En el cuarto informe de laboratorio de la asignatura de BIOQUIMICA DE ALIMENTOS, el cual se titula, CARACTERISTICAS DE LOS COMPONENTES DE LA LECHE.

La leche es una secrecin nutritiva de color blanquecino opaco producida por las glndulas mamarias de las hembras (a veces tambin por los machos) de los mamferos . La leche de los mamferos domsticos forma parte de la alimentacin humana corriente en la inmensa mayora de las civilizaciones: de vaca, principalmente, pero tambin de oveja, cabra, yegua, camella. Las protenas del suero son compactas, globulares, con un peso molecular que vara entre 14,000 y 1,000,000 de daltones, y son solubles en un amplio intervalo de pH (se mantienen intactas cuando la leche se corta de manera natural, ya que no ha habido presencia de calor que desnaturalice las protenas). En estado natural no se asocian con las casenas, pero en la leches tratadas trmicamente y homogeneizadas, una parte de estas protenas s lo hace. Las protenas del suero constan por lo menos de 8 fracciones diferentes, todas sensibles a temperaturas altas (procesos trmicos) y por ello son las primeras en degradarse con procesos como la pasteurizacin o la UHT. La razn por la que la leche no se descompone estando fuera de refrigeracin una vez tratada trmicamente es porque las protenas del suero, al

desnaturalizarse, liberan un grupo sulfhidrilo que reduce la actividad de la oxidacin de manera parcial. Por la importancia del tema nuestro objetivo es el siguiente: Identificar los principales componentes de la leche.

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2.1. Leche La leche es un alimento completo, capaz de nutrir, hacer crecer y conseguir el desarrollo normal de un neonato en sus primeros meses de vida. Los anlisis de laboratorio nos muestran que es rica en protenas, carbohidratos, grasas, minerales y vitaminas de una forma totalmente asimilable por el lactante. Por este motivo nos han hecho creer, que si no tomamos lcteos se nos debilitarn los dientes, descalcificarn los huesos y nuestros hijos no tendrn un ndice normal de crecimiento. Y es lgico pensar de ese modo, teniendo en cuenta que socioculturalmente la leche ha sido y es un alimento introducido, comnmente, como nutriente habitual e indispensable en las dietas de millones de seres humanos. Sin embargo, el sentido comn nos conduce a pensar que la leche es necesaria para el lactante y si observamos el comportamiento de los animales adultos en la naturaleza, vemos que no maman y menos de una hembra de otra especie. De hecho en cuanto se ordea, empieza a contaminarse y a estropearse de forma rpida, siendo capaz de doblar la poblacin microbiana en 35 horas, a pesar de estar conservada en el refrigerador. El hombre lo ha solucionado esterilizndola con calor en el proceso de la pasteurizacin, pero de este modo no tiene los mismos beneficios y no resulta ser igual de asimilable la leche de bovino que la que se mama de la madre (Santos, 1987). Cuadro 1.Composicin de nutrientes en un litro de leche PROTENAS 34g 82% Casenas 18% Lacto albmina

Carbohidratos
49g Lactosa

Lpidos 35g
Grasas saturadas Colesterol

Sales minerales
9g

Vitaminas

1,25 g 03 mg Calcio Tiamina 1 g Fsforo 17mgRiboflavi na 1,5 g 1mg Niacina Potasio 05 g Sodio 10mg cido ascrbico 150 UI vitamina A
FUENTE: Alais(1987)

2.2. Comparativa entre la leche humana y la leche de vaca diluida Es de sabidura popular el hecho de que para alimentar a un lactante con leche de vaca es necesario diluirla, pero an as no se consiguen lquidos idnticos. La cantidad de protenas de la leche humana, es 4 veces menor que la de la leche de vaca y su diferente composicin queda de manifiesto cuando se "cortan". En la humana el 80% queda en el suero y el 20% en la cuajada, mientras que en la de vaca es a la inversa, el 80% queda en la cuajada y el 20% queda en el suero. La parte

