MTODOS PARA ESTUDOS COM A EXPRESSO DE PROTENAS: ENFOQUE PARA A VITELOGENINA DE PEIXES

LAB. DE TOXICOLOGIA CELULAR DEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR

DETECO E QUANTIFICAO DA EXPRESSO PROTICA

AO DE METAIS E XENOESTRGENOS

VI TE LOGE N I N A de P E I XE S (VTG) > > GLI CO-LI P O-F OS F O-P ROTE N A de ALTO P E SO MOLE CULAR (1 6 0 -2 1 0 kDa ; m dia a pr ox.: 1 8 0 kDa ) > > e x pre s s o h ep tica (HE P ATCI TOS ) I N DU Z VE L (ATI VAO da t ra n s cri o de RN Am ) em f m e a s , m a ch os e jov e n s im a t u ros sob CON TROLE HORMON AL , por : E 2 : 1 7 b -e s t ra diol (h or mn io n a tu r a l) E E : h or mn ios S I N T TI COS ou S U B S TN CI AS E XGE N AS > E E 2 : e t in il-e s t ra diol com a o e s t rog n ica (XE N OE S TRGE N OS ) > DE B : die t il-e s t il-be s t rol > > I N CORP ARADA N OS OCI TOS em desen volvimen to (sob a o da g on a dot ropin a I ), on de qu ebr a da (pr otelise) em pr oten a s men or es con stitu in tes do vitelo (p. ex.: prot e n a lipov it e ln ica - LV ) > > su a I N DU O (a t iv a o da e x pre s s o g n ica por E 2 ou E E ) ACOMP AN HADA pela E XP RE S S O (h e pa t cit os ) de OU TROS COMP ON E N TE S P ROT I COS : E R : RE CE P TOR E S TROG N I CO > RE CE P TOR N U CLE AR : P ROTE NA ATI VADORA de tr a n scr i o > liga -se a o "h or mn io" for ma n do E 2 -E R ou E E -E R VE P s : pr oten a s do E N VE LOP E VI TE L N I CO > 2 a 4 tipos pr oticos (4 7 -1 2 9 kDa )

SISTEMA REPRODUTOR NEUROENDCRINO CREBRO

HIPOTLAMO GtRH (+) / DPM () HIPFISE GtH I & GtH II (+) e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO ESxH e outros fatores dimorfismo sexual gametognese (Zn) incorpora VTG (GtH I)

POSSVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSO de PROTENAS

seqncia da protena
MTODOS: QUALITATIVOS: imuno-deteco (avaliao subjetiva); QUANTITATIVOS: quantificao relativa: mtodos semi-quantitativos (ELISA direto); mtodos indiretos (p.ex.: anlise de imagens); quantificao absoluta: p.ex.: cromatografia ou ELISA sandwich

seqncia de cidos nuclico

POSSVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSO de VITELOGENINA (VTG) em fgado (HEPATCITOS) e DETECO-QUANTIFICAO em TECIDOS de TRARA
+

: uma E outra ENTRADA : uma OU outra ENTRADA

DNA, RNA, PT, aas ou SEQNCIAS spp Hm

protenas (PTs) ou aminocidos (aas) ou

seqncia de aas
DNA ou seqncia de DNA RNA ou seqncia de RNA

: relao INTRA-ESPECFICA (Hm)

: relao INTERESPECFICA (outras espcies - spp )

INDUO de VTG de Hm no FGADO por IIP de 17b-ESTRADIOL (E2)

EXTRAO de RNA-total do FGADO

+
NORTHERN BLOT

EXTRAO de DNA-total do FGADO >> clivagem aleatria (endonuclease de restrio) >> coleo heterognea de fragmentos de DNA SONDA HETERLOGA MARCADA (SHt ) HIBRIDIZAO com ESTRINGNCIA >> RNA ou DNA ou cDNA ou >> oligonucleotdeos sintticos degenerados relacionados seqncia(s) de DNA do GENE que codifica a VTG em spp de peixes

