INMUNOLOGA II

UNIDAD II
METODOS INMUNOLGICOS ESPECIALES

Prof. QFB Jos Alberto Pia Ibarra

japina@uas.uasnet.mx

http://fcqb.uasnet.mx:8100/~apina/
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Reacciones Ag - Ac

Aglutinacin y precipitacin Fijacin del Complemento Mtodos Inmunolgicos Especiales Combinadas con electroforesis Inmunoelectroforesis y Western Blot Inmunofluorescencia Inmunoensayo : ELISA y RIA Varias : Inmovilizacin, serotipos, neutralizacin, proteccin Inmunomicroscopa Electrnicos

ELECTROFORESIS
En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y

aplica este nuevo mtodo al fraccionamiento de protenas plasmticas, identificando as los anticuerpos como las protenas del suero que se desplazan ms lentamente. Esta fraccin recibi el nombre de gamma-globulina, quedando as asociados temporalmente, los conceptos de anticuerpo y de gammaglobulina, como equivalentes.

Fig. 1

 Posteriormente, se comprueba que no

todos los anticuerpos migran electroforticamente con las gammaglobulinas, sino que muchos de ellos lo hacen con las alpha y beta globulinas. Esto se observ analizando los niveles de las distintas fracciones de globulinas antes y despus de la inmunizacin de animales con un antgeno.
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 Se concluye entonces, que no todos los

anticuerpos son gammaglobulinas, por lo que Hebermans propone el trmino de inmunoglobulinas para designar a todas las sustancias con capacidad de anticuerpo. Hoy se conocen cinco tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas con ciertas caractersticas distintas
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Combinadas con electroforesis

Finalidad separacin electrofortica componentes Ag Inmunoelectroforesis (Grabar y Williams)

Contrainmunoelectroforesis (Laurell 1) Inmunoelectroforesis en cohete (Laurell 2) Western Blot

Significado clnico

Es una tcnica inmunoqumica basada en la precipitacin que tiene lugar cuando una protena reacciona con su antisuero especfico, en condiciones bien determinadas. Es un mtodo analtico que se desarrolla en dos etapas, en el que una mezcla de protenas es sometida a separacin electrofortica y, posteriormente, al estudio inmunoqumico (inmunodifusin). Para su interpretacin se compara las bandas de precipitacin del suero problema con el suero testigo normal.

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INMUNO ELECTROFORESIS
Nombres alternativos Electroforesis de inmunoglobulina en suero; electroforesis de gammaglobulina

Es una tcnica de laboratorio en la que se emplea una combinacin de electroforesis protenica y una interaccin antgeno-anticuerpo. La electroforesis de protenas se refiere a las inmunoglobulinas como grupo. La inmunoelectroforesis aumenta la capacidad para identificar las inmunoglobulinas especficas mediante el uso de anticuerpos especficos para las protenas de inters.
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Separacin por electroforesis + Identificacin por Inmunodifusin doble

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DESARROLLO DE LA TECNICA
Se cubre un portaobjetos con agar o agarosa.
Con un adminiculo adecuado se corta un pozo

para el antgeno y un canal para el anticuerpo. La muestra de suero se coloca en el pozo y se separa en un campo elctrico Se coloca el antisuero en el canal y se permite que el suero y los anticuerpos se difundan durante 18-24 HR. Las lneas resultantes pueden fotografiarse, o bien se puede lavar, y teir la laminilla para un registro permanente.
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Utilidad clnica

Diagnstico de gamapatas monoclonales por ej. mieloma y macroglobulinemia de Waldestrm.

Evaluacin de gamopatas monoclonales Enfermedades linfoproliferativas (linfomas malignos)

Diagnstico y caracterizacin de estados inmunodeficientes y disgamaglobulinemias

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INMUNOFLUORESCENCIA

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ANTECEDENTES HISTORICOS
La inmunofluorescencia descrita por Coons en 1941, consiste en revelar motivos antignicos presentes sobre la estructura celular o tisular mediante la aplicacin sobre las molculas de los tejidos de un antisuero especifico que previamente se vuelve fluorescente por la fijacin de fluorocromo.
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INMUNOFLUORESCENCIA

Conjunto de tcnicas diagnsticas empleadas para la deteccin de un antgeno o un anticuerpo en clulas o tejidos, mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas fluorocromos. Se emplean, de manera habitual, en el diagnstico de enfermedades autoinmunes.

