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FACULDADE DE SADE, CINCIAS HUMANAS E TECNOLGICAS DO PIAU NOVAFAPI

Braulio Fernandes de Carvalho rica Suzanne Soares Leal

Influncia da morfologia do ocito em procedimentos de injeo intracitoplasmtica de espermatozide.

TERESINA 2010

Braulio Fernandes de Carvalho rica Suzanne Soares Leal

Influncia da morfologia do ocito em procedimentos de injeo intracitoplasmtica de espermatozide. Monografia apresentada ao Curso de Biomedicina da Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgicas do Piau NOVAFAPI, como requisito parcial para a obteno do grau de Bacharelado em Biomedicina. Orientadora: Profa. Lucielma Salmito S. Pinto Co-orientador: Prof. Luis Evaldo M. Pdua

TERESINA 2010

Braulio Fernandes de Carvalho rica Suzanne Soares Leal

Influncia da morfologia do ocito em procedimentos de injeo intracitoplasmtica de espermatozide.

Monografia apresentada ao Curso de Biomedicina da Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgicas do Piau NOVAFAPI, como requisito parcial para a obteno do grau de Bacharelado em Biomedicina. Orientadora: Profa. Lucielma Salmito Soares Pinto Co-orientador: Prof. Luis Evaldo M. Pdua

A presente monografia foi apresentada e aprovada em 29/05/2010, perante Prof. Lucielma Salmito Soares Pinto (Presidente da banca), Prof. Adriana Maria Viana Nunes Pinheiro (1 Examinadora) e Prof. Fernando Luiz Lima De Oliveira (2 Examinador) e obteve nota 10,00 (dez). Os autos encontram-se nos registros da Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgicas do Piau NOVAFAPI.

TERESINA 2010

Dedicamos esse trabalho, primeiramente a Deus, por nos ter dado fora nos momento mais difceis dessa caminhada; aos nossos pais, pela torcida e incentivo; aos familiares e amigos, pelo apoio; aos nossos mestres que sempre fizeram tudo para nos tornar grandes profissionais. A todos, obrigado!

AGRADECIMENTOS A Deus, por sua infinita graa e magnfica fora, impulsionando-nos rumo a essa trajetria em busca de um sonho, que muitas vezes hesitamos, achando que no iramos realiz-lo, esquecendo-nos quo forte e poderoso Tu s! A Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgicas do Piau NOVAFAPI, em especial Dra. Cristina Maria Miranda de Sousa, nosso muito obrigado por nos proporcionar o ensinamento da especialidade: BIOMDICO. A coordenao do curso de Biomedicina, nas pessoas do Professor Dr. Paulo Henrique e Tereza Cristina, que com sabedoria, arquitetou os melhores projetos, sempre tentando fazer com que as coisas pudessem ser quase perfeitas, dentro do nosso universo. Aos mestres e doutores da arte de ensinar: Adalberto Socorro Da Silva, Adriana Maria Viana Nunes Pinheiro, Alessandra Lages Oliveira De Azevedo, Ana Amlia de Carvalho Melo Cavalcante, Bismark Azevedo, Antonio Pereira Filho, Carla Maria De Carvalho Leite Leal Nunes, Danielle Da Cruz Araujo, Daniela Moura Parente, Dbora Cavalcante Braz, Elisa Aparecida Alves Paiva, Fabricio Amaral, Fabricio Ibiapina Tapety, Francilio De Carvalho Oliveira, Fernando Luis Lima de Oliveira, Gleydson Vilanova Viana Coelho, Iraci De Melo Salmito Noleto, Jeane Rodrigues De Abreu, Jose Flamarion Moura Do Vale, Josie Hayde Lima Ferreira, Ktia Bonfim, Lucielma Salmito Soares Pinto, Ludmila Tolstenko Nogueira, Marcia Alexandra Ribeiro Raulino, Maria Do Carmo Teixeira Veloso, Maria Do Rosrio Conceio Moura Nunes, Maria Jos Soares Monte, Mario Raulino Filho, Mitra Mobin, Nvia Maria Carneiro Farias Castro, Sarah Jane De Araujo Barros, Paulo Sobral Junior, Tnia Maria Baslio Quezado De Castro, Tanit Clementino Santos, Tatiana Vieira Souza Chaves, Terezinha de Jesus Rios Nogueira, Valeria Claudiane Simeo Oliveira. orientadora Professora Lucielma Salmito Soares Pinto, ao Co-Orientador Luis Evaldo de Moura Pdua e colaboradora Ingridi de Sousa Sene, pela chance de aprender que nos foi dada, de nos fazer ir mais do que pensamos ir, de realizar mais do que pensvamos ser possvel, de ser mais do que ramos antes. A todos os funcionrios, da Clnica CRIAR e Clnica da NOVAFAPI que nos concedeu a primeira oportunidade de realizar a experincia profissional, que

estiveram conosco nos dias mais annimos, nas horas mais simples, a todos os pequenos gestos, as pequenas atenes... Aos colegas de faculdade, pela companhia durante esses quatro anos, pelo apoio, crticas construtivas, pelos inesquecveis momentos de alegria e companheirismo, e pela slida amizade que construmos, a qual temos a certeza que ser para sempre! Obrigado por crescerem conosco!