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Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias proteica que cuaja est compuesta en su mayora de casenas y la que queda solubilizada en el suero de L - albmina. La excesiva cantidad de casena de la leche de vaca neutraliza la acidez gstrica favoreciendo las infecciones intestinales. Adems la casena se coagula en gruesos grumos que no pueden ser bien digeridos por el lactante. Las protenas de la leche de vaca "formulada" por la industria para bebs, son estables en el estmago durante setenta minutos, mientras que las de la leche materna lo son slo quince. Las protenas extraas entran en el intestino delgado intactas, produciendo una sensibilizacin prematura que puede ser una causa importante en el desarrollo del asma y eccema infantiles. Tambin la composicin de aminocidos de las protenas lcteas puede acarrear algn desequilibrio, tal como ocurre con la cistina, que aunque se encuentra en la misma cantidad en la de vaca y en la materna al diluirla puede ocasionar un dficit de este aminocido en el perodo neonatal. Con la dilucin de la leche tampoco en posible solucionar la proporcin relativa de dos minerales importantes como son el calcio (Ca) y el fsforo (P). La leche de vaca contiene 6 veces ms fsforo (P) y 4 veces ms calcio (Ca) que la humana, por lo que una dilucin al 50% no puede corregir la proporcin calcio fsforo. Esto acarrea un estmulo permanente de las glndulas paratiroideas y en consecuencia una excrecin urinaria del exceso de fsforo (lo que podra ser responsable de las tetanias neonatales que ocurren en la primera semana de vida)(Alais,1987). El hecho de que la leche humana sea ms pobre en calcio (un 33% frente a un 118% en la de vaca), cumple una misin muy concreta: favorecer la absorcin intestinal de los lpidos que de otra manera formaran jabones insolubles difciles de absorber. 2.3. Desnaturalizacin de protenas Las protenas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformacin espacial) y as el caracterstico plegamiento de su estructura. Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica. Las protenas recin creadas experimentan una modificacin en la que se agregan tomos o molculas adicionales, como el cobre, zinc y hierro. Una vez que finaliza este proceso, la protena comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrfobos de la protena quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrfilos quedan expuestos al exterior. La forma final de la protena determina cmo interaccionar con el entorno. Si la forma de la protena es alterada por algn factor externo (por ejemplo, aplicndole calor, cidos o lcalis), no es capaz de cumplir su funcin celular. ste es el proceso llamado desnaturalizacin(Santos,1987). 2.4.Cmo la desnaturalizacin afecta a los distintos niveles En la desnaturalizacin de la estructura cuaternaria, las subunidades de protenas se separan o su posicin espacial se corrompen. La desnaturalizacin de la estructura terciaria implica la interrupcin de: Bioqumica de Alimentos-Ing. Livia Gutirrez

Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias a. Enlaces covalentes entre las cadenas laterales de los aminocidos (como los puentes disulfuros entre las Cistenas). b. Enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de aminocidos. c. Enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas laterales no polares de aminocidos. En la desnaturalizacin de la estructura secundaria las protenas pierden todos los patrones de repeticin regulares como las hlices alfa y adoptan formas aleatorias. La estructura primaria, la secuencia de aminocidos ligados por enlaces peptdicos, no es interrumpida por la desnaturalizacin. 2.5. Efecto del pH sobre la estructura de las protenas Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.(Alais,1987). 2.6. Efecto de la temperatura sobre la estructura de las protenas Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.(Alais,1987).

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3.1. Materiales Nombre Vasos de precipitacin Figura

Papel filtro

Embudo de filtracin

Rejilla de asbesto

Gradilla

Cocinilla

3.2. Muestra Nombre Leche Figura

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Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias 3.3. Reactivos Nombre cido actico Figura

Papel pH

Carbonato de sodio

Solucin del fheling A y B

Solucin de Sudam III

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Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias 3.4. Metodologa

Leche

Se precipito (Casena)

Suero

Se analiz las protenas (Biuret)

Se agito hasta neutralizar

Se analiz la grasa (Sudam III)

Hirvi

Liquido claro

Se precipito Hirvi

Se analiz azcar reductor (Fehling A y B)

Se analiz las protenas (Biuret)

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En la figura siguiente se muestra los pasos que se realiz en la prctica en la cual se analizo los componentes de la leche (protena, grasa y azcar reductos) cualitativamente. Precipitacin de la leche: PH inicial = 6.5

Agregar aprox 1.2ml de acido actico para llegar hasta pH 4.5

50 ml de leche

Prec Liq.

