tcnica de biologa molecular, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo.

Consiste en la separacin por calor de las dos cadenas de DNA que se quieren amplificar y su copia simultanea a partir de un punto determinado por un DNA artificial llamado cebador, esto ocurre mediante la accin de una enzima llamada DNApol. El resultado de esta tcnica es la duplicacin del numero de molculas de una secuencia completa de DNA

DNA
(molcula sencilla)

PCR
amplificacin

Muchas moleculas

ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (primers) Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

Integridad del ADN: este no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de extraccin: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg, tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes que inhibiran la actividad de la polimerasa. Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificacin de ADN genmico de copia nica se usan cantidades de 100-500ng en el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50ng. El mnimo oscila entre 10-100ng y el mximo entre 400-500ng

Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena) ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 g de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmdico Se puede amplificar a partir de una sola molcula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

Se conoce su secuencia. Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base. Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso. Deben estar presentes en exceso. Requieren de un cuidadoso diseo. Reglas de diseo: (a) longitud = 18-25 (b) Contenido de G+C entre 40-60%

Existen diferentes tipos de ADN polimerasa que llevan a cabo la replicacin del ADN, siguiendo el mismo mtodo de sntesis. se pueden clasificar en: Termolbiles: T optima de 37-42C se desnaturalizan con el calor. Termoestables: T optima de 74C, resisten durante 40-50 min a 96C.

Los de preferible eleccin deben ser los termoestables. Llevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del templado. Algunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3, Ej. Taq agrega una A al extremo 3, especialmente si en el extremo hay una C. Cantidad usada = 5 x 1012 molculas (1.5 unidades) La mas comnmente usada = Taq ADN polimerasa Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

La reaccin en cadena de la polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que se repite durante un nmero determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos optimizar la reaccin.

Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente.

Es un calentamiento para la separacin de las dos hebras del DNA, mediante la incubacin breve (30-120 s) a una temperatura entre 68 y 97C, que debe ser superior a la de fusin (Tm) de la regin de DNA que se quiere amplificar.

Enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas del DNA de interes con los oligos cebadores. Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65C que se mantienen entre 10 y 120s.

Etapa de amplificacin propiamente dicha (72-75C, 13 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin 5-3 a partir del extremo 3-OH de cada cebador.

Adems de las tres etapas de cada ciclo, comnmente se aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa, a elevada temperatura, sirve bsicamente para inactivar proteasa y nucleasas de la muestra, as como para asegurar la desnaturalizacin completa del DNA de partida, especialmente si este es de un gran tamao o posee regiones muy compactas. La etapa final por su parte, consiste en una prolongacin de la ltima elongacin, para permitir que se completen todos los fragmentos.

Luego de la separacin de las hebras, cortos primers de DNA especficos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada. Mas tarde se da la elongacin.

Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1

Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?

Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100C)

Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100C)

Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molcula original

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusin 95C

Hibridizacin 50-60C

Extensin de La cadena 75C

Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

2do Ciclo 95C 50 - 60C 75C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el nmero de copias

En el caso de una PCR mltiple, lo que se persigue es amplificar simultneamente en un nico tubo distintas secuencias especficas, lo cual necesariamente implica que los reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la deteccin de cada diana y no inhibir la de las dems. En el caso de los cebadores y el programa de temperaturas utilizado, es necesario tener en cuenta varias premisas:

a ) escoger o disear oligonucletidos que no interaccionen entre s, es decir, que no formen oligmeros;

b ) que tengan temperaturas de anillamiento similares;

c ) que cada pareja amplifique una nica secuencia diana

d ) que generen amplicones de tamao suficientemente diferente como para poder ser separados y diferenciados tras la amplificacin.

En cuanto a la calidad y cantidad de ADN

molde, por supuesto debemos intentar partir

de la concentracin menor posible y con ausencia de sustancias inhibidoras que puedan interferir en la reaccin. Para ello, los

protocolos de purificacin variarn en funcin

del tipo de muestra clnica de partida.

La reaccin en cadena de la polimerasa transcriptasa reversa, es una modificacin de la PCR convencional, y se utiliza para la deteccin de secuencias genmicas especficas de algunos virus RNA. Consiste en la transcripcin inversa del RNA vrico, seguida de una PCR convencional. Respecto a la PCR presenta una sensibilidad similar, aunque es una tcnica ms rpida.

Para amplificar copias de cDNA de RNA. Es especialmente til cuando solo se dispone de pequeas cantidades de RNA. Frecuentemente usada para amplificar genes especficos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer antisense y un DNA polimerasa dependendinte de RNA. Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN Luego se usa un segundo primer (sense) para hacer el duplex de cDNA por PCR

Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna. Entre las aplicaciones mdicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recin nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el primer ao de vida.

Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolgicas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de clulas cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelacin en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a travs de la PCR el riesgo de padecer enfermedades tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celaca.

 LUQUE CABRERA JOSE, HERRAEZ SANCHEZ

ANGEL, Biologa molecular e Ingeniera Gentica, Ed. Harcourt, Madrid,2001. www.medlineplus.pcr.com www.unibarcelona/biologiamolecular/pcr.com