O homem, com suas nobres qualidades, ainda carrega no corpo a marca indelvel de sua origem modesta. Charles Darwin

RESUMO

As tcnicas de reproduo assistida so usadas para tratar casais infrteis, que tentam engravidar h pelo menos um ano sem contraceptivos. A tcnica mais utilizada a de injeo intracitoplasmtica do espermatozide (ICSI), que trouxe grande avano e permitiu analisar caractersticas mais intrnsecas do ocito. O objetivo desse trabalho foi avaliar os parmetros morfolgicos do ocito e correlacionar com taxa de fertilizao, morfologia normal do pr-ncleo, qualidade embrionria e gravidez. Para essa avaliao foi realizado estudo retrospectivo longitudinal descritivo que analisou pronturios de 147 pacientes submetidas a tratamento de FIV, com 1177 com ocitos em metfase II para os seguintes parmetros: alterao da forma e da zona pelcida; citoplasma granular, citoplasma enegrecido, membrana plasmtica resistente e sem resistncia; espao perivitelnico aumentado e com debris; corpsculo polar fragmentado; citoplasma granular e enegrecido; presena de vacolos e corpos refrteis; retculo endoplasmtico agregado; morfologia e tamanho dos pr-ncleos; prncleo no centralizado; nmero, assimetria, alterao e fragmentao dos blastmeros relacionados com os 2 e 3 dias de cul tivo; presena de halo; nmero de nuclolos e nuclolos no pareados. Para a anlise estatstica utilizouse o teste de Pearson qui-quadrado, estabelecido o nvel de significncia em p < 0.05. Obteve-se correlao da membrana plasmtica sem resistncia com diminuio a taxa de fertilizao e espao perivitelnico aumentado com aumento da taxa de fertilizao; membrana plasmtica sem resistncia associada a diminuio da qualidade da morfologia do pr-ncleo; morfologia alterada do prncleo relacionada a diminuio da qualidade embrionria; membrana plasmtica sem resistncia e qualidade do embrio no dia 2 de cultivo associadas a diminuio da gravidez e corpos refrteis relacionados ao aumento da taxa de gravidez. Os parmetros morfolgicos podem predizer resultados em fertilizao in vitro e devem ser utilizados para ajudar a prtica clnica em reproduo assistida.

ABSTRACT

The assisted reproductive techniques are used to treat infertile couples trying to conceive for at least a year without contraception. The most used technique is intracytoplasmic sperm injection (ICSI), which brought advance and allowed to analyze more intrinsic characteristics of the oocyte. The aim of this study was to evaluate the morphological parameters and correlate with oocyte fertilization rate, normal morphology of the pronucleus, embryo quality and pregnancy. For this evaluation was conducted a retrospective longitudinal descriptive study that analyzed medical records of 147 patients undergoing IVF treatment, with 1177 oocytes in metaphase II, for the following parameters: changes in the shape and the zona pellucida, cytoplasm, granular and dark cytoplasm, tough and fragile membrane, debris and increased perivitelline space, fragmented polar body, presence of vacuoles and refracting bodies, endoplasmic reticulum aggregate; morphology and size of pronuclei; pronuclei not centralized, number, asymmetry, alteration and fragmentation of blastomeres related to days 2 and 3 of culture, presence of halo, number of nucleoli and unpaired nuclei. For statistical analysis was used the Pearson chi-square test, significance level set at p <0.05. Was obtained correlation between the plasma membrane resistance to decrease the fertilization rate and the enlarged perivitelline space increased the rate of fertilization; plasma membrane without resistance was associated with decreased quality of the morphology of the pronucleus; altered morphology of the pronucleus related decreasing at embryo quality; plasma membrane without resistance and embryo quality on day 2 of culture were associated with decreasing at pregnancy rate; refracting bodies were related to increasing pregnancy rates. The morphological parameters may predict outcome result at in vitro fertilization and should be used to help at assisted reproduction

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Anlise univariada do ndice de fertilizao in vitro em funo de caracteres morfolgicos do ocito. 26

Tabela 2.

Anlise univariada da influncia da morfologia do ocito na qualidade da morfologia do pr-ncleo. 29

Tabela 3.

Anlise univariada da influncia da morfologia do pr-ncleo com a qualidade embrionria nos dias 2 e 3 de cultivo. 30

Tabela 4.

Anlise univariada da taxa de gravidez de acordo com morfologia do ocito, pr-ncleo e embrio. 32

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

FIV FSH GnRH hCG ICSI IIU LH RA TRA

Fertilizao in vitro Hormnio folculo-estimulante Hormnio liberador da gonadotrofina Gonadotrofina corinica recombinante Injeo intracitoplasmtica de espermatozide Inseminao intra-uterina Hormnio luteinizante Reproduo assistida Tcnicas de reproduo assistida

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SMARIO

1. 2.

INTRODUO REFERENCIAL TERICO 2.1 Aspectos Gerais da Reproduo Assistida (RA) 2.2 Tcnicas de Reproduo Assistida 2.3 Fertilizao in vitro (FIV) 2.4 Estimulao da ovulao 2.5 Manipulao dos gametas 2.6 Transferncia embrionria 2.7 Morfologia do ovcito e embrio

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19 3. METODOLOGIA 3.1 3.2 Caractersticas das amostras e estudo Caractersticas do ciclo 3.2.1 3.2.2 3.3 3.4 4. Hiperestimulao ovariana Aspirao folicular 21 21 21 21 22 23 23

Caractersticas do ocito e embrio Anlise estatstica

CAPTULO 1: INFLUNCIA DA MORFOLOGIA DO OCITO EM PROCEDIMENTOS DE INJEO INTRACITOPLASMTICA DE ESPERMATOZIDE. INTRODUO MTODOS RESULTADOS Relao entre morfologia do ocito e taxa de fertilizao Relao entre morfologia do ocito e qualidade da morfologia do pr-ncleo Relao da morfologia do pr-ncleo com a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo 30 29 27 24 25 26 27

Relao das morfologias do ocito, pr-ncleos e

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embrio nos dias 2 e 3 de cultivo com a taxa de gravidez DISCUSSO Relao entre morfologia do ocito e taxa de fertilizao Relao entre morfologia do ocito e qualidade da morfologia do pr-ncleo Relao da morfologia do pr-ncleo com a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo Relao das morfologias do ocito, pr-ncleos e embrio nos dias 2 e 3 de cultivo com a taxa de gravidez 5. CONSIDERAES FINAIS REFERNCIAS ANEXO 36 38 39 40 36 35 34 31 34

