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La electroforesis es una tcnica que permite la

separacin de molculas teniendo en cuenta la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use.

Electroforesis

Se fundamenta en

Existen varios tipos

Punto isoelctrico

Carga neta

Electroforesis libre

En zona

Movilidad
electrofortica

En gel En papel Poliacrilamida Agarosa

Es el pH al cual la carga neta de la molcula es cero y su solubilidad es casi nula en agua(precipitacion) La carga neta de las protenas depende del contenido de una serie de aminocidos en especial de

En el punto isoelctrico la protena no migra pH=pI Por debajo de su punto isoelectrico migra hacia el ctodo pH<pI Por encima del punto isoelctrico migra hacia el nodo pH>PI

Punto isoelctrico protenas

de

algunas

Protenas carga neta

La carga neta de los cidos nucledos siempre es negativa debido a la presencia de los grupos fosfato. Por lo anterior siempre migraran hacia el nodo.

Determina el comportamiento de una molcula, bajo la accin de un campo elctrico.

Se define como la velocidad de migracin por unidad de campo elctrico

Velocidad de migracin

Depende de dos factores La fuerza ejercida por el campo elctrico


Esta fuerza se encuentra dada por F=qE donde q es la carga de la molcula(coulombios) y E es la fuerza del campo elctrico (voltios por metro)

Fuerza de friccin F= fv donde v es la velocidad y f es el coeficiente de friccin Tamao de la molcula, asociado a su peso molecular

Se emplea en la separacin de molculas cargadas Medio de soporte: papel filtro Requiere de mucho tiempo(h) para su revelacin

Azul de comassie

Soportes
(Electroforesis de zona o de gel)

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Soportes
4) AGAROSA. Uno de los dos componentes del agar. Polisacrido lineal que forma geles de tamao de poro grande. Se usa fundamentalmente para la separacin de cidos nucleicos y para inmunoelectroforesis, donde se precisa una difusin elevada.

5) POLIACRILAMIDA. Es posible controlar el tamao del poro de una forma muy reproducible. Es el tipo de gel ms empleado para la electroforesis de protenas y de otras molculas incluyendo cidos nucleicos. Son geles completamente inertes, mecnicamente estables y transparentes, lo que facilita tanto su manejo como la deteccin de las molculas separadas en ellos. Se conoce como PAGE (acrnimo de PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
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Electroforesis de protenas
Las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos nucledos, y por tanto sus velocidades de migracin no son similares entre ellas existen varios tipos de separacin: PAGE 1. No desnaturalizante 2. Desnaturalizante(PAGE SDS) Electroenfoque

PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)


CARACTERISTICAS
Soporte restrictivos tipo II Inertes frente a molculas biolgicas Transparentes Estables en un amplio intervalo de (PH temperatura y fuerza inica) Mecnicamente estables(pueden ser hidratados y reducidos a una fina pelcula lo que facilita su almacenamiento.

Gel de poliacrilamida
Se separan de modo que el poro sea de un tamao comparable al de las protenas para producir un efecto de tamizado molecular, as las protenas que tienen la misma densidad de carga pero tamao diferente el soporte dificultara el avance de la protena de mayor tamao.

Preparacin del soporte.

PAGE en condiciones no desnaturalizantes.


La muestra se carga directamente en el gel en el cual se va a producir la separacin, se desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad de dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos, unin a receptores, etc.)

PAGE en condiciones desnaturalizantes


En presencia de algunos compuestos qumicos,(detergentes urea) las protenas pierden su estructura nativa; tales compuestos, llamados agentes desnaturalizantes, producen el desplegamiento de la protena que queda, as, sin la organizacin tridimensional caracterstica de su funcionalidad biolgica.

PAGE-SDS
Permite el clculo de parmetros moleculares , los complejos SDS protena se separan estrictamente segn su tamao molecular.

Cuando las protenas se solubilizan en presencia del detergente anionico SDS este se une a las protenas, rompiendo las interacciones hidrofobicas y desnaturalizndolas.

La SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de protenas debido a: La gran mayora de las protenas son solubles en SDS. Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido hacia el (nodo). Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa molecular, que se puede calcular. Los complejos SDS-protena se tien fcilmente.

SDS -mercaptoetanol Calor

CATODO

ANODO

Electroenfoque. Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se separan segn su punto isoelctrico pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula) en un gradiente continuo de pH. La carga neta de una protena es funcin del pH: pH>pi carga nula negativa pH=PI carga neta nula PH<pi carga nula positiva

SDS-PAGE

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Ejemplo de electroforesis protenas sricas

de

Tamao vs Movilidad

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Revelado

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Transiluminador UV

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Soportes

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Electroforesis de Campo Pulsado

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