DNA

IMPORTNCIA
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Utilizao de sondas, microssatlites (padro caracterstico > DNA-fingerprint) Identificao de indivduos (criminalstica e testes de paternidade) Localizao de genes associados a doenas Deteco de genes relacionados ao desenvolvimento de tumores (retinoblastoma) Terapia gnica Produo de vacinas Modulao da expresso gnica Todas essas tcnicas associadas PCR

Tcnica de PCR
Finalidade de produzir rapidamente grande quantidade de cpias de uma determinada sequncia de DNA,com o auxlio de primers especficos. Prxima aula!

EXTRAO DNA GENMICO

Pontos a serem considerados

1) Tecido a ser utilizado.** Levar em considerao a quantidade de metablitos secundrios que em geral interferem com uma extrao bem sucedida 2) O tecido pode ser colhido e mantido 80C, ou liofilizado at o momento da extrao
3) Todo material utilizado na extrao (vidraria, solues, pipetas, etc..), deve estar livre de DNAses. Uso de autoclavagem e forno alta temperatura (180C)

PROTOCOLOS
Existem vrios protocolos. Mas, recentemente surgiram os que se caracterizam pela utilizao do detergente catinico CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) no tampo de extrao. Da o nome: Mtodo do CTAB
Doyle, J.J.T e Doyle, J.L (1987)

VANTAGEM DO MTODO
Caracteriza-se pela eficincia na extrao a partir de amostras pequenas de tecido (30mg) ou mesmo em larga escala. Pode ser utilizado para qualquer tipo de tecido, incluindo: razes, folhas, plen, sementes, embries, endosperma, cultura de clulas em suspenso.

Componentes da clula

ETAPAS DO PROCESSO DE EXTRAO

1) Macerao mecnica para romper as paredes e membranas celulares do tecido. 2) Ressuspenso do material vegetal em um tampo de extrao, contendo um detergente, antioxidantes, EDTA e agente tamponante, visando a solubilizao de membranas lipoproticas e desnaturao de protenas, deixando o DNA protegido da ao de enzimas de degradao.

Auxlio da temperatura
O uso de temperatura 5065C, na extrao, durante 1520 minutos, facilita a solubilizao e homogeneizao da suspenso.

CIA
Extrao com um solvente orgnico, clorofrmio-alcool isoamlico (24V:1V). Separao da fase orgnica e aquosa por centrifugao. De forma que lipdios, protenas e a maioria dos polissacardeos so retidos na fase orgnica inferior, enquanto que o DNA, RNA e alguns polissacardeos so retidos na fase aquosa superior.

lcool
Adicionado fase aquosa, o lcool (isopropanol ou etanol), na presena de um sal, precipita o DNA, que pode ser isolado por centrifugao.

AMOSTRA DNA GENMICO

O DNA precipitado lavado em etanol (70%), secado temp. ambiente e ressuspendido em um tampo TrisEDTA (pH=7.5-8.0) acrescido de RNAse (37 C, 30 min.) A qualidade e rendimento da amostra de DNA so avaliados por eletroforese em gel de agarose (1%)

GEL APS CORRIDA ELETROFORESE

1 2
1.6 kb 1.0 kb

O TAMPO DE EXTRAO: COMPOSTO DE:

CTAB NaCl EDTA Tris-HCl, pH=8.0 PVP B-Mercaptoethanol Protenase K H2O milliQ estril

2% 1.4M 20mM 100mM 1% 0.2- 1% (dependendo do material) 100g/mL (opcional) qsp (Volume Final)

PONTOS A SEREM CONSIDERADOS E FUNO DE CADA COMPONENTE:

pH do tampo: 7.5 - 8.0. Muito importante para evitar a degradao do DNA por ataque de enzimas, como:

as lipolticas e lipoxigenases que tm pH timo entre 5.0 e 6.0, enquanto as DNAses nucleares, tem pH timo em torno de 7.0

CTAB
O CTAB solubiliza as membranas celulares e dependendo da concentrao de NaCl no tampo, esse detergente forma um complexo com o DNA e pode, portanto, ser utilizado para precipitar o DNA seletivamente. O sal, alm de ser necessrio para a solubilizao e ao do CTAB, tambm essencial para permitir a precipitao do DNA na presena de um lcool.

OS OUTROS COMPONENTES DO TAMPO

Visam proteger o DNA da ao de enzimas nativas ou compostos secundrios liberados com o rompimento das clulas.

EDTA
O EDTA (ethylenediaminetetraacetate) includo para inibir enzimas dependentes de metais , principalmente DNAses. Quelata ctios como Mg2 +e Ca2 +

PVP
PVP (Polyvinylpyrrolidone) tem um efeito antioxidante. Reduz o efeito da oxidao de compostos fenlicos como taninos, quinonas e polifenis.

2--Mercaptoetanol
O agente redutor 2-mercaptoetanol protege o DNA contra as atividades de enzimas tais como peroxidases e polifenolodidases, desnaturando-as.