MTODOS INSTRUMENTALES DE ANLISIS

APLICACIONES BIOLGICAS
CROMATOGRAFIA
INTRODUCCION A LAS SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
Caractersticas bsicas de anlisis qumico
Sensible
Selectivo
Especfico (pocos casos)
DESCRIPCION GENERAL
Mikhail Tswett
1906
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)
Las primeras unidades
cromatogrficas de M.
Tswett para el anlisis
de pigmentos vegetales.
CLASIFICACION
Sgn. la manera en que la fase movil y la fase
estacionarias se ponen en contacto
Cromatografia en columna (FM: liquido, gas, fluido
supercritico)
Cromatografia plana (FM: liquido)

Sgn. tipo de fase movil y estacionaria, y los procesos de
transferencia de los solutos entre las fases
Cromatografia de liquidos (FM: liquido)
Cromatografia de gases (FM: gas)
Cromatografia de fluidos supercriticos (FM: fluido
supercritico)

Cromatografia en columna
Blas. Gral. F. Movil F. Estacionaria Fenomeno de interaccion
LC Liquido L-L Distribucion entre liquidos
inmiscibles
L-fase enlazada Distribucion entre liquido y
superficie enlazada
L-S Adsorcion
Intercambio ionico Intercambio ionico
Exclusion por
tamano
Distribucion / Exclusion
L-receptor Adsorcion por afinidad
GC Gas G-L Distribucion entre gas y liquido
G-fase enlazada Distribucion entre gas y superficie
enlazada
G-S Adsorcion
SFC Fluido
supercritico
Distribucion entre fluido
supercritico y superficie enlazada
BASES DE LA SEPARACION
Fig. 3.1 y 3.2 Q
Interacciones posibles
que condicionan la
afiniadad de los distintos
componentes
Hidrofobicas
Hidrofilicas
Puente hidrogeno
Dipolares
Electrostaticas
Constante de
distribucion:


| | M
C
C
K
A
m
A
e
A
; =
NOMENCLATURA
Cromatograma
Linea de base
Volumen de elucion: V
i
Tiempo de retencion:
t
Ri
Tiempo de retencion
corregido: t
Ri
=t
Ri
-t
0
Volumen de F. Movil: V
0
Tiempo de elusion de
F. Movil: t
0
Fig 3.4 q
VELOCIDAD DE MIGRACION DE LOS
COMPONENTES
Velocidad lineal media:


Velocidad lineal media del
analito:


Factor de capacidad: k
i





Relacion entre K y t
R





Relacion entre k y vel.
lineal





Factor de selectividad: o

min
;
cm
t
L
R
v
| |
min
0
;
cm
t
L
u =
m
e
V
V
K
u v
+
=

1
1
0
0
'
t
t t
k
R

=
'
'
A
B
k
k
= o
'
1
1
k
u v
+
=

CARACTERIZACION DE k y o
k
K adecuado:
2-10 (pocos analitos)
0,5-20 (muchos analitos)
Ajustes de k mediante
fuerza de elusion de F.
Movil: modificacion de la
proporcion del solvente de F.
Movil de mayor afinidad con
los analitos
Cambio en la proporcion del
componenete activo de la F.
Movil
o
o referencia: 1
o depende de la afinidad del
analito con la F. Movil y la F.
Estacionaria
Ajustes de a variando la
interaccion entre el analito-F.
Movil-F. Estacionaria:
Cambiando componente
activo de la F. Movil
(MeOH, ACN)
Variacion de pH de F.
Movil
Agregados de aditivos
Cambio de Fase
estacionaria
ENSANCHAMIENTO DE BANDA EFICIENCIA
DE LA COLUMNA
Numero de platos teoricos:
N
Altura de plato teorico: H
Sgn. Martin y Synge
(picos gausianos
simetricos)


Sgn. Foley y Dorsey
(picos gausianos
asimetricos)
Fig 3.5 y 3.7Q
2
5 , 0
'
2
'
545 . 5 ; 16
|
|
.
|

