ANLISE QUANTITATIVA

Tempo de reteno : parmetro usado para identificao rea do pico: proporcional massa da substncia injetada (quantificao)

Tcnicas de integrao de um pico cromatogrfico Integradores: so dispositivos baseados em microprocessadores que coletam o sinal cromatogrfico e digitalizam-no (transformam o sinal eltrico em nmeros). Usando formulas matemtica (algoritmos) calculam a rea de cada pico. Tem boa sensibilidade, tima exatido e so de alto custo. preciso e

Computadores:

o integrador pode ser substitudo por microcomputador, desde que tenha um dispositivo para converter o sinal eltrico em nmeros que possam ser guardados em memria (conversor analgico-digital).

 Uso de programas para efetuar a anlise dos dados (integrao de rea, curva de calibrao e outros dados); Permite o tratamento de dados j gravados em simultneo com a aquisio de novos dados; De custo inferior ao integrador; Grande versatilidade na apresentao de resultados

Mtodos usados para determinar as concentraes em cromatografia rea ou altura do pico podem ser relacionadas com a concentrao do analito por meio dos seguintes mtodos:

Normalizao anlise semi quantitativa

Uso de curva de calibrao : um processo que relaciona o sinal medido com a concentrao do analito.

Normalizao simples percentagem de rea

Clculo da percentagem de rea da substncia a partir da percentagem que o pico desta representa na rea total. rea total 100% rea do pico x %A=? rea % = (Ai / A) x 100 Onde: Ai = rea do pico individual A = soma de todas as reas dos picos, exceto o solvente.

Normalizao simples percentagem de rea Assume que todas as substncias presentes na amostra injetadas na coluna foram eludas; Assume que o detector apresenta a mesma resposta para todas as substncias desde que estejam na mesma concentrao;

Normalizao simples percentagem de rea

- Detector de UV e outros no respondem igualmente a todas as substncias: Abs= b. c = absortividade molar especfica para cada substncia

- Detector de ionizao de chama resposta menos diferenciada.

Normalizao - indica apenas a quantidade de um componente em relao aos outros componentes da amostra

Exemplo: Cromatograma (CG-EM) obtido de soluo contendo 50 ng/mL de cada um dos 16 HPA prioritrio pela EPA

50ng x 16 = 800 ng

Relatrio obtido

800 ng 50

100% x

x= 6,25%

Calibrao de mtodos Instrumentais

Os trs tipos mais comuns de calibrao que incluem a preparao e o uso de uma curva de calibrao so: Curva de calibrao (conhecido por padro externo) Curva de calibrao com padro interno Curva de calibrao com adio de padro

Curva de calibrao
Preparam-se solues-padro em 5 diferentes concentraes do analito (dentro da faixa linear) e analisam-se as solues para obter os cromatogramas.

Curva de calibrao
Um grfico para cada analito deve ser construdo relacionando as reas obtidas com as concentraes dos analitos nas solues ou com as massas injetadas.

A concentrao do analito na amostra ento determinada utilizando-se o grfico ou a equao da reta.

Curva de calibrao
A equao da reta, y= ax + b, obtida por regresso linear, onde y= resposta do analito, x= concentrao, a = coeficiente angular e b= coeficiente linear.

O volume e a tcnica de injeo para amostra e padres devem ser iguais;

Injetar padres e amostra at obter 3 valores reprodutveis de rea para cada pico;

Curva de Calibrao - Tebuconazole

50000

40000

rea

30000

20000

a = 16425,12 b = -122,01 R = 0,9987

10000

0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-1

2,5

3,0

Concentrao (mg L )

FIGURA : Curva analtica tebuconazole Y = ax + b

rea = aC + b
rea = 16425,12C - 122,01

Curva de Calibrao - Tebuconazole

50000

40000

rea

30000

20000

10000

0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-1

2,5

3,0

Concentrao (mg L )

Clculo de a e b pelo grfico ou por mtodo estatstico (mtodo dos mnimos quadrados). Pelo grfico: a = tg = A2-A1/C2-C1

