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Introduo
O Sistema Imune normal tem a capacidade de reagir a uma enorme variedade de microorganismos, mas no contra cada antgeno prprio do indivduo. A esta no-responsividade especfica a um antgeno induzido pela sua exposio aos linfcitos chamamos de:
Tolerncia Imunolgica
Tolerncia Imunolgica
Os antgenos prprios so classificados como tolerognicos ou no-imunognicos e essa sua caracterstica que gera a tolerncia imunolgica.
Autoimunidade
Anergia
Deleo
DOENAS AUTO-IMUNES
Sistmicas
Artrite Reumatide
DIAGNSTICO:
Anticorpos Auto-Imunes
FAN(Fator Anti-Ncleo)Hep-2/ ANA/PAAC Anti-DNA ENA (Screening, 4, 6, 8...) ANCA (C-ANCA ou P-ANCA) FR (Fator Reumatide) Anti-CCP3
ANA
Pode ser utilizado como indicador :
Prevendo o aparecimento de doena auto-imune Diagnstico Prognstico Para monitorizar efetivamente o tratamento
Histrico do ANA
1948: Hargraves descobre a clula LE em pacientes com LES
ANA
Mtodos para diagnstico:
EIA (Enzyme Imune Assay) ELISA(Enzyme Linked Imunosorbent Assay) IFI (Imunofluorescncia Indireta)
ANA anteriormente era chamado de FAN quando realizado por IFI Hoje chamamos o ANA de PAAC (Pesquisa de Anticorpos contra Antgenos Celulares) A nomenclatura FAN no designava corretamente o teste j que nele descrevemos auto-anticorpos no s contra o ncleo, mas tambm contra nuclolos, actina, miosina, mitocndria , Complexo de Golgi, citoplasma.
1 Passo
Definio da regio celular fluorescente
2Passo
Observao da fase de diviso celular e classificao da placa metafsica cromossmica
3Passo
Caracterizao do aspecto da fluorescncia
Relevncia Clnica:
Pode no apresentar associao clnica especfica Associado a Cirrose Biliar Primria, Hepatites auto-imunes Raramente associado a: doenas reumticas e SAAF Associado a algumas formas de LES e Esclerodermia Linear
Nuclear Homogneo
Auto-anticorpos:
Anti-DNA nativo, Anti-histona e Anticorpo anticromatina
Relevncias clnicas:
Anti-DNA nativo: marcador de LES Anti-histona: marcador de LES induzido por drogas e LES idioptico Anticorpo anticromatina: LES, AIJ importante na forma oligoarticular com uvete,Sndrome de Felty e HAI
Relevncias clnicas:
Anti-Sm: marcador para LES Anti-RNP: critrio obrigatrio no diagnstico de doena mista do tecido conjuntivo, tambm presente no LES, Esclerose sistmica e AR.
Relevncias clnicas:
Raramente presentes em doena auto-imune, exceto quando em nveis altos
Relevncias clnicas:
Anti-SS-A/Ro: Sjgren primria, LES, lpus neonatal e cutneo subagudo,Esclerose sistmica e cirrose biliar primria Anti-SS-B/La: Sjgren primria, LES e lpus neonatal
Relevncias clnicas:
Sem relevncia clnica at o momento Evidenciado em indivduos normais,processos inflamatrios especficos e no especficos, doenas alrgicas e auto-imunes
Relevncias clnicas:
Anti-p80 colina: sem associao clnica definida Anti-Sp100: descrito principalmente em Cirrose biliar primria e em diversas outras situaes.