EXPRESSO in vitro do DNA-VTG de Hm >> VETORES de EXPRESSO (gene de VTG) >> produo de VTG (ou VTG-aas) em host cell ISOLAMENTO ou PURIFICAO de VTG de Hm (PLASMA ou CLULAS) >> cromatografia de troca inica (purificao) >> fracionamento por precipitao (isolamento)

HIBRIDIZAO: cDNA-VTG ou SHt >> RNA em GEL de AGAROSE >> DENSITOMETRIA (padres de RNA) RT ( transcriptase reversa ) TRANSCRIO REVERSA mRNAs >>> cDNAs

+
PRODUO DE anti-VTG IMUNIZAO em spp

+
ISOLAMENTO do DNA-VTG

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay >> INCUBAO com anti-VTG >> INCUBAO com ANTI-2rio-CONJUGADO >> COLORIMETRIA (padres : VTG purificada) >> VALIDAO (bioensaios) anti-VTG de spp REAO CRUZADA

HIBRIDIZAO: DNA-VTG ou SHt

PCR ( DNA polimerase ) >> amplificao e isolamento de cDNA ou OUTRO >> com PRIMERS para VTG construir SONDA MARCADA : DNA-VTG >> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE

>> seleo de colnia com clones de DNA-VTG

IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS >> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON >> INCUBAO com anti-VTG ou anti-VTG >> INCUBAO com ANTI-2rio-CONJUGADO >> DENSITOMETRIA (padres : VTG purificada)

CONSTRUO/OBTENO de PRIMERS oligonucleotdeos sintticos degenerados >> para sequncias conservadas de aas do domnio carboxi-terminal (3) da VTG (17 sequncias conhecidas de 15 spp ) >> ALEATRIOS

CLONAGEM do DNA de Hm ( DNA-total ou cDNA-VTG )

RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG

DNA de Hm (EXGENO bactria ou levedura) + VETOR DE CLONAGEM (plasmdio ou fago) = CLONES de DNA recombinante (COLNIAS)

VTG plasmtica
de Sparus aurata

cDNA-VTG de Sparus aurata

mRNA-VTG

5 dias aps IIP :

5 mg E2 . kg-1

de Sparus aurata Northern Blot: autoradiografia (32P)

SDS-PAGE (7%) Comassie Blue

VTG

VTG de Sparus aurata

ELISA

3 10 30 M

VTG

3 3 10 10 30 30 M

VTG Western Blot: anti(2)-enzima

RESPOSTA ESTROGNICA
INDUZIDA EM Salvelinus alpinus

mRNA-VTG Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus IIP : 10 mg E2 . kg-1

VTG: Western Blot

(policlonal de truta em coelho / anti-IgG de coelho conjugado peroxidase)

Salvelinus alpinus IIP : 10 mg E2 . kg-1 mRNA-RE2 Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus IIP : 10 mg E2 . kg-1

mRNA-VEPs Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE TRUTA

mRNA-VTG Northern Blot:

TRUTA

autoradiografia (32P)
IOD

VTG SDS-PAGE (5-20 %)

[VTG]% (IOD)

TRUTA

[VTG]% (IOD)

EXPRESSO DE VTG vs. ++ EXPOSIO AO Pb EM Hoplias malabaricus

VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricus evidenciada por SDS-PAGE descontnuo (Coomassie Brilliant Blue) empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separao em ACRILAMIDA a 9 % INDUO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2) dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa iip E2(+)
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM

205 kDa 116 kDa 97,4 kDa 66 kDa 45 kDa 29 kDa

linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-) linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E2 (-) linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+) linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+) linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl2 e H2O linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5 linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0 linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5 linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :

VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricus evidenciada por SDS-PAGE descontnuo (Coomassie Brilliant Blue) empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separao em ACRILAMIDA a 9 % INDUO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2) dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa iip E2(+)
1 2 3 4 5 6 7 8

MWM

116 kDa 97,4 kDa 45 kDa 29 kDa

linha 1: 400 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-) linha 2: 400 nl do animal 4, FMEA jovem E2 (-) linha 3: 100 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+) linha 4: 400 nl do animal 1, FMEA jovem E2 (-) linhas 5 a 8: 150 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl2 e H2O linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5 linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0 linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5 linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :