Curso: Biologa Celular y Molecular

Oscar Nolasco Crdenas MSc.

oscarnol@hotmail.com
Noviembre 2012

DNA - historia
1866 Gregor Mendel Publico sus resultados sobre los factores de la herencia.

1868 descubrimiento de la nucleina (DNA) Friedrich Miescher

1902 Walter Sutton Interrelaciona la citologa y el Mendelismo (morfologa & herencia). Cromosomas son unidades hereditarias. Esta teora tambin fue desarrollada por Theodor Boveri

1928 Fred Griffith Propuso la existencia de un principio transformante en sus ensayos con diplococos.

1944 Oswald Avery,Colin MacLeod,Maclyn McCarty. Reportaron que el principio transformante de Griffith era el DNA.

Oswald Avery Colin McLeod

Neumococos R vivos inoculados junto con neumococos S inactivados por calor producan la muerte del ratn

Maclyn McCarty
live S strain

1950 Erwin Chargaff Determino que los organismos vivos presentan una razon constante entre Adeninas con Timinas y Guaninas con Citocinas.

1951 Rosalind Franklin Obtuvo las fotografias de difraccion de rayos X del DNA

Rosalind Franklin

Maurice Wilkins

1952 Martha Chase y Alfred Hershey empleando bacteriofagos marcados con 35S y 32P demostraron que el DNA es una molcula hereditaria

1953 Francis Crick y James Watson resolvieron la estructura tridimensional del DNA.

1958 Matthew Meselson y Frank Stahl empleando isotopos demostraron la propiedad semiconservativa de la replicacin del DNA.

1958 Arthur Kornberg Purifico la DNA polimerasa I de E. coli, La primera enzima que sintetisa DNA en un tubo de ensayo 1966 Marshall Nirenberg, H. Gobind Khorana Led descifran el cdigo gentico determinan que los codones (tripletes de nucleotidos de mRNA) son especficos para un aminocido. 1970 Hamilton Smith Kent Wilcox Aislo la primera enzima de restriccin, HindII: que corta el DNA en un sitio de reconocimiento especifico. 1977 Fred Sanger Desarrolla el mtodo del nucleotido terminador para el secuenciamiento de DNA. 1978 Somatostatin es la primera hormona humana en producirse por la tecnologia del DNA recombinante. 1983 Kary B. Mullis Propuso el mtodo de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar DNA 1988 - 2003 Se desarrolla el proyecto genoma Humano 2007 DNA de J Watson secuenciado en 2 meses 454 Life sciences (ROCHE)

EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

DNA
.

Replicacin

CCTGAGCCAACTATTGATGAA

transcripcin Reversa RNA CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA traduccin Protena

PEPTIDE

Acido Nuclico: polmero de nucletidos

Componentes de un nucletido:
base N + pentosa + fosfato

Componentes de un nuclesido:
base N + pentosa

Azcares de los cidos nuclicos

DNA
Bases nitrogenadas de los cidos nuclicos

RNA

(DNA)

(RNA)

Nomenclatura de nucletidos y nuclesidos BASE Purinas Adenina Adenosina Desoxiadenosina Guanina Guanosina Desoxiguanosina Adenilato RNA Nuclesido Nucletido Acido nucleico

Desoxiadenilato DNA Guanilato RNA

Desoxiguanilato DNA

Pirimidinas
Citocina Timina Uracilo Citidina Deoxicitidina Timidina o deoxitimidina Uridina Citidilato Deoxicitidilato Timidilato o deoxitimidilato Uridilato DNA DNA DNA RNA

Caractersticas de los Nucletidos

Las bases nitrogenadas se unen al azcar por enlace B glucosidico

Los nucletidos en el DNA se unen mediante enlace fosfodiester

Apareamiento de bases en el DNA: Puentes de hidrogeno

A
C

T
G

DNA: Dos hebras antiparalelas forman la doble hlice de DNA

A Vista del enlace de las bases B Vista de inicio a fin de las cadenas

Formas de DNA

Forma A

Forma B

Forma Z

Sentido de la helice Diametro Bases por torcion

Hacia la derecha aprox 26 11

Hacia la derecha aprox 20 10.5 3.4

Hacia la izquierda aprox 18 12 3.7

Distancia entre pares de bases 2.6

La forma B es referida a la de Watson Crick Z alternancia de G y C, presente como segmentos en eucariotes y procariotes, con funcion quizas regulatoria de expresin

El DNA puede disociarse o asociarse por la complementaridad de su secuencia nucleotidica: Denaturacin reversible del DNA

La renaturacin permite hacer anlisis de hibridacin cuando se mezclan dos hebras de DNA que comparten cierto grado de similaridad en su secuencia

La denaturacin esta relacionada al % de GC.

Organismos que presentan mayor % de GC en su secuencia genmica soportan temperaturas altas

Una secuencia con mayor % de GC presentara un tm mayor que una secuencia con alto contenido de AT (El tm es la Temperatura media de Melting o de disociacin en el que la denaturacion de las hebras de ADN es del 50%)

Debido a las bases nitrogenadas el DNA absorbe luz ultravioleta. El efecto denominado hipercromicidad se da al denaturar el DNA, as las bases estn expuestas y puede absorber mayor cantidad de luz ultravioleta

Replicacin de DNA

Replicacin del DNA segn Watson y Crick

La replicacin

Ocurre en un origen de replicacin nico en DNA circulares (plasmidos)

En eucariotes es complejo y se da en varios origenes de replicacin

La sntesis de la nueva hebra es en sentido 5

a 3

La sntesis de DNA en E. coli, Empieza con la unin de protenas dnaA a la secuencia de origen (ori)
Secuencia Ori 5 3