Relevncias clnicas:
Esclerose sistmica forma CREST e cirrose biliar primria e Sjgren
Padro Nucleolar
Auto-anticorpos:
Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolna , anti-fibrilarina(U3-RNP), anti-NOR 90 e anti-RNA polimerase I
Relevncias Clnicas:
Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolna : Sindrome de superposio da polimiosite com esclerose sistmica Anti-fibrilarina: associado a esclerose sistmica com comprometimento visceral(hipertenso pulmonar) Anti-NOR 90 : sem relevncia clnica definida, descrito na esclerose sistmica Anti-RNA polimerase I: esclerose sistmica com compromentimento visceral
Descrio :
Fibras de estresse que constituem o citoesqueleto decoradas de forma retilnea, cruzando toda a extenso da clula e no respeitando os limites nucleares
Relevncias clnicas:
Antiactina: hepatite auto-imune Antimiosina: hepatite C, hepato-carcinoma, miastenia gravis
Descrio do padro:
Decorao de filamentos com acentuao uni ou bipolar em relao membrana nuclear
Relevncia clnicas:
Antiqueratina: doena heptica alcolica,em vrias doenas inflamatrias e infecciosas
Descrio de padro:
Apenas segmentos curtos das fibras de estresse se encontram fluorescentes.
Relevncias clnicas:
Anticorpos encontrados nas miastenia gravis, doena de crohn e colite ulcerativa
Descrio do padro:
A decorao apenas citoplasmtica em pontos agrupados de situao perinuclear, normalmente em apenas um polo nuclear
Relevncias clnicas:
Em altos ttulos: LES, Sjgren primria e outras doenas auto-imunes sistmicas como ataxia cerebelar e infeces virais por EBV e HIV
Relevncias clnicas:
Anti-EEA1 e antifosfatidilserina: sem associao clnica definida Anti-GWB: associado a Sjgren primrio
Relevncias clnicas:
Antiprotena P-ribossomal: especfico do LES e pode estar associado a quadros psiquitricos Anti PL7/PL12: raramente encontrados na polimiosite
Relevncias clnicas:
Marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na dermatomiosite
Relevncias clnicas:
Pode sugerir a presena do anticorpo anti-M2 ( antipiruvato desidrogenase), marcador da cirrose biliar primria Esclerose sistmica
Descrio do padro:
Ponto fluorescente isolado na clula em repouso que se divide em dois e migra ao polo oposto do ncleo medida que a clula entra em diviso
Relevncia clnica:
Altos ttulos sugestivo de esclerose sistmica
Relevncias clnicas:
Encontrado no LES e na Doena Mista do Tecido Conjuntivo
Relevncias clnicas:
Associado a diversas condies auto-imunes com baixa especificidade
Misto do tipo nucleolar homogneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafsica decorada em anel ( cromossomos negativos)
Anticorpo anti-KU
Relevncias clnicas:
Marcador de superposio de polimiosite e esclerose sistmica Pode ocorrer tb no LES e esclerodermia
ANTI-DNA
Anti-DNA
Alta correlao com a atividade do LES quando h comprometimento renal Os testes Anti-DNA em metodologia de IFI e Colorzyme utilizando como substrato a Crithidia luciliae baseando-se no princpio de reao contra o cinetoplasto Devido a sua alta sensibilidade e especificidade essa metodologia a mais utilizada mundialmente.
Crithidia luciliae
um parasita flagelado unicelular No patognico ao ser humano Encontrado no sistema digestivo de insetos tipo moscas varejeiras Este microorganismo possui uma estrutura privilegiada o cinetoplasto que :
Uma mitocndria gigante rica em ds-DNA
Significado Clnico
A presena de reao positiva para ds-DNA uma forte evidencia da presena de LES com comprometimento renal Este teste faz parte do 10 critrio de classificao do LES pelo American College of Rheumatology
Objetivos do teste
A pesquisa de anticorpos anti-DNA geralmente utilizada como prova de segmento e diferenciao de diagnstico de LES Realizado para diferenciao de padro nuclear homogneo em IFI com clulas Hep-2 Utilizado para avaliao do grau de atividade da doena
IFI Anti-DNA
Se presena de antiDNA visualizamos fluorescncia do cinetoplasto da Crithidia luciliae
Lembrar que ele encontra-se posterior ao ncleo na base do flagelo
Mtodo ELISA
Baseia-se na reao antgeno-anticorpo detectveis atravs de reaes enzimticas A enzima mais comumente utilizada nestas provas a peroxidase, que catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em H2O mais O2 Existem vrios modelos de testes de ELISA Em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de ELISA) preparado; A seguir coloca-se sobre a placa os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno.
