Relatrio do trabalho prtico 7 Nutrio Mineral

Fisiologia Vegetal

Autores: Henrique Fernandes, Joana Marques, Lus Castro e Ricardo Almeida Licenciatura em Bioqumica | 2011/2012

Licenciatura em Bioqumica Fisiologia Vegetal 2011/2012

Introduo
As plantas autotrficas so todas aquelas cuja fonte de carbono o dixido de carbono (CO2) e portanto o carbono constitui um dos elementos fundamentais para a sobrevivncia das mesmas.[1] Para alm do CO2, tambm a gua (H2O) e o oxignio (O2) so tambm fonte de dois outros elementos essenciais para as plantas, o hidrognio e o oxignio. No entanto, existem ainda outros 14 elementos qumicos que so absorvidos pelas plantas na forma inorgnica e que so considerados essenciais.[2] Assim, por definio, um elemento essencial se na sua ausncia a planta fica impedida de completar o seu ciclo de vida (segundo Arnon e Stout, 1939) ou ento aquele que tem um papel fisiolgico claro (segundo Epstein, 1999), ou seja, que esteja relacionado diretamente com o metabolismo da planta e que no possa ser substitudo por outro elemento na funo que desempenha.
[2][3]

Os macronutrientes so portanto

os 6 elementos presentes em maior quantidade comparativamente aos micronutrientes (restantes 8 elementos). Consideram-se macronutrientes, o azoto (1,5%), o potssio (1,0%), o clcio (0,5%), o magnsio (0,5%), o fsforo (0,2%) e o enxofre (0,2%)1. Os micronutrientes so o cloro, ferro, boro, mangans, cobre, zinco, nquel e molibdnio, cujas concentraes variam entre 0,00001% e 0,01% na matria seca. A nutrio desequilibrada consiste no fornecimento deficiente de alguns destes nutrientes, situao esta que acarreta sintomas de deficincia no desenvolvimento. Dependendo do elemento em falta, podemos ter situaes de clorose (por exemplo por carncia de mangans) que corresponde ao aparecimento de manchas amareladas nas reas foliares, necrose (por exemplo por carncia de mangans e ferro) que no mais do que a morte localizada de tecidos, a produo anormal de antocianinas (pigmentos) e tambm situaes de nanismo principalmente por carncia de azoto.
[2][3]

Os sintomas

de deficincia manifestados esto relacionados com a funo de cada elemento na planta, bem como a sua localizao e a sua capacidade de mobilidade na planta. Pela anlise dos sintomas possvel perceber qual o nutriente em falta ou qual o problema na sua absoro e/ou utilizao. No entanto, existem ainda nutrientes que quando em situao de deficincia apresentam os mesmos sintomas do que um outro sopreposio de sintomas macroscpicos. Quando isto acontece necessrio proceder a testes qumicos de composio mineral ou ento a testes bioqumicos de

Os valores apresentados correspondem concentrao dos elementos em matria seca. 1

Licenciatura em Bioqumica Fisiologia Vegetal 2011/2012 modo a quantificar a atividade de certas enzimas ou protenas onde a presena de um determinado nutriente essencial. O objectivo desta atividade perceber as diferenas entre os sintomas de plantas que foram submetidas a carncia de determinados nutrientes. Para isso, utilizase uma soluo carente em N (um macronutriente) e outras duas carentes em Fe e Mn. Assim, possvel analisar qualitativamente por diagnstico visual os efeitos da carncia de N nas plantas e por tcnicas bioqumicas a diferena entre dois micronutrientes que apresentam sintomatologias por diagnose visual muito idnticas. Assim, procede-se quantificao da atividade da peroxidase que biologicamente ativa na presena de Fe. A peroxidase uma oxiredutase que catalisa reaes do tipo RH2 + H2O2 2 H2O + R Neste trabalho recorre-se ao guaiacol (2-metoxifenol), como substrato, que oxidado num produto com cor e em que a velocidade a que isto acontece indicadora da atividade da enzima
Imagem 1 - Guaiacol

peroxidase. A peroxidase uma enzima do qual o Fe2+ um

constituinte estrutural e. portanto. essencial para a atividade da mesma. Como a planta obtm o Fe ao nvel da raz reduzindo-o de Fe3+ a Fe2+, forma biologicamente ativa, a presena de Mn que, por ser um agente oxidante, tende a oxidar o Fe2+ e portanto a diminuir a concentrao da forma biologicamente ativa para a enzima. Assim, ser de esperar que a atividade da enzima seja superior em plantas nutridas com um meio carente em Mn, seguido do meio completo e por fim o meio carente em Fe.