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1. INTRODUO

Reproduo Assistida (RA) um conjunto de tcnicas, utilizadas por mdicos especialistas, que tem como principal objetivo tentar viabilizar a gestao em mulheres com dificuldades de engravidar. Muitas vezes essas dificuldades podem ser de um dos membros ou mesmo do casal, trazendo srios prejuzos ao relacionamento conjugal. O sucesso das tcnicas de reproduo assistida (TRA) depende da eficincia individual de cada procedimento. Apesar dos grandes avanos obtidos por essas tcnicas, as taxas de gravidez por ciclo permanecem em torno de 25-30%. A transferncia de um nmero maior de embries uma estratgia para assegurar boas taxas de gravidez, mas resulta no aumento de gestaes mltiplas, podendo acarretar gestaes de risco tanto para a me quanto para o feto (CAMARGOS et al, 2007). O nmero excessivo de embries resulta da fertilizao de nmero maior de ovcitos que o nmero de embries desejados. Essa prtica se justifica, pois a taxa de fertilizao acha-se em torno de 60 a 70 % na maioria das clnicas. Apesar disso, o ideal seria fertilizar apenas o nmero de ovcitos correspondente aos embries desejados, o que pode reduzir os custos do laboratrio e evitar embries excedentes (EBNER, et al, 1999). Mas para isso seria necessrio ter certeza razovel de que todos ou quase todos os ovcitos tratados fossem fertilizados. Isto cria a necessidade de escolher quais ovcitos devero ser injetados, seja por no desejo de congelamento de embries por parte do casal, seja por existir nmero grande de ovcitos recuperados (AGGELIS, et al, 2006). A tcnica de injeo intracitoplasmtica de espermatozide (ICSI) trouxe um avano na avaliao de muitos parmetros morfolgicos oocitrios. Alm dos parmetros normalmente avaliados, como a alterao da forma, a colorao e a granulao do citoplasma, alterao da zona pelcida, o tamanho do espao perivitelnico, a presena de vacolos, e do primeiro corpsculo polar, tornou-se possvel avaliar novas caractersticas, como a resistncia da membrana plasmtica e a fluidez do citoplasma (EBNER, et al, 2005). O procedimento de ICSI consiste em injetar um espermatozide previamente selecionado atravs de uma microinjeo no citoplasma do ocito. A membrana plasmtica do

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espermatozide se dissolve e libera seu material gentico, que pareia com o material gentico do vulo e origina uma clula diplide, o embrio. Aps esse evento, a fertilizao confirmada com o aparecimento do pr-ncleo (ABDELMASSIH, 2001). A morfologia do ocito e do zigoto pode ser utilizada para a seleo de embries com alto poder de implantao, podendo, ainda, predizer alteraes genticas ou citoplasmticas. O objetivo deste estudo foi correlacionar os parmetros morfolgicos dos ocitos com resultados clnicos aps procedimento de ICSI.

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2. REFERENCIAL TERICO

2.1. Aspectos Gerais da Reproduo Assistida (RA)

Infertilidade conjugal significa a ausncia de gravidez aps um ano de relaes sexuais sem mtodos anticoncepcionais e demonstrada nas seguintes porcentagens: 35% de causas femininas, 35% de causas masculinas, 15% de causas combinadas nos casais, 10% de infertilidade sem causa aparente e 5% de infertilidade por fatores diversos (LOPES et al., 2006). Reproduo assistida um conjunto de tcnicas voltadas ao tratamento da infertilidade, onde uma equipe tem participao direta no acompanhamento do desenvolvimento folicular, da deteco e induo da ovulao, do encontro dos gametas e da otimizao fase ltea (CORNEL et al., 2006). As solues em TRA envolvem desde processos mais simples de tratamento clnico, como a correo medicamentosa de distrbios hormonais que impedem a mulher de ovular regularmente at procedimentos de FIV (LOPES et al., 2006). Os procedimentos de FIV visam corrigir falhas na fertilizao. A fertilizao ocorre quando o gameta feminino, o vulo, fecundado por um gameta masculino, o espermatozide, ocorrendo a mistura do seu material gentico. O zigoto, resultado da fecundao dos gametas, tem ento 46 cromossomos, 23 oriundos do vulo e 23 oriundos do espermatozide. As fases seguintes de desenvolvimento embrionrio do zigoto so a mrula, resultado de sucessivas divises celulares sem o aumento do tamanho celular (clivagens) e o blastocisto, formado pela organizao celular e formao de uma cavidade (blastocele), bem visvel ao microscpio estereoscpico (CAMARGOS et al., 2007).

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2.2. Tcnicas de Reproduo Assistida

As TRA podem ser divididas em mtodos de baixa e alta complexidade. Entre as tcnicas de baixa complexidade podemos incluir o coito programado e a inseminao intra-uterina (IIU), que apresentam a vantagem de menores custos, alm de no precisarem ser realizadas em centros de reproduo assistida. Entre as tcnicas de alta complexidade inclumos a FIV convencional e a ICSI (ABDELMASSIH, 2001). A inseminao artificial consiste no depsito do smen ou

espermatozides diretamente no aparelho genital feminino (vagina, colo uterino ou dentro do tero) com o uso de uma cnula ou sonda. Nesta tcnica, a fecundao acontece dentro do corpo da mulher, uma vez que os

espermatozides so previamente capacitados e selecionados conforme sua boa morfologia e motilidade (CORNEL et al., 2006). No coito programado o casal orientado a manter relao sexual vaginal no momento em que a mulher est ovulando (ALLEN et al. , 1985).

2.3. Fertilizao in vitro (FIV)

A tcnica da FIV tem como objetivo promover a fertilizao. Um nico espermatozide injetado dentro de cada vulo com o auxilio de uma micropipeta e de um microscpio. Essa tcnica pode ser dividida em cinco etapas, estimulao da ovulao, coleta dos vulos, manipulao dos gametas transferncia dos embries, suporte da fase ltea (CAMARGOS, 2008).