Filtrar

Realizar: Anlisis de protena y de grasa

S u e r o

Precip.2
Liq

cl ar o

Realizar: Anlisis de Azcar reductor Figura 1. Anlisis cualitativo de la leche.

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Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias 4.1. Descripcin de los anlisis realizados De la figura anterior, del precipitado 1 y 2 se analizo presencia de protena y grasa de la forma siguiente:

2ml de precipitado + 2ml de reactivo de Biuret(2ml de NaOH +1gota de sulfato de cobre)

Dio coloracin violeta (por presencia de protena)

2ml de precipitado + 4gotas de reactivo de Sudam III

Dio coloracin Rosado (por presencia

de grasa).

Para obtener el precipitado 2, al suero se agrego un poco de bicarbonato de sodio lo cual aumento el pH de 4,5 a 6, luego se someti a ebullicin por 3 minutos, en lo cual se observo la precipitacin de este y finalmente se separo por filtracin obteniendo precipitado 2 y el lquido claro. Del liquido claro se analizo presencia de azcar reductor, para lo cual se tomo:

2 m l de lquido claro + 2 ml de Soluciones de Fheling(A y B)

Cambio de color (indica que hay presencia de azcar reductor)

4.2. Resumen del anlisis cualitativo de la Leche En el cuadro 1, se muestra los anlisis realizados cualitativamente para cada componente de la leche para lo cual se precipito dos veces, primero la leche luego el suero con diferentes reactivos y al final se analizo el liquido claro. Anlisis de protena (Biuret) Positivo Positivo --------------Anlisis de grasa (Sudam III) Positivo Positivo --------------Anlisis de azcar reductor (Fheling A y B) ---------------------------------Positivo

Muestra Precipitado 1 Precipitado 2 Liquido claro

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Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias Discusiones: De acuerdo a la tabla 1, en la primera precipitacin de la leche se observo que posee protena de acuerdo al reactivo de Biuret ya de inmediato viro la coloracin a violeta, mientras que en el segundo precipitado (suero) la color de viraje ya fue mas dbil la cual nos sealara que habr menor cantidad de protena ya que al cortar la leche sus protenas pasan en mayor porcentaje a la cuajada y en menor cantidad al suero. Al respecto Alais menciona que en la leche de vaca cuando se cortan el 80% de protena queda en la cuajada y el 20% queda en el suero. Para obtener el segundo precipitado al suero se le agreg bicarbonato y fue sometido a ebullicin es decir a sometido a temperatura alta, entonces la temperatura alta destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada. Tambin se observo queen ambos precipitados al agregarle el reactivo de Sudam III cambio la mezcla a color rosado lo cual nos indica que hay presencia de grasa en estos, pero se podra mencionar que la cantidad de grasa en estos no ser la misma cantidad ya el primero es directamente de la leche mientras que el segundo se precipito a partir del suero. El anlisis cualitativo realizado de azucares reductores al lquido claro se vio un cambio de color, de color blanco a rojo ladrillo. La reaccin se da en un medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidrxido cprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4.Cuando el Cu(OH)2(color azul)se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma oxido cuproso(color rojo ladrillo).El cambio de color se debe por el cambio de estado de oxidacin de +2 a +1 del cobre.