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INMUNOFLUORESCENCIA

La marcacin de la Inmunoglobulina , que debe respetar la actividad anticuerpo, se obtiene poniendo en contacto anticuerpos purificados con el fluorocromo, y despus se elimina el exceso de fluorocromo por dilisis o filtracin sobre gel Sephadex.

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Fluorforos: hidrocarburos poliaromticos o heterociclos), llamados fluorforos o colorantes fluorescentes.

HO

O C OH R2

Fluorescena
R1

Los fluorocromos mas empleados :

Son el isotiocianato de fluorescena, que da una fluorescencia verde, y el isotiocianato de rodamina, que da una fluorescencia de color naranja.

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Tcnicas de Inmunofluorescencia:
a) Directa b) Indirecta c) De sndwich d) Complemento
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Fluorescencia
1944, A. Coons Acs conjugados fluorocromos

Fluorescencia Directa Indirecta

(Ac primario) (Ac. Secundario)
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INMUNOFLUORESCENCIA
INMUNOFluorescencia directa:

Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos marcados con fluorocromos se unen directamente al antgeno.

INMUNOFluorescencia indirecta:

Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos especficos no marcados se unen, en una primera etapa, al antgeno y, en una segunda etapa, al anticuerpo marcado con fluorocromo. Se denomina tambin inmunofluorescencia tipo sndwich, y su principal ventaja, frente a la inmunofluorescencia directa, es su mayor sensibilidad.
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Inmunofluorescencia directa:
La que mas se emplea para los cortes de tejido. Es por lo general, una prueba inmunohistoqumica ya que se utilizan anticuerpos marcados con especificidades conocidas para hacer visibles los antgenos correspondientes en frotis o en cortes de una sola capa de los materiales que llevan el antgeno.
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Inmunofluorescencia indirecta:
Sirve comnmente para detectar anticuerpos en sueros humanos y de animales. Estas emplean antgenos conocidos, sueros de referencia y conjugados IgG anti-humanos.

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Inmunofluorescencia directa (presencia de antgeno en la muestra de una mujer con herpes genital) a virus Herpes simplex tipo 2 en una muestra genital. Se observa la presencia de clulas infectadas por el virus, teidas en verde, acompaadas de hemates teidos en rojo con el contracolorante (IF013).
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Inmunofluorescencia directa positiva (presencia de antgeno en la aspirado nasal de un nio con bronquiolitis) a virus respiratorio sincitial. Se observa la presencia de clulas infectadas con el citoplasma teido de verde fluorescente.
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http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasito/protozoa/amibaslibres.htm
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Fluorescena, Rodamina, Ficoeritrina

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Inmunofluorescencia indirecta positiva (presencia de anticuerpos en el suero de un paciente con paludismo) a Plasmodium falciparum. Se observa la presencia de trofozoitos de Plasmodium falciparum, en el interior de los hemates, teidos de color verde fluorescente.
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Inmunofluorescencia indirecta (FTA) positiva (presencia de anticuerpos en el suero) de un paciente con sfilis) sobre Treponema pallidum. Se observa la morfologa de la espiroqueta con sus espiras regulares, de la misma longitud de onda, caractersticas del Gnero, teida en verde con los anticuerpos fluorescentes.
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Tcnica de inmunofluorescencia indirecta. Clulas MS infectadas con el virus de la Peste porcina africana. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la clulas infectadas, destacndose en el citoplasma unas zonas con una intensidad mayor, que corresponden a zonas de mayor replicacin viral, y por tanto mayor fijacin de anticuerpos.
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http://www2.cbm.uam.es/confocal/manosidasa.htm
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Inmunofluorescencia de sndwich
En este se descubren anticuerpos especficos, por ejemplo en clulas plasmticas, con el tratamiento inicial de cortes congelados con antgeno especfico no marcado, despus con anticuerpo marcado de la misma especificidad que los de la clula plasmtica y de aqu el nombre de tcnica del emparedado.

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Inmunofluorescencia del Complemento

Supone un procedimiento en tres pasos. Primero se usan anticuerpos no marcados, como en la tincin indirecta. El segundo paso consiste en el complemento de un especie (suero fresco total) y el tercero, en un conjugado que es especifico para un componente del complemento de esa especie.
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INMUNOENSAYOS ENZIMATICOS
LA TCNICA ELISA
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA

O WESTERBLOT

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Ensayos con marca enzimtica

Las ms utilizadas son: peroxidasa (horseradish peroxidase, HRP), PM 44 kdal fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por tcnicas simples tienen varios sustratos.