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2.4. Estimulao da ovulao;

Muitos protocolos de estimulao controlada da ovulao foram propostos, o mais utilizado o do bloqueio hipofisrio seguido de estimulao ovariana com doses decrescentes de gonadotrofinas. Para o bloqueio do eixo, utilizam-se os agonistas do GnRH (GnRHa), o que provoca um bloqueio hormonal seletivo na secreo de FSH e LH pela hipfise. O protocolo mais utilizado o protocolo longo com administrao de GnRHa iniciada na fase ltea do ciclo prvio ao tratamento, durante um perodo de 14 dias. A presena do bloqueio identificada pela ausncia de cistos ovarianos e pela baixa dosagem de estradiol plasmtico (< 30 pg/ml) (ABDELMASSIH et al.,1993).A coleta dos vulos realizada por via transvaginal,, sob orientao ecogrfica. Aps cuidadosa anti-sepsia vaginal, fazse uma sedao leve usando um sedativo de ao ultracurta. Com a paciente anestesiada, d-se incio puno. Aps a aspirao de todos os folculos retirase o transdutor e a agulha, procedendo, a seguir uma reviso cuidadosa do fundo de saco, evitando-se hemorragias (ABDELMASSIH et al.,1993). Aps a coleta ovular, os folculos so limpos sendo removidas as clulas da granulosa (complexo cmulos ooforos). Onde depois sero identificados e classificados quanto a maturidade. Posteriormente, so transferidos para uma placa contendo meio de cultura onde permanecem at o momento da fertilizao.A manipulao do gameta, masculino feita atravs da masturbao .. Com o material coletado faz-se uma analise da concentrao de espermatozides mveis e calcula-se o volume. O smen passa por um processo der melhoramento seminal chamado de gradiente de Percoll.

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2.5. Manipulao dos gametas;

Depois do processo de seleo dos gametas empregada a tcnica de ICSI, os ocitos coletados so colocados individualmente em microgotas numeradas de soluo viscosa para diminuir a motilidade e facilitar a imobilizao dos mesmos para, ento, serem injetados. O ocito ser fixado por uma micropipeta de suco e o espermatozide aspirado dentro da pipeta de injeo por meio de micromanipulador. A injeo feita em ocitos em estgio de metfase II com o seu primeiro corpsculo polar posicionado em seis ou 12 horas. Antes de ser iniciada a injeo, os ocitos foram filmados e fotografados para posterior avaliao morfolgica e morfomtrica (CAMARGOS, 2007).

2.6. Transferncia embrionria;

A transferncia dos embries feita em um perodo de 3-5 dias, atravs de um cateter contendo os embries. Uma vez posicionado o cateter, injetam-se os embries, delicadamente, mantendo-se o mbolo pressionado durante uns segundo. Doze dias aps a transferncia feito o teste para saber se a gravidez positiva, sendo confirmada feito o acompanhamento da fase ltea.

2.7. Morfologia do ovcito e embrio

Antes da ICSI so avaliados vrios parmetros no ocito. O espao perivitelnico ausente quando o citoplasma esta em contato com a zona pelcida na maior parte do seu permetro e como aumentado quando h espao entre a zona pelcida e o citoplasma. Presena de debris quando se observam excluses citoplasmticas no espao perivitelnico. O 1 corpsculo polar foi caracterizado como integral quando se apresenta sem divises e como fragmentado quando

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est dividido em duas ou mais partes. A qualidade citoplasmtica dos ovcitos classificada como granular se houvesse regies de citoplasma escuro e normal quando as mesmas no eram observadas, citoplasma granular aparncia de areia no citoplasma. Presena de vacolos e corpos refrteis e retculo endoplasmtico agregado. No embrio, os pr-ncleos so caractersticas determinantes para fertilizao. Sendo avaliados o tamanho, assimetria, e centralizao. Outra caracterstica importante a alterao e fragmentao dos blastmeros, onde ele se divide em vrios fragmentos, dificultando a ICSI. Presena de halo, nmero de nuclolos e nuclolos no pareados tambm so avaliadas quanto morfologia do embrio.

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3. MATERIAS E MTODOS

3.1. Tipo de estudo e caractersticas das amostras

Este estudo retrospectivo longitudinal descritivo analisou pronturios de 147 pacientes submetidas a tratamentos de FIV em clnica de reproduo humana de Teresina-PI, durante o ano de 2008. A mdia de idade das pacientes foi de 35,25 anos, com desvio padro de 6,39 anos. Como critrios de incluso utilizou-se pacientes com ocitos em metfase II e espermatozides considerados de morfologia normal em exame fresco. Como critrios de excluso utilizou-se pacientes com ocitos imaturos (metfase I) e espermatozide de morfologia alterada em exame fresco. Devido ao fato de muitos pacientes serem de outras cidades, no se tem dados atualizados de contato, no sendo aplicvel Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Assim, aplicou-se Termo de Fiel Depositrio ao responsvel administrativo pela clnica de reproduo humana.

3.2. Caractersticas do ciclo

3.2.1. Hiperestimulao ovariana

Utilizou-se hormnio liberador de gonadotrofinas (GnRH-a) para bloqueio hipofisrio (Lupron Depot, 5 ou 10 UI) por 10 dias a partir do 21 dia do ciclo anterior ao estmulo. Foi confirmada a supresso ovariana mediante avaliao ultra-sonogrfica transvaginal e medio do hormnio estradiol. A

hiperestimulao ovariana foi realizada pela administrao de hormnio folculoestimulante recombinante (FSH: Gonal-F, Serono), sendo que a dose da droga foi ajustada de acordo com a idade, ndice de massa corprea, nmero de

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folculos antrais, FSH, LH. Administrou-se a dose de 250 mg de gonadotrofina corinica recombinante (hCG: Ovidrel, Serono) na presena de pelo menos dois folculos com dimetro mdio acima de 18 mm.

3.2.2. Aspirao folicular

A aspirao dos ovcitos foi realizada entre 35 e 36 horas aps a administrao do hCG. Os ovcitos foram separados do lquido folicular sob estereoscpio e lavados em meio de cultura HTF modificado com HEPES (Irvine Scientific), suplementado com 10% de soro sinttico substitutivo (SSS - Irvine Scientific) antes de serem transferidos em meio de cultura HTF (Irvine Scientific) suplementado com 10% de SSS e incubados na estufa de 37C/colocar 5% CO2 em ar. A remoo das clulas do cumulus oophorus foi realizada com hialuronidase (H-4272, Sigma) na concentrao de 80 UI/mL em meio HTF modificado com HEPES suplementado com 10% SSS, usando micropipetas de vidro. Aps a limpeza dos ovcitos, eles permaneceram incubados na estufa em meio de cultura HTF suplementado com 10% SSS at a realizao da ICSI.