Mtodos e procedimento
Parte I - Preparao das solues stock
1. Preparou-se 25 mL de soluo stock de Fe (FeNa - EDTA 75mM); 2. Preparou-se 1L de soluo de macronutrientes (tabela I) e 1L de soluo de micronutrientes (tabela II) com os seguintes componentes:

Tabela I Solues stock de macronutrientes Reagentes Ca(NO3)2.4H2O KNO3 MgSO4.7H2O NH4H2PO4 KH2PO4 CaCl2.2H2O KCl Na2SO4 Volume final (mL) 100 100 50 50 50 50 50 50 Concentrao final da soluo (mol.L-1) 1 1 1 1 1 1 1 1 2

Licenciatura em Bioqumica Fisiologia Vegetal 2011/2012 Tabela II Solues stock de micronutrientes Reagentes H3BO3 MnSO4 ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O (NH4)6Mo7O24 Soluo A 2.86g 1.54g 0.23g 0.09g 0.02g Soluo B 2.86g 0.23g 0.09g 0.02g

Parte 2 Preparao dos meios nutritivos

1. Preparou-se 1L de cada soluo. Uma soluo de meio completo, deficiente em Azoto, deficiente em Ferro e deficiente em Mangans, de acordo com a tabela III. Retificou-se o pH (6.5 -7.0) da soluo;

Tabela III Preparao dos meios nutritivos

Solues stock Completo (mL) Def. N (mL) Def. Fe (mL) Def. Mn (mL)

Ca(NO3)2.4H2O KNO3 MgSO4.7H2O NH4H2PO4 KH2PO4 FeNa - EDTA CaCl2.2H2O KCl Soluo A Soluo B

4 6 2 1 1 1 -

2 1 1 4 1.5 1 -

4 6 2 1 1 -

4 6 2 1 1 1

2. Encheu-se vasos com uma mistura de 1 para 1 de vermiculite e perlite; 3. Regou-se e identificou-se os vasos com o nome da respetiva soluo; 4. Colocou-se as sementes de alface (Lactuca sativa) e colocou-se na estufa com condies de luz, temperatura e humidade propcias ao seu crescimento; 5. Regou-se os vasos periodicamente por forma a no deixar secar a mistura de envasamento; 6. Passadas 5-6 semanas comparou-se a morfologia das plantas dos quatro vasos (tendo como referencia as plantas do meio completo) e registou-se as alteraes verificadas; 7. Interpretou-se sintomatologia verificada e relacionou-se com as funes dos nutrientes na planta.

Parte 3 Determinao da atividade da enzima Peroxidase

Preparao dos reagentes: Tampo fosfato a 0.1 mol.L-1 (pH= 7.0) : Preparou-se 100 mL da soluo de KH2PO4 (0.1 mol.L1 ) e 50 mL da soluo de K2HPO4 (0.1 mol.L-1) Adicionou-se esta ultima primeira at obter o pH desejado; Guaiacol 0.5% (V/V): preparou-se 50 mL; H2O2 (0.03 mol.L-1): preparou-se 50 mL Execuo laboratorial 1. Pesou-se 0.20 g de folha sem nervura; 2. Cortou-se as folhas em pequenas pores e homogeneizou-se com o tampo fosfato no almofariz em gelo;

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3. Transferiu-se o contedo para um tubo Falcon e centrifugou-se a 3000rpm durante 10 min a 5 ; 4. Recolheu-se o sobrenadante para um novo tubo; 5. Realizou-se a determinao da atividade da peroxidase de cada amostra, atravs de espectrofotometria. Para essa quantificao adicionou-se a cada amostra os volumes das solues presentes na tabela IV:

Tabela IV Volume de soluo a adicionar cuvete de cada amostra

Cuvete VSoluo Guaiacol 0.5% (mL) Volume de amostra VSoluo H2O2 0.03 mol.L-1 (mL)

Meio completo 0.5 Meio def. em Mn 0.5 Meio def em Fe 0.5 Branco 0.5 *- Substituiu-se o volume de amostra (0.4 mL) por volume.

0.4 0.5 0.4 0.5 0.4 0.5 -* 0.5 tampo fosfato com o mesmo

6. Calibrou-se o espectrofotmetro com o branco e fez-se a leitura da absorvncia (imediatamente aps se juntar o H2O2) durante 1 min a 460 nm; 7. Registou-se os valores obtidos.