Competitivo- Captura de anticuerpos

E
Ac marcado

E E
Sustrato

+
Ag muestra

Seal

Ag muestra + Ac marcado

Seal

[Ag]

Competitivo- Captura de antgeno

Seal

Antgeno marcado [Ag] Seal

Muestra

Lavado

No competitivo- sandwich de anticuerpos

Exceso de antgeno eliminado por lavado

bloqueante
Ag

+ E

E
Sustrato

Seal

Seal

Curva standard

[Ag]

Ensayos con marca enzimtica

Generacin de la seal La ltima parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimtica es la cuantificacin de la enzima. Mtodos de deteccin: a) Espectrofotomtrico o colorimtrico. Se mide la aparicin de un cromforo. b)Fluoromtrico- Se mide la aparicin de un producto fluorescente c)Quimioluminiscente- Se mide la aparicin de un producto luminiscente.

Ensayos con marca enzimtica: lmites de deteccin (zeptomoles, 10-21 moles)

AP:
quimioluminiscencia fluorescencia color 1 100 50000

HRP:
25000 -2000000

LA TCNICA ELISA
La tcnica de Elisa es un procedimiento de

ensayo inmunoenzimtico cuyo nombre resulta de la asociacin de las iniciales de su denominacin inglesa (enzyme linked inmuno sorbent assay). Como todo ensayo inmunoenzimtico, la prueba recurre al empleo de inmungenos, haptenos anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biolgicos.
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LA TCNICA ELISA
El mtodo ELISA est recomendado

fundamentalmente para el estudio de poblaciones. Es una tcnica altamente sensible y de gran especificidad, que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y econmica.

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LA TCNICA ELISA

Esta tcnica presenta adems una

buena reproducibilidad y facilidad en la interpretacin de los resultados.

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LA TCNICA ELISA
Fue concebida independientemente en

1971 en Suecia y Holanda, siendo aplicada posteriormente a la revelacin y a la cuantificacin de los ms diversos tipos de sustancias presentes en lquidos orgnicos (antgenos, anticuerpos, hormonas, frmacos, etc.).

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LA TCNICA ELISA
El rea de sus aplicaciones mdicas se

ha expandido en forma sostenida, siendo utilizada como el primer sustituto de la tcnica de Radioinmunoensayo en la medicin de hormonas, inmunoglobulinas, antgenos y anticuerpos en infecciones bacterianas, micsicas, parasitarias o virsicas.

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TIPOS DE TCNICAS ELISA:

Tcnicas cualitativas:
Son tcnicas Elisa que nos indican la

ausencia presencia de un antgeno o anticuerpo determinando. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antgenos. Ejemplo: HIV, Hepatitis, etc.
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Tcnicas cuantitativas:
Son tcnicas Elisa que nos indican la cantidad

de antgeno anticuerpo presente en la muestra. Los kits incluyen +/-6 estndares (sueros de diferentes concentraciones del antgeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para as poder determinar la concentracin de la muestra. Ejemplo: Hormonas, Marcadores tumorales, etc.
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LA TCNICA ELISA
PROCEDIMIENTO:
De un modo general se procede a la fijacin de

uno de los componentes de la reaccin inmunolgica (antgeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte slido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunolgico formado es enfrentado luego a las molculas capaces de reconocer a su componente ms superficial, marcadas con una enzima (peroxidasa de rbano picante); agregndose posteriormente un sustrato cromognico de la enzima marcadora.
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LA TCNICA ELISA
La existencia de una reaccin

inmunolgica se demuestra y se

cuantifica midiendo por medio de espectrofotometra cantidad de producto enzimtico resultante.

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PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TCNICA ELISA:

Dispensar muestras Dispensar conjugado Incubar a 37C o a temperatura ambiente

Lavar los pozos

Dispensar cromgeno/sustrato Incubar a 37C o a temperatura ambiente Dispensar solucin de parada Leer en lector de tiras placas de ELISA

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 En la primera lnea se

observa el suero control positivo y en la segunda el negativo. Los sueros problema por duplicado han sido colocados en el resto de la placa, se observan positivos (azul) y negativos (sin color).