Exerccios
1. O herbicida diclosulan foi determinado em soja por cromatografia Lquida de Alta Eficincia usando coluna C18 , fase mvel gua/acetonitrila (50:50%) e deteco por UV. A quantificao foi realizada por curva de calibrao padro externo. A extrao do herbicida em 50 g da amostra foi efetuada utilizando os procedimentos recomendados para alimentos. O volume final da soluo (extrato) em metanol aps fracionamento em coluna de Florisil foi de 10,0 mL. Esta soluo foi analisada e o pico de diclosulan apresentou uma rea de 25675. Para quantificao da diclosulan foram preparadas solues padres de 2 a 10 mg.L-1. As solues foram analisadas e os dados so apresentados na Tabela abaixo. Trace a curva de calibrao para a diclosulan e obtenha a equao da reta. Calcule a concentrao de diclosulan em mg/Kg de amostra utilizando a equao da reta?

Dados obtidos da anlise dos padres Concentrao rea do pico dos padres em mg.L-1 2 7970 4 6 8 10 15960 23950 31200 39903

A rea do pico do diclusulan na amostra foi de 25675

ANLISE QUANTITATIVA

Mtodo dos mnimos quadrados

Mtodo dos Mnimos Quadrados Pode ser usado para encontrar a melhor reta que passa pelos pontos.

Equao da reta
Y= ax + b a = inclinao da reta (coeficiente angular) b = intercepto (coeficiente linear)

Mtodo dos mnimos quadrados

Resduo so os desvios verticais de cada ponto a partir da reta.

A linha gerada pelo mtodo dos mnimos quadrados e aquela que minimiza a soma dos quadrados dos resduos para os pontos. So definidos trs desvios: Sxx, Sxy, Syy Onde a= Sxy/Sxx ; b = y(mdio) ax (mdio)

Sxx = xi2 (xi)2/N Sxy = xi yi xi yi/N

Mtodo dos mnimos quadrados

O desvio padro para os resduos

Sr = (Sxy aSxx)/N-2

Desvio padro da inclinao:

Sa = Sr/ Sxx O desvio padro do intercepto Sb = Sr 1/N-(xi)2

 possvel calcular a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlao (r), parmetro usado para avaliar linearidade.

A AVISA recomenda coeficiente de correlao (r) igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de 0,90.

Resolvendo o exerccio pelo mtodo dos mnimos quadrados

Concentrao mg.L-1 rea

Xi
2

Yi
7970

Xi 2 4

Xi. Yi 15940

4 6 8 10 30

15960 23950 31200 39903 118983

16 36 64 100 220

63840 143700 249600 399030 872110

X(mdio) = 30/5= 6

Y(mdio) = 118983/5 = 23796,6

Sxx = X2 - ( X )2 / N Sxx = 220 (30)2 / 5 = 40

Sxy = xi yi ( xi yi)/N
Sxy = 872110 (30 x 118983)/5 = 158212
a= Sxy/Sxx a = 158212/40 = 3955,3 b = y(mdio) aX (mdio) = 23796,6 + 3955,3 x 6 b = 64,8

rea = 3955,3 C + 64,8

rea do analito na amostra = 25675

C = (25675 64,8) / 3955,3 = 6,4749 mg/L

6,4749 mg 1000 mL X 10 mL
X = 6,4749 x 10-2 mg 6,4749 x 10-2 mg 50 g X 1000 X = 1,30 mg /kg

Mtodo da Padronizao interna

Consiste em adicionar um padro interno (na amostra e nos padres utilizados para obteno da curva de calibrao), que contenha as seguintes caractersticas: no faz parte da amostra;

similar substncia a ser quantificada;

est disponvel em elevado grau de pureza; deve ser adicionado em concentraes similares ao composto analisado.

Mtodo da padronizao interna

Prepara-se cinco ou mais solues do padro (substncia de interesse) em concentraes dentro da faixa linear, s quais adiciona-se uma quantidade conhecida e fixa do padro interno. Constri-se um grfico com a razo de rea (rea do padro/rea do PI) versos a concentrao do padro de interesse. A amostra analisada aps adio da mesma quantidade conhecida do padro interno. Encontra-se a concentrao do analito utilizando-se a equao da reta obtida na curva de calibrao;

A/API=aC + b

Curva de calibrao padro interno

0,35 0,30

rea do analito/rea do PI

0,25 0,20

Equao da reta
0,15 0,10 0,05 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-1

Aanalito/ A padro interno = a C + b

1,4

1,6

Concentraa (ng L )

FIGURA : Curva de calibrao tpica obtida para o aldrin.