\
|
=
|
|
.
|

\
|
=
W
t
N
W
t
N
R R
H
L
N =
25 . 1
7 . 41
2
1 , 0
+
|
|
.
|

\
|
=
A
B
W
t
N
R
FACTORES QUE AFECTAN A H Y N
PROPIO DE COLUMNA
Particulas de la F.
Estacionaria
Diametro
Morfologia
Calidad de particula
Empacamiento de la F.
Estacionaria
Calidad
Envejecimiento
Canales (producido
por golpes)
EXTERNO A COLUMNA
Tuberias
Longitud
Diametro
Detector
Volumen
Geometria

Geometria del pico
Anterior
Posterior

UTILIDAD DE N Y H
Comparacion de materiales y metodos bajo iguales
condiciones de trabajo
Optimizacion de metodo analitico
Control de idoneidad de un metodo analitico
Control del estado de la columna durante su vida util
PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO DE
BANDAS
Ensanchamiento de banda intracolumnar (H)
Caudal de fase movil
Difusion longitudinal
Resistencia a la transferencia de masas en la F.
Estacionaria
Resistenca la transferencia de masas en la F. Movil
Proceso multipasos

Ensanchamiento de banda extracolumnar (o
2
)
Detector
Volumen de las partes del cromatografo entre el
inyector y el detector
Volumen de inyeccion

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Caudal de fase movil
Magnitud de efectos
cineticos dependen del
tiempo de contacto entre FE
y FM
Los H
min
para LC se dan a
caudales menores que para
GC debido a los caudales de
trabajo
En general H
LC
<H
GC

Longitud de columnas de
LC<<GC => eficiciencia
GC>>LC


Fig 24.7 SL

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Difusion longitudinal
Difusion de analitos desde
zonas mas concentradas a
mas diluidas
El ensanchamiento long. se
produce en la direccion del
flujo de la FM
A > u < tiempo de residencia
del analito < difusion
B/u
L
0; B/u
G
>0


Fig 24.7 SL
u
D k
u
B
M D
2
=
Ensanchamiento de banda intracolumnar
Coeficientes de trasferencia de masa (C
E
y C
M
)
El equilibrio de particion entre las dos fases es MUY
LENTO por lo que siempre se trabaja fuera del
equilibrio. Las moleculas mas afectadas son las que se
encuentran en el frente o cola de la banda.
Los analitos necesitan tiempo para difundir desde el
interior de las fases hasta la interfase donde se produce
el reparto
El ensanchamiento long. se produce perpendicular a la
direccion del flujo de la FM




Ensanchamiento de banda intracolumnar
Transferencia de masas en la F. Estacionaria
L-L: C
E
es directamente proporcional al cuadrado del
espesor de pelicula inmobilizada e inversamente
proporcional a la velocidad de difusion del analito
L-S: C
E
es directamente proporcional al tiempo
necesario para adsorberse/desorberse de la superficie
solida e inversamente proporcional a la constante de
velocidad de primer orden con que se da este proceso

E
f
E
D k
u d qk
u C
L
2 '
2 '
) 1 ( +
=
2 '
'
) 1 (
2
k
u k t
u C
D
E
S
+
=
Ensanchamiento de banda intracolumna
Transferencia de masas en la F. Movil
Proceso muy complejo. Solo se conocen las variables
que lo gobiernan. Velocidad de transferencia de masa:
Inversamente proporcional a la velocidad de difusion
del analito en la fase movil
Directamente proporcional al cuadrado del diametro
de la particula de la soporte solido
Directamente proporcional a la velocidad lineal de la
F. Movil
u
D
u d f
u C
M
p
M
) , (
2
=
Ensanchamiento de banda intracolumna
Difusion de Eddy (proceso multipaso)
Multitud de caminos posibles por donde puede atravesar el
analito.
A u > nro de transferecia de caminos por lo que la
velocidad analito tiende velocidad media
A u
mod
< nro de transferecia de caminos por lo que habra
mayor ensanchamiento de banda
A u el efecto de ensanchamiento de banda por
multiplicidad de caminos es independiente del caudal.