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1. Cmo se podra evaluar en forma cuantitativa las protenas, carbohidratos y grasa presente en la leche? A. Determinacin de protena en leche A 10ml de muestra agregar 0.4 ml de solucin saturada de oxalato de potasio(K) y 0.5 ml de fenolftalena, agitar y dejar reposar 2 minutos, neutralizar con hidrxido de sodio 0.1 N hasta obtener un color rosa plido, agregar 2 ml de formaldehdo, dejar reposar 2 minutos y titular la nueva acidez producida con hidrxido de sodio0.1N hastaobtener un color rosa plido (el cual perdure por un tiempo de 10 a 15 segundos) que indica el punto final de la reaccin, titular simultneamente un blanco con 10 ml de agua 2 ml de formaldehdo y 0.5 ml de fenolftalena. g/l de protena = (V1-V2) X 1.74 X 10 Dnde: V1= volumen de hidrxido de sodio 0.1N gastados para titular la muestra. V2= a volumen de hidrxido de sodio 0.1N gastados para titular el blanco. 1.74 = factor emprico.10 ml = de la muestra. B. Determinacin de grasa en leche Mtodo de gerber Por lo general consiste en la separacin de la materia grasa por disolucin en cido sulfrico de todos los componentes, seguida por centrifugacin en tubos especialmente calibrados. El mtodo emplea tambin alcohol amlico que ayuda a romper la emulsin de las grasas y previene la carbonizacin de las mismas. Reactivos: H2SO4 PARA Gerber (dens. 1.813-1.817 a 20- aprox 90 %) Alcohol amlico puro (dens. 0,809-0,813 a 20), libre de grasa.

Medir con pipeta 11 ml de H2SO4 para Gerber e introducirlos en el butirmetro evitando mojar las paredes internas del cuello. Luego, agregar con rapidez 11 ml de leche con pipeta aforada, cuidando que forme un estrato encima del cido y no se mezcle con l, e inmediatamente agregar 1 ml de alcohol amlico. Se tapa el butirmetro con el tapn especial correspondiente y se agita en forma efectiva pero con cuidado, teniendo en cuenta que se produce una fuerte elevacin de la temperatura. Se pone el butirmetro en un bao de agua a 6570 C por 5-10 min. (Con el tapn hacia abajo). Retirado del bao, se seca exteriormente y se centrifuga 3-5 min. La centrfuga consiste en un plato chato Bioqumica de Alimentos-Ing. Livia Gutirrez

Universidad Nacional del Centro del Per Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias en el cual, mediante tubos metlicos, se adaptan los butirmetros dispuestos de forma tal que los tapones de cierre queden dirigidos hacia afuera y la porcin graduada hacia el eje de la centrfuga. Se vuelve al bao de agua por 4-5 min., se lee inmediatamente el espesor de la capa de grasa acumulada en la parte superior calibrada del butirmetro. Por ajuste adecuado del tapn de cierre, se puede hacer coincidir la base de la columna de grasa con el cero de la escala. Leyendo a la altura del menisco de la columna de grasa, se obtiene directamente el% de grasa de leche. Si no es posible ajustar la superficie inferior de la columna de grasa a cero, se ajusta a la marca de % completo ms prxima, y se tiene en cuenta al efectuar la lectura del menisco superior. C. Determinacin de carbohidratos totales Normalmente, cuando se hace un anlisis de principios inmediatos se determina: humedad, protena bruta, lpidos (grasa bruta) y cenizas. Los hidratos de carbono normal mente se dan por diferencia. Si queremos evaluar los hidratos de carbono, se siguen las siguientes etapas: a. b. c. d. Desecacin de la muestra. Eliminacin de lpidos (extraccin con ter). Extraccin de hidratos de carbono. Purificacin y cuantificacin por tcnicas cromatogrficas (HPLC).

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Alais L.(1987).Ciencia de la Leche. Editorial. Acribia. Espaa Santos Moreno (1987).Leches y derivados. Editorial Trilla. Mxico

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Clculos realizados Operacin realizada para la preparacin del acido actico al 10% p/v

X=10 g de CH3COOH LUEGO: 100G de reactivo 99.8G DE CH3COOH X de reactivo 10g X = 10.020g de CH3COOH % de p/p (pureza) = 99.8% 10.020g ----------------100% X --------------- 99.8%

X = 10.040g de CH3COOH Densidad de CH3COOH = 1.05 g/ml

Volumen de CH3COOH = 9.56 ml

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