3 5

Unin de protenas de dnaA

La regin rica en A T es denaturada y hexameros de DnaB (helicasa) se unen al DNA en colaboracin con DnaA

Iniciacin de la sntesis de DNA en E. coli origen (ori)

Secuencia Ori
5 3

A A

3 5

Unin de protenas dnaA

A A
A

Induccin de la denaturacin del DNA por las protenas de dnaA

Las protenas dnaB y dnaC se unen al single-stranded DN

A
A A

A
A

B C

dnaB desenrrolla el DNA

Se une la dnaG (primase)

A
A A

B C
A

dnaB desenrrolla las hlices, desplazando a las dnaA

A
A A

...y se sintetiza un cebador RNA primer

A
A A

B C

RNA primer

G B C

Primasoma dna B (helicasa) dna C dna G (primasa)

DNA molde (template strand) 3 3 OH 5 RNA primer (~5 nucleotidos)

 DNA girasa es una topoisomerasa II, que rompe el DNA e introduce

superocoil negativo a la cabeza de la horquilla de replicacin Fluoroquinolona inhibe DNA girasas en muchas bacteras gram-negativas: ciprofloxacina y levofloxacina (Levaquin)

Telomeros y edad
Metaphase chromosome

Telomeros son capuchones protectivoscaps sobre el extremo de los cromosomas y consisten de repeticiones cortas en tandem de 5-8 bp de una secuencia rica en GC, Previenen desde fusiones Cromosomas y rearreglos del kariotipo.

telomero

centromero

telomero <1 to >12 kb (TTAGGG)muchos Edad joven

telomero estructura

(TTAGGG)poco

Edad senil

telomerasa (una enzima) requerida para mantener la longitud de las clulas germinales La mayora de las clulas somaticas disminuye el nivel de la actividad de la telomerasaevels of telomerase y asi sus cromosomas se acortan en cada divisin

32

Mecanismo de duplicacin en el DNA mitocondrial

La duplicacion se inicia en el loop D

Duplicacin en el proceso de conjugacin bacteriana. Transferencia del pili F (plasmido sexual)

Organizacin comn de las DNA polimerasa

Los nucletidos adicionados son nucletidos trifosfatos

El mecanismo involucra iones Mg que coordinan con el grupo fosfato y tres residuos Asp de La enzima DNA polimerasa

Las enzimas polimeras tienen un mecanismo de relectura o de proofreading (actividad exonucleasa 3 a 5) Evita la mala incorporacin de un nucleotido La DNA polimerasa controla la fidelidad de la replicacin

Sistemas de reparacin corrigen el dao en el DNA

El sistema de excision de nucleotido NER repara los daos provocados por radiacin ultravioleta: Puede ocurrir la reparacin en forma global o acoplada a la transcripcin

El sistema de reparacin excision de base BER, repara daos de deaminacion o rupturas en una sola cadena

El sistema de reparacin por recombinacin homologa HR y de unin de extremos EJ, reparan la ruptura de las cadenas de DNA

Sistema de reparacin de una mala incorporacin o mal apareamiento MMR

Cambios tautomricos durante la replicacin

Cromosomas

El DNA es altamente comprimido en todos los tipos de genomas

En el bacteriofago

En bacterias

En mamiferos

Los cromosomas estn divididos en distintas regiones. Un bandeo caracterstico se da por facilidad de coloracin de algunas regiones, se desconoce el porque solo se conoce que las regiones decoloradas contienen mas cantidad de GC

 En eucariotas, el DNA se encuentra empaquetado con proteinas histonas dentro de la cromatina. Las unidades bsicas de la cromatina son los nucleosomas.

Organizacin del DNA en el cromosoma

Estructura de los nucleosomas

Nucleosoma
146 pb de DNA alrededor de 8 molculas de histonas Cinco tipos de histonas 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el ncleo octamrico H1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma 2 vueltas adicionales de DNA 200pb

Modificaciones covalentes de las histonas regulan la funcionalidad del DNA

Los eventos epigenticos son aquellas variaciones en la expresin de un gen que no se acompaan de cambios en la secuencia de DNA. Las cadenas laterales de las histonas sufren modificaciones. Modificaciones postraduccionales: Acetilacin Fosforilacin Metilacin(ms estable) Otras

HISTONAS

Acetilacin de histonas
Se produce en residuos de lisina y es reversible. Las histonas acetiladas estn asociadas a la cromatina transcripcionalmente activa y las histonas desacetiladas a la cromatina inactiva. La acetilacin neutraliza la carga positiva de las lisinas.

HATs
Histona acetiltransferasas. Estas modificaciones ocurren en el extremo amino terminal de las histonas. La primera familia de las HATs es la superfamilia GNAT, que incluye las protenas que envuelven, unen e inician la transcripcin como la Gcn5 y PCAF, elongacin como Elp3.

HDACs
Estn asociados a complejos proteicos. Se han encontrado deacetilasas en subunidades de complejos polipeptdicos que actan como correpresores y silenciadores de genes. La Rpd3 y Hda1eliminan grupos acetil crticos de las histonas, empaquetando la cromatina en una forma inactiva (heterocromatina).

 La formacin de la heterocromatina es mediado por protenas Sir2, Sir3 y Sir4, estudios recientes han encontrado que Sir2 presentan un Nad dependiente de la actividad HDAC. Tambin se ha visto que la desacetilacin de la lisina 16 de H4 es importante para la interaccin de Sir3 y Sir4.

Metilacion de Histonas
Es uno de los mecanismos de regulacin que pta diversas funciones asociadas a la activacin o a la represin de un gen.

HMTs