Prof: Liliana Castro

ANTICUERPOS MARCADOS:
LOS ANTICUERPOS POR SU EXQUISITA ESPECIFICIDAD PARA DETERMINADOS ANTGENOS HACE QUE SEAN REACTIVOS MUY TILES PARA DETECTAR, PURIFICAR Y CUANTIFICAR AGS.

ANTICUERPOS MARCADOS:

ANTICUERPOS MARCADOS:
EXISTEN TCNICAS BASADAS EN ACS PARA ESTUDIAR PRACTICAMENTE CUALQUIER TIPO DE MOLCULA EN SOLUCIN O EN CLULAS.

ANTICUERPOS MONOCLONALES O POLICLONALES

ANTICUERPOS MARCADOS:
Anticuerpos monoclonales: Son aquellos Acs que derivan de un slo clon de linfocitos B y son especficos para un eptope determinado, constituyendo una poblacin homognea Anticuerpos policlonales: Son aquellos que proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados.

Obtencin de Anticuerpos Monoclonales:

1. Inmunizacin de animales contra el antgeno para el que se desea producir Anticuerpos (Resp poli) 2. Fusin de los linfocitos B esplnicos(memoria) con clulas de mieloma formando hibridomas
3. Seleccin de aquellos hibridomas que sean productores de las inmunoglobulinas especficas deseadas

4. Clonacin

Clulas empleadas para la Obtencin de Anticuerpos Monoclonales:

1.- Un linfocito B de un animal previamente inmunizado con el Ag de inters, que aporta la memoria inmune y la capacidad de producir Acs contra el Ag especfico. 2.- Una clula tumoral de mieloma no secretora de Acs, deficiente en la enzima hipoxantina- guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), til en el proceso de seleccin posterior de los hibridomas, que aporta su capacidad de divisin ilimitada (inmortalidad).
3.- De sta unin surge un tipo de clula inmortal con la capacidad virtualmente ilimitada de produccin de Acs monoclonales, llamada hibridoma.

Obtencin de Anticuerpos Monoclonales:

REACCIONES CON ANTICUERPOS MARCADOS:

Son tcnicas de INTERACCIN PRIMARIA, las cuales son muy sensibles y permiten la identificacin de Ags o Acs.
Existen 3 tipos de tcnicas que se basan en la interaccin primaria: 1.- Los enzimoinmunoensayos (EIA), 2.- Los radioinmunoensayos (RIA) y 3.- Las tcnicas de inmunofluorescencia (IF).

ANTICUERPOS MARCADOS:
Las seales detectadas en las tcnicas son: 1.- Colorimtricas EIA(enzimoinmunoensayo), 2.- Radioactivas RIA(radioinmunoanlisis) o 3.- Fluorescentes IF(inmunofluorescencia),
Se deben a un reactivo denominado: CONJUGADO, que consta de un Ag o un Ac unido a una enzima, a un radioistopo (en cuyo caso particular se denomina trazador o radioligando) o a un fluorocromo

Enzimoinmunoensayo (EIA):
Son denominados tambin ELISA de fase slida (enzyme-linked immunosorbent assay): Se cuenta con una fase slida en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes. (Ag o Ac) La inmovilizacin, tambin llamada sensibilizacin, es la unin del Ag o Ac a la fase slida.

ELISA de fase slida: (enzyme-linked immunosorbent assay):

Se usan para detectar y cuantificar anticuerpos y antgenos.

Enzimoinmunoensayos (EIA):
Las enzimas ms usadas son: 1.- Peroxidasa de rbano (HRPO o horseradish peroxidase) 2.- Fosfatasa alcalina (FA) 3.- Glucosa Oxidasa 4.- Lisozima 5.- Glucosa 6-P deshidrogenasa 6.- -Galactosidasa

Enzimoinmunoensayos (EIA):
Substratos correspondientes: 1.- P-nitrofenilfosfato 2.- Ortofenilendiamina 3.- Ortodianisidina 4.- Sustratos incoloros

Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA):

1.- Mtodos no-competitivos a) EIA con Ag unido a la fase slida - Mtodos directos - Mtodos indirectos b) EIA con Acs unidos a la fase slida

Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA):

2.- Mtodos competitivos a) EIA con Acs unidos a la fase slida b) EIA con Ag unido a la fase slida 3.- ELISPOT

EQUIPOS NECESARIOS
PIPETAS

LECTOR DE TIRAS ELISA

LAVADOR DE PLACAS

LECTOR DE PLACAS ELISA

Los ELISA no competitivos: Pueden ser cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos. Existen distintos tipos de esquemas: Tipo directo, sandwich o indirecto.