Parte IV Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford

1. Adicionou-se 1 mL de reagente de Bradford e 100 L de amostra (sobrenadante recolhido na parte 3) cuvete. Para o branco substitui-se o volume de amostra por gua desionizada; 2. Misturou-se bem e deixou-se repousar por 15 min; 3. Calibrou-se o espectrofotmetro com o branco e fez-se as leituras a 595 nm; 4. Registou-se os valores obtidos e relacionou-se com os valores obtidos na parte III.

Resultados Experimentais
Dados Observacionais

Imagem 2 - Folhas de alface aps o tratamento. (1 - Meio nutritivo completo; 2 - Meio nutritivo deficiente em Azoto; 3 - Meio nutritivo deficiente em Ferro; 4 - Meio nutritivo deficiente em Mangans

Imagem 2 - Plantas de alface aps o tratamento. (1 - Meio nutritivo completo; 2 - Meio nutritivo deficiente em Azoto; 3 - Meio nutritivo deficiente em Ferro; 4 - Meio nutritivo deficiente em Mangans

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Tabela V - Resultados da determinao da atividade da peroxidase e quantificao de protenas

Meio Completo Def. Fe + Verde + Senes + Verde + Senes Peso (g) Abs (595nm) Protenas (g/mL) Protenas (g/0,4mL) Abs460 -1 min -1 0,4mL Abs460 -1 -1 min mg protenas Abs460 -1 min gp.f.

0,20 0,24 0,20 0,22 0,21

0,5865 0,5397 0,2404 0,6553 0,2220

120,1 109,8 43,98 135,2 39,94

48,052 43,934 17,595 54,106 15,976

0,1151 0,06291 0,1553 0,1338 0,09134

-1

2,395 1,432 8,826 2,473 5,717

-1

11,51 5,243 15,53 12,16 8,699

-1

NOTA

Os valores de Protenas (g/mL); Protenas (g/0,4mL); Abs460 min mg prot.; Abs460 min gp.f. resultaram de clculo e so apresentados abaixo exemplos desse clculo. Def. Fe e Def. Mn so abreviatura de meio nutritivo deficiente em Ferro e Mangans respectivamente. + Verde e + Senes so abreviatura de quantificao efectuada em folhas mais verdes ou mais senescentes, respectivamente.

Def. Mn

18,00 16,00

Variao da absorvncia em funo dos meios nutritivos

Abs460 min-1 gp.f.

14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Verde Senescente

Completo Def. Fe Def. Mn Meios Nutritivos -1 Grfico 1 Indicao da atividade da peroxidase pela Abs460 min gp.f. de plantas submetidas a diferentes meios nutritivos.

Clculos
Teor de Protenas (g/mL)
Absorvncia = 0,5865 Protena = 0,2200 Absorvncia 0,0089 g L!! Protena = 0,22000,5865 0,0089 Protena = 0,1201 g L!! 1000 = 120,1 g mL!!

Teor de Protenas (g/0,4mL)

!!"#$%!" !"# !,!!" !" !"#!$%&'$( = Protena 0,4!" !!"#$%!" !"# !,!!" !" !"#!$%&'$( = 48,052 g/0,4mL Protena = 120,1 g mL!!

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Abs460 min-1 mg-1 de protena

Abs!"# = 0,1151 min!! 0,4mL!! Abs!"# min!! 0,4mL!! 1000 m!"#$%'( !"# !,!"# !" !"#!$%&'$( !,!"#
!

Abs!"# min!! mg !! de protena =

Abs!"# = 2,395 min!! mg !! de protena Abs!"# = 0,1151 min!! 0,4mL!! Peso = 0,20 g Abs!"# min!! gp. f. =

Abs460 min-1 por grama de peso fresco (gp.f.)

Abs!"# min!! 0,4mL!!

!"#$ ! !,!"# !,!"#

Abs!"# = 11,51 min!! gp. f.