3.3. Caracteristicas do ocito e embrio

Alterao da forma e da zona pelcida; citoplasma granular, citoplasma enegrecido, membrana plasmtica resistente/sem resistncia; espao

perivitelnico aumentado e com debris; corpsculo polar fragmentado; citoplasma granular e enegrecido; presena de vacolos e corpos refrateis; retculo endoplsmatico agregado. Morfologia e tamanho dos pr-ncleos; pr-ncleo

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no centralizado; nmero, assimetria, alterao e fragmentao dos blastmeors relacionados com os 2 e 3 dias de cultivo; presen a de halo; nmero de nuclolos e nuclolos no pareados.

3.4. Anlise estatstica

Utilizou-se planilhas eletrnicas de Excel e programa BioEstat 5.0 para a organizao e anlise estatstica para subseqente correlao parmetros morfolgicos do ocito com a ocorrncia de fertilizao, qualidade embrionria e transferncia embrionria. Para anlise estatstica utilizou-se o teste de Pearson qui-quadrado, estabelecido o nvel de significncia em p < 0.05. Verificou-se 1177 ocitos para anlise da taxa de fertilizao; 799 embries para anlise de morfologia do pr-ncleo e embrio (considerados apenas ocitos fertilizados); e 407 embries transferidos para avaliar a taxa de gravidez (apenas ciclos de transferncia nica).

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4. CAPTULO I: INFLUNCIA DA MORFOLOGIA DO OCITO EM PROCEDIMENTOS DE INJEO INTRACITOPLASMTICA DE ESPERMATOZIDE.

INFLUENCE OF THE OOCYTE MORPHOLOGY AT INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION PROCEDURES

Braulio Fernandes de Carvalho1 hazbio@gmail.com rica Suzanne Soares Leal1 ericasuzany@hotmail.com Ingridi de Sousa Sene2 ingsene@ig.com.br Luis Evaldo Moura Pdua3 lempadua@ufpi.br Lucielma Salmito Soares Pinto1 lucielma@yahoo.com.br

1 Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgica do Piau- NOVAFAPI 2 CRIAR Clnicas de Reproduo Humana 3 Universidade Federal do Piau UFPI

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INTRODUO

A preocupao atual dos centros de reproduo assistida reduzir o nmero de embries transferidos ao mnimo, para evitar a chance de gestao mltipla e seus riscos para a me e para o feto (AGELLIS et al., 2006). A introduo da tcnica da ICSI, procedimento mais invasivo que as tcnicas convencionais, possibilitou analisar novos parmetros morfolgicos do ocito e associ-los a taxas de fertilizao, clivagem e desenvolvimento embrionrio (CIOTTI et al., 2004). A utilizao de critrios morfolgicos obtidos por meio da microscopia ptica um subsdio importante para o embriologista em servios de reproduo humana, tanto no momento da escolha do ocito para a ICSI, como da seleo do embrio a ser transferido para o tero materno, com o objetivo de melhorar a taxa de gravidez (ENCHENLAUB et al., 1995). O objetivo desse trabalho foi verificar a possibilidade de se selecionar ocitos atravs da morfologia que resultariam em maior taxa de fertilizao, prncleo de morfologia normal, embrio de qualidade e taxa de gravidez.

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MTODOS

Este estudo retrospectivo longitudinal descritivo analisou pronturios de 147 pacientes submetidas a tratamentos de FIV em clnica de reproduo humana de Teresina-PI, durante o ano de 2008. A mdia de idade das pacientes foi de 35,25 anos, com desvio padro de 6,39 anos. Como critrios de incluso utilizou-se pacientes com ocitos em metfase II e espermatozides considerados de morfologia normal em exame fresco. Como critrios de excluso utilizou-se pacientes com ocitos imaturos (metfase I) e espermatozide de morfologia alterada em exame fresco.Devido ao fato de muitos pacientes serem de outras cidades, no se tem dados atualizados de contato, no sendo aplicvel Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Assim, aplicou-se Termo de Fiel Depositrio ao responsvel administrativo pela clnica de reproduo humana. As caractersticas do ciclo seguem a metodologia proposta por Balaban et al. (2007). As caractersticas morfolgicas analisadas de ocito e embrio so a alterao da forma e da zona pelcida; citoplasma granular, citoplasma enegrecido, membrana plasmtica resistente/sem resistncia; espao

perivitelnico aumentado e com debris; corpsculo polar fragmentado; citoplasma granular e enegrecido; presena de vacolos e corpos refrteis; retculo endoplasmtico agregado; morfologia e tamanho dos pr-ncleos; pr-ncleo no centralizado; nmero, assimetria, alterao e fragmentao dos blastmeros relacionados com os 2 e 3 dias de cultivo; presen a de halo; nmero de nuclolos e nuclolos no pareados. Utilizou-se planilhas eletrnicas de Excel e programa BioEstat 5.0 para a organizao e anlise estatstica para subseqente correlao parmetros morfolgicos do ocito com a ocorrncia de fertilizao, qualidade embrionria e transferncia embrionria. Para anlise estatstica utilizou-se o teste de Pearson qui-quadrado, estabelecido o nvel de significncia em p < 0.05. Verificou-se 1177 ocitos para anlise da taxa de fertilizao; 799 embries para anlise de morfologia do pr-ncleo e embrio (considerados apenas ocitos fertilizados); e 407 embries transferidos para avaliar a taxa de gravidez (apenas ciclos de transferncia nica).

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RESULTADOS

Relao entre morfologia do ocito e taxa de fertilizao

A anlise univariada mostrou que a membrana plasmtica sem resistncia reduziu significativamente a taxa de fertilizao (p=0.0001), enquanto que o espao perivitelnico aumentado no contribuiu negativamente para a fertilizao (p=0.0345). Apesar de no serem estatisticamente significantes, o citoplasma granular e a membrana plasmtica resistente influenciaram negativamente a fertilizao, enquanto o aspecto geral normal do ocito no contribuiu para aumento da fertilizao. As demais caractersticas avaliadas no demonstraram associao importante com a taxa de fertilizao (Tabela 1).