(ensayo ELISA simple de dos capas)

Ag + Ac-E

Ag-Ac-E

Indica la presencia de Ag en la solucin analizada

ELISA directo

RECOMENDACIONES:
1.- Incluir Controles Negativos que sern mxs del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del Ag buscado.
2.- Incluir Controles Positivos (soluciones donde se encuentra el Ag buscado, o bien se le ha aadido). 3.- Pocillo Blanco o de aire

ELISA directo : DESVENTAJAS: 1.- Poco empleados 2.- Necesidad de disponer de un conjugado enzimtico para cada Ag que pretendamos detectar
-

El sistema de deteccin emplea dos Acs: - uno primario contra el Ag, y - uno secundario marcado contra el primario.

ELISA indirecto:

ELISA INDIRECTO

(peroxidasa, fosfatasa alcalina

Leer la D.O. mediante espectrofotometra

ELISA sandwich:
Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el 2do Ac.

(SANDWICH)

Ac 2rio Ac 1rio

La deteccin tiene > sensibilidad por la amplificacin de seal debida a la unin de 2 o ms Acs 2rios x cada 1rio.

ELISPOT:
Es una modificacin del ELISA

Permite la deteccin cuantitativa del N de cl en una poblacin que produce Acs especficos contra un Ag determinado (o viceversa)

LECTURA del ELISA:

LECTURA del ELISA:

La seal ser siempre proporcional a la [ ] de la molcula incgnita

ELISA: mtodo competitivo:

Se basa en la competencia que se establece entre un Ag marcado enzimticamente y el mismo Ag sin marcar (muestra objetivo), al ser colocados frente a una cantidad limitada del Ac homlogo fijado a la fase slida.

La cantidad de Ag es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado.

VENTAJAS DEL ELISA

1.- Alta sensibilidad y especificidad 2.- Estabilidad de los reactivos 3.- Costo accesible 4.- Fcil manipulacin, rapidez. 5.- No representa riesgos de contaminacin

APLICACINES DEL ELISA

1.- DETECCION DE Ac CONTRA AGENTES INFECCIOSOS: Enfermedades Bacterianas: Tifus, brucelosis, salmonelosis Enfermedades Parasitarias: Chagas, toxoplasmosis, amibiasis Schistosomiasis, malaria. Enfermedades Virales: Hep. A,B,C. rubola, CMV, EBV Enfermedades Micoticas: Candidiasis, aspergilosis, etc 2.- Deteccion de hormonas: ACTH,insulina, TSH, T3,T4, etc 3.- Deteccion Igs 4.- Marcadores tumorales: CEA, alfafetoporteina, CA-19, CA-125, etc

Radioinmunoensayo(RIA):
Una sustancia marcada (radioactiva) se utiliza directa o indirectamente para medir de forma cuantitativa la sustancia no marcada, utilizando para ello Acs especficos.
ISTOPOS MS UTILIZADOS: I125, I131, C14

Radioinmunoensayo:
Se clasifican en:
1.- Directo o competitivos (RIA) y 2.- Indirecto o no competitivos (RBA, IRMA: Inmunoradiometra ).

Radioinmunoensayos:
Directo o competitivos (RIA):
Ags marcados o trazador (Ag*) con istopos radioactivos reaccionan con Acs especficos, la [ ] de Ac se obtiene midiendo la emisin radioactiva producida por la formacin de complejos.

Radioinmunoensayos:
Ensayos competitivos (RIA):
Ag* Ag*Ac Ac + Ag AgAc

Radioinmunoensayos:
2.- Indirecto o no competitivo:(RBA, IRMA) Capacidad de un istopo de competir con otro Ag marcado ante una cantidad conocida de Ac, de forma que se produzca inhibicin de la rx Ag-Ac y se pueda medir la cantidad de material no marcado que se agreg, pudiendo establecerse una proporcin entre el Ag marcado y el libre.