Fig 24.8 SL y 3.8 Q
Ensanchamiento de banda intracolumna
Difusion de Eddy
Fracciones de F. Movil estancada en fase estacionaria:
el analito debe difundir de los liquidos estancados antes
que pueda producirse la transferencia con la F. Movil en
movimiento y la F. Estacionaria:
Fenomeno directamente proporcional u
Fenomeno inversamente proporcional a la D
M
Fenomeno directamente proporcional al diametro de
particulas debido a que aumenta el tamano de poro

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Ecuacion de Van Deemter
Variable influyentes en el
ensanchamiento de bandas
Diametro de particulas
Viscosidad de la F. Movil
Diametro de columna
Mejor empacamiento de
columna
Temp.: reduce D
Grosor de la F.
Estacionaria
Fig. 24.9 y24.10 SL
u C u C
u
B
H
M E
+ + =
Ensanchamiento de banda extracolumnar
Dispersion del pico: o
T
2







En la o
T
2
, o
ec
2
es constante. Esto implica que el o
ec
2
es
mas relevante:
Para picos poco retenidos
H pequenos
Menor radio de la columna

porosidad HL r
T T ic
inyeccion ector uniones tuberia ic T
ec ic T
: ; ) (
2 2 2
2 2
det
2 2 2 2
2 2 2
c tc o
o o o o o o
o o o
=
+ + + + =
+ =
Ensanchamiento de banda extracolumnar
Detector
Contribuciones:
Componenete hidraulicos:
Tuberia y uniones:
Longitudes minimas
Diametros minimos
Volumen de celda: 1/10 volumen del pico
Geometria de celda: tal que evite turbulencias
Componente electronico
Constante de tiempo (t): 10% W

t muy pequena (rta. rapida): senal ruidosa
t muy elevada (rta. lenta): perdida del pico,
aplastamiento o confusion con el adyacente
Ensanchamiento de banda extracolumnar
Volumen de partes del cromatografo (inyector
detector); Volumen de inyeccion
Volumen de partes del cromatografo (inyector detector)
Longitudes y diametros de tuberias y conexiones
minimos
Efecto menos notorios para picos con k elevados
Volumen de inyeccion:
V
iny.max.
2
=(utc
T
Kr
2
)
2
HL
u: incremento de variancia permitido (5%)
K: cte. Dependiente del perfil de inyeccion (K
2
=12,
perfil de inyeccion normal)
Valores recomendados:
Dolan: 1/6 volumen del pico de interes
Novotny: 17 ul, col. Convencionales y 1.7 ul para
col. microbore


OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA
Finalidad: lograr separacion de analitos en el menor
tiempo posible mediante:
Reduccion de ensanchamiento de picos: H
Modificacion de la velocidad relativa de migracion: o
y k
Resolucion: medida cuantitativa de la capacidad de
separacion
R=1,5: separacion completa de 2 analitos
R=0,75: separacion incompleta de 2 analitos

Fig 24.11 SL



2 2
B A
W W
z
R
+
A
=
OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA
Influencia de la R sobre el t
B
Efectos cineticos que contribuyen al ensanchamiento
de bandas
Termino de selectividad que depende del analito
Termino dependiente del analito y la columna
Factores termodinamicos que no dependen de N ni L





Influencia de k y o sobre R





4
1
1
'
'
N
k
k
R
B
B

|
.
|

\
|

|
|
.
|

\
|
+
=
o
o
( )
( )
2
2
'
3
' 2
1
1 16
|
.
|

\
|

=
o
o
B
B
B
k
k
u
R H
t
OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA
Efecto de la variacion de k
sobre R

Q
k
k
R
B
B

|
|
.
|

\
|
+
=
1
'
'
( )
( )
3
2
'
'
'
1
B
B
B
k
k
Q t
+
=
0 5 10 15 20 25 30 35
0
1
8
10
12
14


R
/
Q

o

T
/
Q
'
k'
R/Q
t/Q'
Orden de variacion:
1. N
2. k
3. o

APLICACIONES: ANALISIS CUALITATIVO
Mediante identificacion de picos
En funcin datos cromatograficos solamente
Tiempo de retencion
Grafica de Log t
R
vs. Nro. de atomos de carbono
Indice de Kovats
Multiples columnas
Respuesta de dectores relativas
Pretratamiento de muestra
Cromatografias secuenciales
En funcin datos cromatograficos y otros datos
Analisis de grupos funcionales y elementales
Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas
Retencion de picos
Sin identificacion de picos
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion

Principios fundamentales de la identificacion

1. Si el t
R
de un componenete A es igual al del
componenete desconocio, esto no prueba que el
compuesto desconocido es el componente A

2. Si el t
R
de un componenete A no es igual al del
componenete desconocio, esto prueba que el
compuesto desconocido no es el componente A

3. Si no se observa ningun pico al t
R
del compuesto A,
esto prueba que el componente A no esta presente en
la muestra, al menos a los niveles de deteccion de la
tecnica

Factores a tener en cuenta en la precision de los datos

Control de temperatura
1% repetividad en t
R
, debe mantenerse la T en 0.3
o
C
Control de flujo del F. Movil
1% de variacion de flujo afectara 1% el t
R
Volumen de inyeccion
Sobrecarga varia los t
R
Empaque, cantidad de F. Estacionaria, antigedad, usos
previos, etc.

