con aguja de inoculacin.

Incubacin
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.

Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo) Microorganismos Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp. Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Color en el pico de flauta Rojo Prpura Prpura Rojo Prpura Rojo Prpura Color en la base del tubo Amarillo Prpura Prpura Amarillo Amarillo Amarillo Prpura Ennegrecimiento del medio Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922

Prpura Prpura

Prpura Prpura

Negativo Negativo

*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.

Caractersticas del medio

Medio preparado: color violeta.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. RESULTADO I

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

RESULTADO II
Mide la capacidad enzimtica de un organismo paradescarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formaruna amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilacin es el proceso mediante el cual lasbacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficasson capaces de atacar a los aminocidos en su grupocarboxilo dando una amina o una diamina y anhdridocarbnico. La descomposicin de los aminocidos se produceanaerbicamente. El proceso de descarboxilacin esirreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, elfosfato de piridoxal El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para darcadaverina y CO2 por accin de la enzima especfica lisina-descarboxilasa.

A: Reaccin acida. Color amarillo K: Reaccin alcalina. Color violeta R: Reaccin alcalina: color rojo K/K: Descarboxilacion lisina K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacion lisina R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa

DNAsa Agar.

Medio de cultivo utilizado para la deteccin de enzimas desoxirribonucleasas. Es especialmente til para la diferenciacin entre especies de estafilococos, as como para la diferenciacin de Serratia spp. de especies de Klebsiella y Enterobacter. Fundamento En el medio de cultivo, la triptena es la fuente de nitrgeno, aminocidos, y aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El cido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente solidificante. Este medio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de cido clorhdrico 1N.

El cido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el cido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo. Frmula (en gramos por litro) Triptena 20.0 Acido desoxirribonucleico 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar Instrucciones Suspender 42 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullicin para disolucin completa. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Distribuir en placas 15.0 de Petri estriles. pH final: 7.3 0.2

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar un inculo denso, ya sea en estra o por la tcnica de spot. Incubacin En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C. Cubrir la placa con cido clorhdrico 1N, y observar dentro de los primeros 5 minutos. Resultados Positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco. Microorganismo S. aureus ATCC 25923 S. aureus ATCC 6538 S. epidermidis ATCC 14990 K. pneumoniae ATCC 700603 S. marcescens ATCC 13880 E. cloacae ATCC 13047 Enzima DNAsa + + + -

Limitaciones: Las placas no pueden ser reutilizadas luego del agregado del cido clorhdrico. Caractersticas del medio: Medio preparado: mbar. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

MATERIALES Y METODOS

RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf http://es.scribd.com/doc/3288800/pruebas-bioquimicas-fundamentos-microbiologia http://es.scribd.com/doc/89539883/12/Agar-lisina-hierro-LIA