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Tabela 1. Anlise univariada do ndice de fertilizao em funo de caracteres morfolgicos do ocito. Caracterstica do ocito Ocitos Ocitos no fertilizados fertilizados Presente Ausente Alterao de forma Presente Ausente Alterao da zona pelcida Presente Ausente Membrana plasmtica sem Presente resistncia Ausente Membrana plasmtica Presente resistente Ausente Espao perivitelnico Presente aumentado Ausente Espao perivitelnico com Presente debris Ausente Corpsculo polar Presente fragmentado Ausente Citoplasma granular Presente Ausente Citoplasma enegrecido Presente Ausente Vacolos Presente Ausente Corpos refrteis Presente Ausente Retculo endoplasmtico Presente agregado Ausente Aspecto geral normal n 62 851 203 710 334 579 54 859 45 859 679 234 655 258 206 706 301 612 1 912 59 854 630 283 2 911 % 6,79 93,21 22,23 77,77 36,58 63,42 5,91 94,09 4,93 95,07 74,37 25,63 71,74 32,97 22,59 77,41 32,97 67,03 0,11 99,89 6,46 93,54 69,00 31,00 0,22 99,78 n 27 237 67 197 107 157 44 220 20 244 179 85 187 77 57 207 102 162 1 263 22 242 190 74 2 262 % 10,23 89,77 23,58 74,62 40,53 59,47 16,67 83,33 7,58 92,42 67,80 32,20 70,83 29,17 21,59 78,41 38,64 61,36 0,38 99,62 8,33 91,67 71,97 28,03 0,76 99,24 p 0.0629 0.2845 0.2432 0.0001 0.0973 0.0345 0.7733 0.7321 0.0874 0.3495 0.2902 0.3558 0.1854

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Relao entre morfologia do ocito e qualidade da morfologia do pr-ncleo

A anlise univariada mostrou que a membrana plasmtica sem resistncia do ocito reduziu significativamente a qualidade da morfologia do pr-ncleo (p=0.0305). A alterao de forma do ocito tambm resultou em reduo da qualidade da morfologia do pr-ncleo, porm no houve diferena significante estatisticamente. As demais caractersticas do ocito no influenciaram significativamente a qualidade da morfologia do pr-ncleo (Tabela 2).

Tabela 2. Anlise univariada da influncia da morfologia do ocito na qualidade da morfologia do pr-ncleo. Caracterstica do ocito Morfologia Morfologia normal do pr- anormal do prncleo ncleo N % n % p Aspecto geral normal Presente 32 7,19 29 8,19 0.5966 Ausente 413 92,81 325 91,81 Alterao de forma Presente 89 20,00 91 25,70 0.0619 Ausente 356 80,00 263 74,30 Alterao da zona Presente 161 36,18 133 37,57 0.6855 pelcida Ausente 284 63,82 221 62,43 Membrana plasmtica Presente 20 4,50 29 8,20 0.0305 sem resistncia Ausente 425 95,50 325 91,80 Membrana plasmtica Presente 21 4,72 19 5,37 0.6711 resistente Ausente 424 95,28 335 94,63 Espao perivitelnico Presente 351 78,88 269 75,99 0.3308 aumentado Ausente 94 21,12 85 24,01 Espao perivitelnico Presente 327 73,49 276 77,97 0.4190 com debris Ausente 118 26,51 78 22,03 Corpsculo polar Presente 100 22,47 86 24,29 0.5450 fragmentado Ausente 345 77,53 268 75,71 Citoplasma granular Presente 146 32,8 123 34,74 0.5650 Ausente 299 67,2 231 65,26 Vacolos Presente 29 6,51 24 6,77 0.8821 Ausente 416 93,49 330 93,23 Corpos refrteis Presente 318 71,46 250 70,62 0.7949 Ausente 127 28,54 104 29,38

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Relao da morfologia do pr-ncleo com a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo

Observou-se que a morfologia do pr-ncleo alterada influenciou negativamente todos os aspectos avaliados para aferir a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo, com significncia estatstica. No segundo dia de cultivo, notou-se que a morfologia anmala do pr-ncleo influenciou negativamente a qualidade embrionria, com relao s caractersticas de clulas alteradas (p<0.0001), fragmentao igual ou superior a 10% (p<0.0001) e assimetria de clulas (p=0.0002). O mesmo foi verificado para o dia 3 de cultivo, com clulas alteradas (p<0.0001), fragmentao igual ou superior a 10% (p<0.0001) e assimetria de clulas (p<0.0001) (Tabela 3).

Tabela 3. Anlise univariada da influncia da morfologia do pr-ncleo com a qualidade embrionria nos dias 2 e 3 de cultivo. Caracterstica do Morfologia Morfologia embrio normal do pr- anormal do prncleo ncleo n 2 dia de cultivo Clulas alteradas Fragmentao 10% Assimetria de clulas 3 dia de cultivo Clulas alteradas Fragmentao 10% Assimetria de clulas Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente 135 310 24 421 140 305 101 245 34 312 62 284 % 30,34 69,66 5,39 94,61 31,46 68,54 22,7 77,3 7,64 92,36 13,93 86,07 n 266 88 59 295 156 198 181 84 58 207 96 169 % 75,14 24,86 16,66 83,34 44,06 55,94 51,13 48,87 16,38 83,62 27,11 72,89 p <0.0001 <0.0001 0.0002

<0.0001 <0.0001 <0.0001

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Relao das morfologias do ocito, pr-ncleos e embrio nos dias 2 e 3 de cultivo com a taxa de gravidez

Das caractersticas morfolgicas do ocito avaliadas, a alterao de forma alterada no afetou negativamente a gravidez (p=0.0031), assim como a presena de corpos refrteis (p=0.02). J a caracterstica de membrana plasmtica sem resistncia foi fortemente associada com a diminuio da taxa de gravidez (p=0.0373). As demais caractersticas do ocito no tiveram influncia sobre a taxa de gravidez (Tabela 4). A morfologia do pr-ncleo no apresentou nenhuma caracterstica diretamente correlacionada a taxa de gravidez. Verificou-se, no entanto, que a morfologia do embrio no 2 dia de cultivo correlac iona clulas alteradas a uma diminuio de gravidez (p=0.0360). As demais caractersticas morfolgicas do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo no representaram alterao significativa na taxa de gravidez (Tabela 4).