Mtodo ELISA
Se houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida quando H2O2 desdobrada).
Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato). Por ltimo , realizada a leitura da placa em um espectofotmetro que faz a medida do comprimento de onda da cor da reao
Deteco de Ac Especficos(ENA)
Atravs do ELISA pode-se usar vrios antgenos especficos como substrato para investigar a existncia de um auto-anticorpo especfico no soro de um paciente (anti-Ro, anti-La, Scl-70, Anti-RNP,AntissDNA, Anti-dsDNA entre outros) ou usar um pool de anticorpos para realizar um screening. Os antgenos esto separados por kits, que contm o nmero de antgenos que cada kit contm:
ENA screening : Possui vrios antgenos. ENA 4 : Possui 4 tipos de antgeno diferentes ENA 6 : Possui 6 tipos de antgeno diferentes E outros testes com mais antgenos
ENA
Screening:
Mtodo utilizado como triagem quando temos a IFI com Hep-2 positiva Se positivo correlacionar com os dados clnicos e realizar o ENA-4 Consiste em :
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. colocar as amostras na placa de ELISA com vrios anticorpos nucleares extraveis Incubar 30 minutos em temperatura ambiente Lavar por 3 vezes com soluo de lavagem Acrescentar o conjugado e incubar por 15 minutos Lavar por mais trs vezes Incubar por mais 15 minutos aps adio de substrato Adicionar soluo STOP Ler em 450 nm no espectofotmetro
ENA
ENA -4:
Imunoensaio enzimtico imunomtrico Microplaca constituda por 3 mdulos com 8 poos cada revestidos com SS-A; SS-B; Sm; RNP-Sm Teste que determina especificamente os anticorpos que positivaram o PAAC e o ENA Screening
ENA- 6:
Imunoensaio enzimtico imunomtrico Microplaca contendo alm dos anticorpos do ENA -4 Jo 1 e Scl-70
ANCA-AUTOANTICORPOS
ANTICITOPLASMA DE NEUTRFILOS
ANCA
So anticorpos direcionados contra constituintes citoplasmticos de neutrfilos e moncitos. Testes para detectar ANCA so utilizados para fazer o diagnstico e a monitorizao de atividade inflamatria de vasculites autoimunes de pequenos vasos : Granulomatose de Wegner Poliangete Microscpica Glomerulonefrite Necrotizante segmentar pauciimune (forma renal de PAM) Sndrome de Churg Strauss melhor demonstrado nessas doenas usando uma combinao de IFI de neutrfilos normais de sangue perifrico e ELISA (Enzmyme linked immunosorbent assays) que detecta ANCA para PR3 (proteinase3) ou MPO (Mieloperoxidase).
O mesmo no acontece com os grnulos com PR3, que permanecem no citoplasma, gerando:
padro C - ANCA
Quanto fixados com formalina no ocorre distribuio de grnulos, estes sendo PR3 ou MPO continuam no citoplasma, resultando em um padro C ANCA em todas as vezes.
Neutrfilos contendo anticorpos contra outro antgeno que no o PR3 ou MPO , como por exemplo na RCUI apresentam padro P ANCA quando tratados com etanol, por isso so chamados P ANCA Atpico. Tanto o padro P-ANCA como o P-ANCA Atpico so artefatos e s ocorrem quando os neutrfilos so fixados com o etanol. Quando fixados com Formalina os neutrfilos adotam o padro de fluorescncia citoplasmtica (C ANCA ). Com exceo do P-ANCA Atpico que continua com padro P-ANCA mesmo fixado com formalina.
