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Limitaciones de la Citogentica Convencional : Requiere metafases No siempre la calidad de las metafases es optima
Alternativa : Citogentica Molecular 1. FISH (Hibridacin in situ con fluorescencia) Requiere saber lo que se busca Tener la sonda adecuada Otras tcnicas: Requieren equipos muy sofisticados y apoyo informtico SKY (Cariotipo espectral multicolor, multifish) CGH (Hibridacin Genmica Comparada)
2.
Estrategias
A. Hibridacin ( Southern blots,, hibridacin in situ,etc.). B. Amplificacin de material gentico del organismo patgeno (PCR, LCR, etc.)
Ensayos de Hibridacin
De cidos Nucleicos.
Southern blot. Hibridacin in situ (FISH) Microarray
Desnaturalizacin: la doble hlice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH 13)
Renaturalizacin o hibridacin molecular: reconstitucin de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrgeno interacciones dbiles: las afecta el pH, T, concentracin salina.
La sonda puede encontrar la secuencia complementaria en una mezcla de millones de molculas relacionadas pero no complementarias
FISH de metafase
La FISH se usa sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones especficas ms all de la capacidad de resolucin de la citogentica de rutina.
Sndromes de microdelecin actualmente diagnosticables mediante FISH Sndrome del maullido (cri-du-chat) Sndrome de Kallman Sndrome de Miller-Dieker Sndrome de Williams
Se ha hibridado con una sonda "de pintado" para el cromosoma 4. Uno de los cromosomas 4 de este paciente era anormal, pero era difcil determinar con la citogentica de rutina si tena una pequea delecin terminal en 4q o si era el resultado de una reordenacin ms compleja. Puesto que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su longitud y no hay material fluorescente en ningn otro cromosoma, esto sugiere que la anomala es una delecin terminal pequea. La metafase siguiente es del mismo paciente y confirma este diagnstico.
FISH de interfase La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas.
La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las clulas.
PRUEBA DE ANEUPLOIDA
- Ncleos en interfase procedentes de clulas de fluido amnitico -Sondas de DNA diseadas para los cromosomas 13, 21 El ncleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo).
El ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo).
RESULTADO ?
MUESTRA A UTILIZAR
Muestras de citogentica: ncleos desnudos Improntas Tejido parafinado Tejido fresco
MARCAJE Y DETECCIN
TIPOS DE SONDAS
SONDAS CENTROMRICAS (CEP)
Centromrico
Locus especfico
Pintado cromosmico
APLICACIONES
Deteccin de Trisoma y Determinacin del sexo
Verde = X
Rojo = Y
46,XY
Oncologa
APLICACIONES
FISH / HER 2
Amplificado
No Amplificado
APLICACIONES
Oncologa
bcr/abl translocacin t(9;22)(q34;q11.2). IGH/CCND1 translocacin t(11;14)(q13;q32). PML/RARA translocacin t(15;17)(q22;q21.1). TEL/AML1 translocacin t(12;21)(p13;q22).
ABL 9q34
Fusin ABL/BCR
BCR 22q11
FISH normal
FISH ABL/BCR
Bcl 2 Normal
Split
Translocacin en Bcl2
FISH
Ventajas:
Puede ser aplicada a clulas en clulas en divisin como en no divisin. La tcnica es confiable. (sensibilidad y especificidad )
Desventajas:
No puede detectar pequeas mutaciones. Omite Inversiones. Sondas no estn comercialmente disponibles para todos las regiones cromosmicas.
SKY
Ventajas: Mapeo de puntos de quiebre cromosmicos. Deteccin de translocaciones sutiles. Caracterizacin de rearreglos complejos. Desventajas: Equipos muy costosos. La tcnica es laboriosa. Especfico, pero no como mtodo de screening.
CGH
Ventajas: Requiere slo DNA genmico tumoral. Puede ser aplicado a tejidos frescos o
Desventajas:
congelados, Deteccin de prdidas y ganancias genmicas por hibridacin competitiva de ADN tumoral y normal de referencia
no detecta inversiones
CITOGENTICA Requiere clulas en divisin Requiere tejido fresco Permite detectar alteraciones de todo el genoma Bajo coste econmico
FISH No requiere clulas en divisin Permite estudiar material parafinado Solo aporta informacin de la sonda que se utiliza Moderado coste econmico
2.
su
El DNA cromosmico se desnaturaliza sumergiendo las laminas en solucin formamida al 70% en2 SSC (citrato de sodio salino como amortiguacin) a 72C durante 2 minutos
Para parar la reaccin se sumerge las laminas en una serie de soluciones con etanol 70% 80% y 95% durante 2 min T -20C
2 Fase HIBRIDACION
LA sonda debe de estar incubada por 2 horas y desnaturalizada trascurrido ese tiempo se coloca la sonda sobre la superficie del portaobjeto. Se coloca un cubreobjeto de vidrio y se sella. La hibridacin se realiza en una cmara hmeda introducida en una estufa a 37 C en oscuridad durante 72 horas.
Normal
Deletado
Sndrome Di George/VCF
Normal
Deletado
Sndrome Miller-Dieker
17p13.3 Orange
17q21.1 Green
FISH
No requiere clulas en
divisin Permite estudiar material parafinado o congelado Solo aporta informacin de la sonda que se utiliza Moderado coste econmico
PCR
Elevada incidencia de falsos negativos: puntos de rotura variables Elevada sensibilidad: falsos positivos
FISH
Requiere microscopio de fluorescencia Hasta el momento, poca experiencia del patlogo Permite trabajar con 2-4 sondas de distinto color Menor tiempo de procesado Mayor sensibilidad
CRITERIOS DE VALORACIN
Valorar la FISH en la zona tumoral
Analizar 500 ncleos para sondas centromricas y 200 ncleos para sondas especficas de locus Nunca valorar clulas solapadas
Establecer en una primera etapa los niveles de corte de cada sonda a partir de muestras control
Hibridacin in situ con sondas especficas de cada cromosoma (El aparato es capaz de diferenciar 24 colores).
Identificacin unvoca del material cromosmico reordenado en translocaciones y marcadores complejos
Caso 3226 Bandeo GTG Cariotipo 47,XX,+mar Multiple FISH Cariotipo 47,XX,+der(22q)
Caso 7947 (Hospital Clnico Universidad de Chile) Cariotipo parcial con multiple BAND cromosoma 2 : del(2)(q31q33),r(2)(q31q33),cromosoma 2 normal e ideograma del cromosoma 2.
SKY o M-FISH
Deteccin de prdidas y ganancias genmicas por hibridacin competitiva de ADN tumoral y normal de referencia
Secuenciacin de ADN
Secuenciacin automtica
Secuenciacin de genomas
Deteccin de mutaciones
Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayora estn daadas o degradadas)
Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro
Secuenciacin de genomas
UTILIDAD
Esta tcnica es especialmente til para mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas Es muy importante destacar que no es una tcnica de bsqueda de nuevas alteraciones cromosmicas, sino que detecta nicamente aquello que buscamos. El resto del genoma permanece oculto. Esta tcnica complementa perfectamente a la citogentica convencional en todas aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo. Al disponer de metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos en los que las alteraciones cromosmicas asociadas a un diagnstico son crpticas no visibles a la resolucin del microscopio ptico