Exerccio: No laboratrio LP3 da UFMS efetuou-se a anlise de Fluoranteno no material particulado da cidade de Campo Grande. A massa de material particulado sobre o filtro aps a coleta de 65,30 m3 de ar foi de 0,01915 g o qual foi submetido extrao com diclorometano/etanol, o volume foi reduzido em rotaevaporador, adicionou-se o pireno deuterado (Pir-d10) como padro interno ajustando-se o volume para 1mL de forma que a concentrao Pird10 na soluo ficou em 60 ng/mL. A extrato foi analisado por CG/EM obtendo-se os valores de 3367 e 1979 para as reas dos picos do fluoranteno e pireno deuterado respectivamente. Para a curva de calibrao injetou-se solues padres contendo entre 60,0 e 110 ng/mL de fluoranteno e 60 ng/mL do padro interno, conforme dados da tabela abaixo. Calcule fenantreno na amostra expressando o resultado em ng.m3 de ar.

Tabela: concentrao dos padres e reas dos picos

Concentrao fluoranteno(ng/mL) 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 110,0 rea pico fluoranteno 2768 3138 3350 4090 4073 4125 rea do pico Pir-d10 1880 1793 1675 1818 1629 1500

Tabela: Equao da reta pelo mtodo dos mnimos quadrados

X Concentrao ng/mL 60 70 80 90 100 110 510

Y A anal/API 1,47 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75 12,72

X2

XY

3600 4900 6400 8100 10000 12100 45100

88,2 122,5 160 202,5 250 302,5 1125,7

Equao da reta pelo mtodo dos mnimos quadrados: Aanalito/ A PI = a C + b a= Sxy/Sxx ; b = y(mdio) ax (mdio)

Sxx = xi2 (xi)2/N

Sxx = 45100 (510)2/6 = 1750

Sxy = xi yi ( xi yi )/N
Sxy = 1125,7 (510 x 12,72)/6 = 44,5

Coeficiente angular (a) = 44,5/1750 = 0,02543 Coeficiente linear (b) = (12,72/6) 0,02543 (510/6) = - 0,04155

REA(FLUORANTENO)/REA(Pir-d 10 )

3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 60 70 80 90 100 110

Concentrao fluoranteno em ng/mL

AAnal/API = 0,02543 C 0,04155

R = 0,9997

A/Api = 0,02543 C 0,04155 A/Api ( para amostra) = 3367/1979 = 1,70 1,70 = 0,02543 C 0,04155 C = 68,48 ng/ mL

68,48 ng 65, 30 m3 X 1
X = 1,05 ng/ m3

Mtodo da adio de padro

Consiste em determinar a massa ou concentrao do analito, a partir de uma curva de calibrao obtida por meio da adio de sucessivas quantidades conhecidas do padro. Alquotas iguais da soluo da amostra so colocadas em bales volumtricos de mesmo volume, aos quais so adicionadas quantidades crescentes e conhecidas do analito (soluo padro), exceto a um dos bales.

Mtodo da adio de padro

Por fim, o contedo de cada balo diludo at a marca; Analisa-se cada soluo e constri um grfico

relacionando a concentrao adicionada dos padres , eixo x, com a rea do pico no eixo y

A interseo de x da linha extrapolada a concentrao da amostra desconhecida aps ela ter sido diluda ao volume final;

Mtodo da adio de padro

Sol. V(mL)
amostra

V(mL) Vfinal padro 10ng/mL 0 5

ng/mL
padro adicionado

rea

800

2
3 4 5

1
1 1 1

0,5
1,0 1,5 2,0

5
5 5 5

1
2 3 4

1500
2200 2900 3600

Mtodo da adio de padro

4000 3500

rea

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4

Concentrao do analito na amostra 1,14 ng/mL

Concentrao do padro adicionado (ng/mL)

O valor de concentrao encontrado no eixo x (valor absoluto)

Mtodo adio de padro

Determinao da concentrao pela equao da reta: a interseo com o eixo dos x obtida fazendo-se y = 0 (pois b a rea do analito na amostra)

y = ax + b ;

0 = aC + b C = - b/a (em mdulo)

Mtodo usado qdo: H interferncia de matriz Para baixas concentraes do analito