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion

t
r
= f(condiciones experimentales)
Comparacin anlito y compuesto de referencia analizado igual
condiciones
Ms aconsejable aadirlo a la mezcla
Cpto no
retenido
Cpto referencia
Analito
t
m

t
R(S)

t
R(a)

t
R
= t
R
- t
m

r(a,s) = t
R
(a)/t
R
(s)
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion
Basada en la dependencia lineal entre entre Log t
R
y
Nro. de atomos de carbono de una serie homologa
Sencilla de armar: basta con 2 puntos
Fig 7.3, pag399,Grob

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de grafica de Log t
R
vs. Nro. de atomos de carbono
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de Indice de Kovats
Basado en una serie normal de alcanos como referencia
Teoria:
A: anlito
N y n: nro. de C alcanos
V
A
: volumen de eluc. de A corregido
Practica: requerimientos
Al menos 3 alcanos de serie homologa
Al menos uno eluira antes y el otro luego del analito A

Fig 7.4 400 Grob
|
|
.
|

\
|

+ =
' '
' '
log log
log log
100 100
N n
N A
V V
V V
N I
El uso de 2 o mas columnas incrementa la probabilidad
de acertar la identificacion de un pico desconocido, pero
no es conclusivo
Las columnas deben ser diferentes basadas en los
indices de Mc Reynolds
La caracterizacion se basa en el indice de retencion
relativo del pico desconocido
Tambien debe corresponder la caracterizacion
cuantitativa del pico desconocido con las distintas
columnas

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de multiples columnas
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de respuesta de dectores relativas
Detectores selectivos
El flujo de la salida de la
columna es dividido hacia
2 o mas detectores
Cromatografia de peso
molecular (GC)
Basada en la senal de
dos detectores de
ensidad de gas, dos
columnas y dos gases de
distinta densidad (Ej: CO
2

y SF
6
)
Fig 7.5 403 Grob
( )
1
2
1
1
2
1
2

|
|
.
|

\
|

|
|
.
|

\
|

=
A
A
K
MW MW
A
A
K
MW
GC GC
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de cromatografias secuenciales
Cromatografia bidimensional
Precolumnas de retencion
Precolumnas de reaccion
Pirolisis controlada (GC)
Analisis de grupos funcionales y elementales
Examinacion preliminar
Medicion de variables fisicas (bp, ind. de refraccion,
densidad)
Reacciones selectivas
Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas
LC-ESI-MS, LC-CI-MS, LC-TOF MS, LC-AAS, LC-
ICP-OES, LC-ICP-MS.
Retencion de picos
Purge and trap

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de datos cromatograficos y otros datos
Fingerprints
Para identificacion de un grupo de picos
No se realiza una identificacion individual del pico
Basado en la apariencia general de los picos, tR vs. Conc. y la
relacion de area de picos definidos
ANALISIS CUALITATIVO
Sin identificacion de picos
APLICACIONES: ANALISIS CUANTITATIVO
Normalizacion de areas
Estndar externo
Sin agregado de estndar interno
Con agregado de estandar interno

ANALISIS CUALITATIVO
Tiempo de retencion
Grafica del Log t
R
vs. Numero de carbono
Indices de Kovats
Multiples columnas
Respuesta de diferentes detectores
Pretratamiento de muestra
Cromatografia en serie
Analisis cuantitativo
Rapidez
Simplicidad
Costo bajo
Gran aplicabilidad
Informacion cuantitativa
APLICACIONES
Analisis cuantitativo
Calibracion baseada en:
Altura de pico
Area de pico

Metodos de cuantificacion:
Estndar externo
Sin agregado patron
Con agregado patron
Normalizacion de areas

CROMATOGRAFIA DE GASES

CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Analisis de grupos funcionales y elementales

APLICACONES