Discusso de resultados
Com este trabalho pretendeu-se avaliar os efeitos de carncia nutritiva no crescimento e desenvolvimento de Lactuca sativa. A experincia decorreu ao longo de 6 semanas, ao fim das quais se observou o aspeto das plntulas. Pelo diagnstico observacional verificou-se que no meio nutritivo completo as plntulas, embora no tenham sido transplantadas, apresentavam um crescimento abundante e saudvel, factor este que foi inferido pela predominncia de cor verde e rea foliar. No vaso em que se limitou a fonte de azoto, as folhas apresentavam crescimento muito reduzido comparativamente com o vaso de meio completo (controlo) e clorose uniforme. Nas plntulas cujo os meios nutritivos so deficientes em Ferro ou Mangans, os sintomas foram semelhantes: o crescimento foi menos acentuado em relao s plntulas de controlo e algumas das folhas observadas apresentavam necrose nas suas extremidades. Para alm disso, verificou-se a presena de clorose interfascicular nas plntulas de meio nutritivo carente em Ferro e alguma clorose na margem foliar das plntulas do meio carente em Mangans.[2] Como os resultados obtidos por diagnstico visual so sobreponveis no caso dos meios nutritivos carentes em Ferro ou em Mangans procedeu-se anlise bioqumica atravs da determinao da atividade da enzima peroxidase. Pela anlise da Tabela V constata-se que a atividade da enzima maior nas plntulas de meio nutritivo carente em Mangans comparativamente s restantes. J nas plntulas de meio nutritivo deficiente em Ferro a atividade da enzima menor relativamente ao meio nutritivo completo. Averiguou-se ainda que as folhas mais senescentes de plntulas do 6

Licenciatura em Bioqumica Fisiologia Vegetal 2011/2012 meio nutritivo carente em Mangans apresentam uma atividade enzimtica da perixodase inferior das folhas verdes. No caso das plntulas cujo meio nutritivo carecido em Ferro ocorre precisamente a situao inversa.

Concluso
As plntulas cujo meio nutritivo carente em Azoto apresenta nanismo porque o Azoto um elemento essencial para o seu desenvolvimento e crescimento, visto que est presente na maioria dos compostos orgnicos envolvidos no metabolismo e na constituio da planta. No que diz respeito s plntulas dos meios nutritivos deficientes em Ferro e Mangans, a diferena por diagnstico visual no conclusiva porque os fenmenos sintomatolgicos so muito idnticos pelo facto das diferenas acarretarem apenas consequncias visveis ao nvel celular. Os sintomas observados na carncia de Azoto so mais evidentes do que os de Ferro ou Mangans, visto que a planta necessita em muito maior quantidade do Azoto do que dos dois ltimos. Portanto, para distinguir quais as consequncias da carncia de Ferro ou Mangans procedeu-se a uma anlise quantitativa da atividade da peroxidase pelo que se verificou que no caso do meio carente em Ferro a atividade da enzima inferior comparativamente ao meio carecido em Mangans. Isto ocorre porque o Ferro entra na constituio da peroxidase na forma de catio Fe2+, pelo que a atividade da enzima ser menor quando em situao de carncia deste nutriente. A carncia em Mangans por sua vez aumenta a atividade da enzima, pois sendo um elemento oxidante do Fe2+ (forma biologicamente ativa) a Fe3+, em menor concentrao propicia maiores concentraes de Fe2+ e portanto fomenta a atividade da peroxidase. Verificou-se ainda que a atividade da enzima superior comparativamente ao meio completo porque neste ltimo a presena de Mangans oxida tambm o Fe2+ e portanto existe menor quantidade da forma ativa do Ferro condicionando a atividade da enzima. Comparando os resultados obtidos na atividade da peroxidase para folhas mais verdes ou mais senescentes verifica-se uma irregularidade, sendo que as folhas mais senescentes possuem um comportamento diferente face s mais verdes que resultaram como o esperado. As discrepncia pode decorrer do facto de mesmo em situao de carncia nutritiva em Fe, possa ainda haver algumas quantidades deste nutriente e que por ser um elemento mvel tanto no xilema como no floema possa ter migrado para as zonas mais senescentes. Acontecimento este que ocorre em situaes de senescncia como forma de eliminar possveis agentes oxidantes. 7

Licenciatura em Bioqumica Fisiologia Vegetal 2011/2012 Portanto no caso das folhas mais senescentes o pouco Fe que poderia existir na planta acumula-se nessas folhas relatando uma maior atividade da peroxidase. O Mn por sua vez um elemento que no flui no floema e portanto distribui-se igual por toda a planta sendo por isso que a atividade da peroxidase muito mais similar tendo em vista que no h tendncia a acumular-se nenhum dos elementos.[5]

Referncias Bibliogrficas
[1] Pereira, L., Vias metablicas de converso de energia Biologia celular, FCUP, 2011/12 [2] Guia dos trabalhos prticos Fisiologia Vegetal, FCUP, 2011/12 [3] Zeiger, E., Taiz, L., Fisiologia Vegetal, 3 edio, Artamed Editora, Brasil, 2006 [4] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=460&loc=ec_rcs (19 de Maio de 2012) [5] Kirkby, E., Rmheld, V, Micronutrientes na Fisiologia das Plantas: Funes, Absoro e Mobilidade, Encarte de Informaes Agronmicas, IPNI, Junho de 2007