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Tabela 4. Anlise univariada da taxa de gravidez de acordo com morfologia do ocito, pr-ncleo e embrio. Caractersticas Morfolgicas Gravidez Ausncia de Gravidez n % n % p Ocito Aspecto geral normal Presente 9 5,29 17 7,170 0.4446 Ausente 161 94,71 220 92,83 Ocito forma alterada Presente 47 27,64 37 15,61 0.0031 Ausente 123 72,36 200 84,39 Alterao da zona pelcida Presente 63 37,05 102 43,03 0.2256 Ausente 107 62,95 135 56,97 Membrana plasmtica sem Presente 3 1,76 14 5,90 0.0373 resistncia Ausente 169 98,24 223 94,10 Membrana plasmtica Presente 8 4,70 10 4,210 0.8139 resistente Ausente 162 95,3 227 95,79 141 82,94 182 76,79 Espao perivitelnico Presente 0.1307 aumentado Ausente 29 17,06 55 23,21 Espao perivitelnico com Presente 138 81,17 184 77,63 0.552 debris Ausente 32 18,83 53 22,37 Corpsculo polar Presente 44 25,88 49 20,67 0.2735 fragmentado Ausente 126 74,12 182 79,33 Citoplasma granular Presente 59 34,70 94 39,66 0.3086 Ausente 111 65,30 143 60,34 Vacolos Presente 9 5,29 18 7,59 0.3577 Ausente 161 94,71 219 92,41 Corpos refrteis Presente 132 77,64 159 67,08 0.0200 Ausente 38 22,36 78 32,92

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Tabela 4. Anlise univariada da taxa de gravidez de acordo com morfologia do ocito, pr-ncleo e embrio. Caractersticas Morfolgicas Gravidez Ausncia de Gravidez n % n % p Pr-ncleo Corpsculo polar Presente 10 5,88 14 5,90 0.9916 fragmentado na fertilizao Ausente 160 94,12 223 94,10 Halo Presente 152 89,41 218 91,98 0.3735 Ausente 18 10,59 19 8,02 Pr-ncleos no Presente 39 22,94 49 20,67 0.5839 centralizados Ausente 131 77,06 188 79,33 Nuclolos iguais em nmero Presente 86 50,58 126 53,16 0.6079 Ausente 84 49,42 111 46,84 Nuclolos no pareados Presente 83 48,82 118 49,78 0.8476 Ausente 87 51,18 119 50,22 48 28,23 76 32,06 Pr-ncleos simtricos Presente 0.4074 Ausente 122 71,77 161 67,94 Nuclolos no polarizados Presente 123 72,35 179 75,52 0.5984 Ausente 45 27,65 58 24,48 Embrio no 2 dia de cultivo Clulas alteradas Presente 64 37,64 114 48,10 0.0360 Ausente 106 62,36 123 51,90 Presente 9 5,29 19 8,01 Fragmentao 10% 0.2845 Ausente 161 94,71 218 91,99 Assimetria de clulas Presente 53 31,17 68 28,69 0.5886 Ausente 117 68,83 169 71,31 Embrio no 3 dia de cultivo Clulas alteradas Presente 35 20,58 46 19,40 0.5302 Ausente 97 79,42 108 80,6 Presente 9 5,29 16 6,75 Fragmentao 10% 0.2864 Ausente 123 94,71 138 93,25 Assimetria de clulas Presente 13 7,64 23 9,70 0.1961 Ausente 119 92,36 131 90,30

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DISCUSSO

Relao entre morfologia do ocito e taxa de fertilizao

A morfologia do ocito mostrou correlao estatstica com a fertilizao. Entretanto, a quantidade de ocitos sem alteraes morfolgicas muito reduzida para esse parmetro ser levado em conta na prtica clnica, principalmente em se tratando de ocitos obtidos em clnicas de reproduo humana, onde os paciente que procuram esse tratamento apresentam alguma causa de infertilidade que pode levar a uma diminuio na qualidade de ocito, como por exemplo, alteraes hormonais (WILDING et al., 2007). A membrana plasmtica sem resistncia no s reduziu significativamente a taxa de fertilizao como refletiu nos demais aspectos avaliados posteriormente. Isso esperado, j que de todos as TRAs a ICSI a mais invasiva, no imitando perfeitamente o procedimento natural. Por mais que o dimetro da agulha seja reduzido, ainda grande quando comparado ao dimetro do espermatozide. Alm disso, a entrada natural do espermatozide no vulo se d com auxlio de processos qumicos, no sendo a fora mecnica imperativa como em ICSI. Em um vulo com membrana plasmtica sem resistncia a agulha provoca uma abertura nessa membrana que pode demorar mais tempo a se fechar, havendo perda de componentes citoplasmticos importantes para a fertilizao, como organelas e protenas, e a entrada de componentes do meio externo, estranhos a composio natural do vulo. A membrana plasmtica resistente tambm reduziu a fertilizao, apesar de no ser estatisticamente significante, provavelmente devido necessidade de se realizarem vrias tentativas para a agulha de ICSI transpassar a membrana, o que pode alterar a localizao dos cromossomos ou de organelas citoplasmticas, como as fibras do fuso e retculo endoplasmtico. Esses resultados se assemelham aos encontrados na literatura (WILDING et al., 2007). O espao perivitelnico aumentado apresentou taxa de fertilizao superior a de ocitos sem essa caracterstica, o que difere dos resultados de Camargos et

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al. (2008), que obteve maiores taxas de fertilizao em ocitos com espao perivitelnico reduzido, e do trabalho de Aggelis et al. (2006), que no verifica relao do espao perivitelnico aumento com taxa de fertilizao. Camargos et al. (2008) sugere que espaos perivitelinos maiores possivelmente corresponderiam retrao da membrana citoplasmtica do ocito e poderiam produzir alterao morfolgica que comprometeriam a qualidade do zigoto, o que tambm no foi verificado neste trabalho. O citoplasma granular reduziu a taxa de fertilizao, apesar de no ser estatisticamente significante, se assemelha aos resultados de Balaban et al. e Serhal et al. (1997), provavelmente por possuir um nmero amostral superior. O aspecto geral normal do ocito, curiosamente, no aumentou a taxa de fertilizao. Entretanto, essa uma avaliao inicial e dotada de subjetividade, no sendo suficiente para predizer a qualidade do ocito.