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El procedimiento se efecta de dos formas principalmente:

Mtodo directo:

Tambin conocido como mtodo Sndwich (Anticuerpo-antgenoanticuerpo), se basa en la fijacin de un anticuerpo a la fase slida, el cual atrapa los antgenos homlogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo especfico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antgeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado.
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La modalidad ms frecuente del mtodo ELISA para la determinacin de antgenos es el modelo ELISA "Sndwich".
En esta forma, la placa suele ya venir con un

anticuerpo fijado (monoclonal policlonal) frente al antgeno problema, sobre el que se aadir el macerado del rgano sospechoso, que en caso de reaccionar con el anticuerpo de la placa, ser puesto en evidencia tras la adicin del segundo anticuerpo marcado con la enzima. Por ltimo, se aade el substrato para revelar la reaccin.

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Fases de la tcnica Elisa Sndwich. (1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antgeno suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba con la muestra problema. (3) se aade el conjugado. (4) por ltimo el sustrato. Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

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ELISA INDIRECTO

Es el mtodo ms utilizado para la determinacin de anticuerpos.

la placa de ELISA del antgeno (en los Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en el suero problema existen anticuerpos especficos. Se pueden utilizar como antgenos, protenas virales o bacterianas e incluso virus completos.

Bsicamente, consiste en la inmovilizacin a

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Fase de la tcnica Elisa indirecto. (1) El antgeno se pega a la placa (2) Se aade el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado. (4) y por ltimo, el sustrato.

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LA TCNICA ELISA
Mtodo

competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre un antgeno marcado enzimticamente y el mismo antgeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homlogo fijado a la fase slida. La cantidad de antgeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado.

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ELISA DE COMPETICIN
En este sistema tambin es

muy utilizado para la deteccin de anticuerpos especficos.

Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal), frente a un antgeno conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la placa.

Se denomina de competicin ya que el suero problema es incubado previamente con el antgeno, antes de incubarlo con el antisuero fijado en la placa, y por tanto compite con l.
Los pasos siguientes es la adicin e incubacin

del conjugado, lavado y finalizacin con el sustrato y lectura.

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Tcnica Elisa de competicin. (1) Se incuba el suero problema con el antgeno. (2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero anti antgeno (3) se aade el conjugado. (4) despus, el sustrato. En este caso la ausencia de color sera positivo.
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ELISA

Quimioluminiscencia: Substrato luxognico Sensibilidad (5. 10 18 M Ag) 68

INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT
La inmunoelectrotransferencia "westerblot" o

"Immunoblotting" es una tcnica inmunoenzimtica que se utiliza para la deteccin de anticuerpos especficos.
Se recomienda cuando no hay que estudiar un

gran nmero de sueros o para analizar sueros dudosos por otras tcnicas. Este mtodo utiliza como soporte antignico filtros de nitrocelulosa, donde las protenas del antgeno han sido previamente transferidas, manteniendo total o parcialmente sus propiedades antignicas.
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Western Blotting

Identificar protena: Ag Ac

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Material necesario para la realizacin de la inmunotransferencia: Tiras de nitrocelulosa antigenadas, Tampon PBS, sueros de referencia positivo y negativo, conjugado, solucin sustrato y soporte plstico para realizar todos los procesos.
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PIPETAS

LAVADOR DE PLACAS

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LECTOR DE PLACAS ELISA

LECTOR DE TIRAS ELISA

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FIJACION DE COMPLEMENTO
Detectar Ag o Ac (suero) utilizando una fuente de C' y un sistema indicador (GR carnero sensibilizados)

Controles: .- Suero + No hemlisis .- Suero Neg. Hemlisis .- Gr solos Lisis espontnea .- Suero en estudio Ag + C' + GR: Lisis .- Ag Suero en estudio + C' + GR Lisis

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Radioinmunoensayos ( RIA )
Tcnica muy sensible para detectar Ag o Ac . Unin competitiva entre Ag* y Ag por Ac de alta afinidad

Desventajas: prdida de sensibilidad durante el almacenamiento radioactividad, deterioro marcaje y precausiones exposicin humana a radioactividad 75

Microscopa Inmunoelectrnica: Componentes intracelulares Acs conjugados a marcadores electrodensos

Oro

Oro Ferritina Radio Es

DAB

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