RIA:
Una vez separadas las fracciones se mide la radioactividad y se obtienen grficos de desplazamiento o curvas dosis-respuesta que permite encontrar la [ ] de cualquier de Ag no marcado que sea desconocido.
Hiprbolas
cpm

Sigmoideas
cpm

Rectas
Logit B/ Bo

Dosis

Log Dosis

Log Dosis

Radioinmunoanlisis (RIA)
Caractersticas:
1.- Mtodo de gran sensibilidad 2.- No exentos de inconvenientes (empleo de istopos radiactivos) 3.- Gran auge en sus comienzos (dcada 60) 4.- En la actualidad de empleo mas restringido 5.- Muchas aplicaciones han sido sustituidas por otras tcnicas que ofrecen mas ventajas 6.- Son las ms sensibles de las tcnicas. 7.- Los equipos que se usan para su medicin son sumamente sensibles.

Radioinmunoanlisis (RIA)
Aplicaciones:
1.- Deteccin y cuantificacin de Ags y Acs, en labs de Bioqumica
2.- En la Endocrinologa para cuantificar hormonas y drogas con exactitud. ([ ] entre pico y femtomolares).

Quimioluminiscencia:
Es un mtodo de lectura que se basa en el principio de emisin luminosa a travs de una reaccin (Enzima-Sustrato).

Indicadores o molculas quimioluminiscentes utilizados:

- Luminol - Isoluminol - ster de acridina -Tioesteres y sulfaminas, y - steres de fenantreno.

Marcadores de enzimas
- Fosfatasa alcalina, - Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, - Peroxidasa del rbano, - La luciferasa de la renilla, y - La xantina oxidasa

La quimioluminiscencia es un mtodo Automatizado, el tiempo de elaboracin de la pba es mucho ms corto y mucho menos tedioso. Disminuye el riesgo de efectos operadores en las determinaciones inmunolgicas.

MECANISMO DE REACCIN
La emisin de luz se produce por una rx especfica qumica. Se involucran las siguientes sustancias segn el sistema automatizado que sea utilizado: -ster de acridina, perxido-cido, hidrxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de sta rx el agente quimioluminiscente es el ster de acridina que es oxidado por el perxido-cido y el hidrxido de sodio.

Ventajas de la quimioluminiscencia:
1.- Sensibilidad (lmites de deteccin de moles, nanogramos, picogramos) 2.-Velocidad (seal generada en unos pocos segs y en algunos casos estable por varias horas) 3.- Sin residuos peligrosos, y 4.- Procedimientos simples. Aplicaciones: -En inmunoensayos, -Marcaje de protenas, -Ensayos en molculas de DNA.

Inmunofluorescencia
Consiste en inmovilizar clulas, bacterias u otras partculas naturales sobre un portaobjeto o similar, donde la incgnita puede ser tanto: 1.- Ag [se puede realizar una inmunofluorescencia directa (IFD)] o 2.- Ac [una I indirecta (IFI)].

I. DIRECTA

I. INDIRECTA

Inmunofluorescencia
FLUOROCROMOS: Sustancias qumicas capaces de emitir luz cuando son excitadas por una determinada longitud de onda. FLUOROCROMOS MAS UTILIZADOS. 1.- RODAMINA. (Isotiocianato de tetrametilrodamina) 550nm . Rojizo 2.- FLUORESCENA: (Isotiocianato de fluorescena) 490-495 nm. Amarillo/verdoso 3.- NARANJA DE ACRIDINA

Inmunofluorescencia directa (IFD):

Fluorocromo unido al Ac especfico. Empleada para deteccin de Ags en diferentes muestras. Principal inconveniente: Necesidad de disponer de difs Acs conjugados (uno por cada tipo de Ag que se quiera detectar)

Secuencia de reaccin: Ag + Ac-F

Ag-Ac-F

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

- Reaccin en 2 pasos - Posibilidad de determinar la clase de Acs, mediante el empleo de conj anti-IgG, anti-IgM o anti-IgA - Pruebas relativamente rpidas

Secuencia de reaccin:
Paso 1: Ag + Ac1 Paso 2: Ag-Ac1 + Ac2-F Ag-Ac1-Ac2-F Ag-Ac1

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

NEGATIVO

POSITIVO

Inmunofluorescencia
Ventajas: 1.-Permite identificar Ag especficos de patgenos en tejidos, cultivos de clulas y secreciones (IFD o IFI). 2.- Permite identificar Ac especficos en suero(IFI)

Inmunofluorescencia
Desventajas 1.- Se debe utilizar microscopio UV. 2.- Personal capacitado. 3.- Infraestructura necesaria. 4.- Fundamentalmente Cualitativa 5.- Poca reproducibilidad (subjetividad del operador).