Relao entre morfologia do ocito e qualidade da morfologia do pr-ncleo

Os pr-ncleos contm a carga gentica do vulo e do espermatozide, devendo estar alinhados e pareados, sendo o primeiro sinal que a fertilizao transcorreu bem (AGGELIS, 2006). A membrana plasmtica sem resistncia, quando permitiu a fertilizao do ocito, reduziu significativamente a qualidade da morfologia do pr-ncleo, mostrando que sua influncia negativa segue alm da fertilizao. A alterao de forma do ocito foi importante em reduzir a qualidade da morfologia do pr-ncleo (p=0.0629), provavelmente devido a essa alterao j indicar uma desorganizao conformacional do ocito e de seus constituintes citoplasmticos, o que poderia acarretar em pr-ncleos desalinhados e com nuclolos no pareados (CAMARGOS, 2007).

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Relao da morfologia do pr-ncleo com a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo

O aparecimento dos pr-ncleos, como evento imediatamente sucessor da fertilizao, pode predizer a qualidade do embrio nos dias 2 e 3 de cultivo. Todos os parmetros avaliados foram estatisticamente significantes. Pr-ncleos de morfologia alterada geraram embries com clulas alteradas, fragmentao igual ou superior a 10% e assimetria de clulas para os dias 2 e 3 de cultivo, indicando que alteraes no momento inicial de embrio persistem at a formao de blastocisto, acarretando em embries de baixa qualidade. Esses resultados so similares ao encontrado na literatura, que associa baixa qualidade da morfologia dos pr-ncleos como indicador de deficincia dos seus nuclolos, regio de sntese de protenas importantes para o crescimento e desenvolvimento embrionrio, o que levaria a embries de baixa qualidade e, conseqentemente, menor poder de implantao (SJBLOM et al., 2006; WILDING et al., 2007).

Relao das morfologias do ocito, pr-ncleos e embrio nos dias 2 e 3 de cultivo com a taxa de gravidez

Avaliando-se as caractersticas do ocito relacionadas gravidez, percebeu-se que a forma alterada no teve impacto negativo, apesar de ter reduzido anteriormente a qualidade da morfologia do pr-ncleo em um valor prximo ao significante. Os corpos refrteis tiveram uma influncia positiva na taxa de gravidez, no se encontrou, entretanto, base cientfica para explicar esse evento. Sabe-se que a gravidez conseqncia da implantao do embrio na parede do endomtrio e que esse fenmeno depende do poder do sinciciotrofoblasto (PRIETO GOMEZ, 2008) onde, provavelmente, os corpos refrteis podem estar atuando atravs de algum estmulo qumico.

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A membrana plasmtica, que afetou negativamente todos os resultados na qual foi utilizada como parmetro, manteve sua influncia negativa tambm sobre a taxa de gravidez, mostrando-se como um importante parmetro a ser acompanhado em todas as etapas RA. Wilding et al. (2007) obteve resultados semelhantes, associando a membrana plasmtica sem resistncia tambm a embries degenerados. A morfologia do pr-ncleo no apresentou relao direta com a gravidez. Verificou-se, no entanto, que ela influncia diretamente a qualidade embrionria e que essa, no 2 dia de cultivo correlaciona clulas alteradas a uma diminuio da gravidez. Saito et al (2000) hipotetiza a importncia do 2 dia de cultivo nos resultados de fertilizao in vitro, pois um estgio inicial de desenvolvimento embrionrio em que a expresso gnica ainda traz informaes oriundas dos gametas, os quais devem se aproximar ao mximo da normalidade, podendo essa fase auxiliar na predio de implantao e, conseqentemente, gravidez. Para segurana na anlise dos dados, utilizaram-se somente ciclos de transferncia nica para a anlise da gravidez como uma forma de garantir que o embrio analisado seria o embrio a implantar ou no no tero. Isso reduz o nmero de amostras e limita os embries queles de maior qualidade disponvel por paciente, visto que o embriologista seleciona sempre o melhor embrio para transferncia. Donaldio et. al (2005) realizou estudos dividindo os grupos de acordo com a classificao dos embries e concluiu que a seleo desses de acordo com a classificao ajuda a aumentar as taxas de implantao.

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5. CONSIDERAES FINAIS

A morfologia do ocito capaz de predizer fertilizao quando considerados o espao perivitelnico aumentado e a membrana plasmtica sem resistncia. Na predio da qualidade da morfologia do pr-ncleo deve ser considerada a membrana plasmtica sem resistncia do ocito. A qualidade embrionria influenciada por todas as alteraes morfolgicas do pr-ncleo. A gravidez sofre influncia da forma alterada, membrana plasmtica sem resistncia e corpos refrteis do ocito e clulas alteradas no segundo dia de cultivo embrionrio. Dentre todas as caractersticas avaliadas a membrana plasmtica sem resistncia do ocito influenciou, direta ou indiretamente, em todas as etapas dos estudadas, mostrando que sua influncia segue alm da fertilizao do ocito. Para uso clnico a morfologia oocitria deve ser utilizada como auxiliar do embriologista, visto que a quantidade de ocitos sem alteraes muito reduzida e deve-se selecionar dentre ocitos e embries morfologicamente defeituosos aqueles que tragam maiores chances de sucesso clnico. Sugere-se estudo longitudinais em crianas nascidas de ocitos com alteraes e embries de baixa qualidade para avaliar as conseqncias clnicas da utilizao de ocitos e embries morfologicamente alterados.

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REFERNCIAS

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