Quando temos um padro ANA ao formol ,temos ausncia de fluorescncia devendo ser realizado IFI com Hep-2 para investigar anticorpos anti-antgenos nucleares
ETANOL
FORMALINA
Fator Reumatide - FR
O termo FR engloba um grupo de autoanticorpos das classes IgG, IgA e IgM que tm em comum a capacidade de reagir com diferentes eptopos da poro Fc da IgG humana O FR IgM pode servir como marcador precoce da Artrite Reumatide(AR O risco de desenvolvimento da doena aumenta de forma proporcional ao aumento de FR em indivduos normais Est presente em 90% dos casos de AR clssicos, aps seis meses de incio da doena Pode est aumentado em 15-35% em pacientes com LES Falso positivos variam de acordo com o mtodo utilizado para sua deteco
Princpio da Tcnica
O FR se presente no soro ir promover a aglutinao de partculas de ltex revestidas com gama-globulina humana presentes no reagente, promovendo um aumento da turbidez, que determinado fotometricamente atravs do nefelmetro contra padres conhecidos. Valor de referncia normal < 20 UI/ml
Nefelometria
Tcnica utilizada para medir concentraes no sangue ,LCR ou urina de vrias protenas como:
Imunoglobulinas : IgG, IgM e IgA Fator Reumatide Complemento : C3, C4
Mede a difrao (desvio) da luz ao passar por uma soluo contendo complexos imunolgicos formados aps reao de imunoprecipitao
Nefelometria
Nefelometria
Vantagens
uma tcnica precisa Rpida Fcil realizao Totalmente automatizada
Desvantagens
Alto custo do anti-soro
ANTI-CCP3
Histrico Anti-CCP3
Foi demonstrado em diversos trabalhos que anticorpos perinucleares (APF) e anti-queratina (AKA) so muito mais especficos para AR, embora hoje seja conhecido que eles reagem contra a filagrina nativa e passaram a ser tratados como anticorpos anti-filagrina (AFA). Em 1995, Sebbag e cols., demostraram que todos esses anticorpos eram direcionados para a citrulina contendo eptopos. A citrulina um aminocido no padro, pois no incorporado em protenas durante a sntese protica, sendo gerada via modificao ps-translacional de resduos de arginina pela enzima arginina-peptidil-deaminase (PAD).
Em 1998, Schellekens cols. Descobriram que peptdeos lineares contendo citrulina eram muito especficos para anticorpos anti-AR (aprox.. 96%) em ensaio por mtodo ELISA.
Um artigo subsequente demonstrou que variantes cclicas destes peptdeos, chamados peptdeos citrulinados cclicos (CCP), eram igualmente especficos para AR, mas com maior sensibilidade que dos peptdeos lineares. Em 2007, a Liga Europia contra o Reumatismo (EULAR) publicou diretrizes para o diagnstico precoce de AR, incluindo o Anti-CCP como o principal teste no diagnstico precoce da Artrite Reumatide.
OBRIGADA!
Referncias Bibliogrficas
Imunologia Celular e Molecular, ABBAS et al. Edio atual. 2 Pfrimer IAH, Francescantonio PL, Von Mhlen CA, et al. I Consenso Nacional para a Padronizao dos Laudos de FAN em Clulas HEp-2. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial 2002; 38 (3): 207216. Damoiseaux JG, Tervaert JW. From ANA to ENA: How to proceed? Autoimmunity Reviews 2006; 5: 10-17. Dellavance,Alessandra;Jnior,Alexandre Gabriel;Nucciteli,Barbara,et al. 3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em clulas HEp2 (FAN).Recomendaes para padronizao do ensaio de pesquisa de autoanticorpos em clulas HEp-2,controle de qualidade e associaes clnicas. Rev Bras Reumatol 2009;49(2):89-109 www.alka.com.br/site/hotsite/autoimunidade/auto_antidna.asp Savige et al.International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies(ANCA).Imunopathology; Original Article.