Mtodos espectroscpicos para la caracterizacin de macromolculas biolgicas

Interaccin de radiacin electromagntica con la macromolcula en estudio Se usa amplio rango del espectro electromagntico (desde radiofrecuencia hasta RX)

Cada una aporta distinta informacin estructural

Regiones tiles en espectroscopa de biopolmeros

Tcnicas espectroscpicas
ABSORCIN (UV-VIS, IR)

EMISIN (fluorescencia) DISPERSIN ( Raman) DIFRACCIN ( Rayos X) Luz polarizada (dicroismo circular) Resonancia (RMN, EPR)

Absorcin en el uv-vis

100 - 400 nm 400 700 nm

UV VISIBLE

transicin electrnica

Absorcin en el infrarrojo 700 nm 2.5

transicin vibracional

Aplicaciones de la espectroscopa de absorcin uv-vis

Cualitativa, Identificacin de cromforos por el espectro

A vs

Cuantitativa, medir la concentracin del cromforo

A = b C

Las protenas absorben en el uv-vis?

ABSORBANCIA

max
(nm)
Triptofano Tirosina Fenilalanina 278 287 275 258

(M-1 cm-1)
5600 4500 1400 200

Espectro de absorcin uv de una protena, seroalbmina bovina (BSA)

Espectro de BSA 0.45 M en buffer fosfato pH 7.0

Espectro de absorcin uv de seroalbmina bovina BSA

Absorcin uv-vis de Protenas

Absorcin en el uv de residuos aromticos

Estimacin del coeficiente de absortividad molar de una protena

280

(M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)

n(Trp) = nmero residuos de triptofano en la secuencia n(Tyr) = nmero residuos de tirosina en la secuencia n(SS) = nmero de enlaces disulfuro en la protena

Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el mximo de absorcin pasa de 280 nm a 295 nm

Titulacin espectrofotomtrica de Ribonucleasa pancratica bovina

RNasa tiene 6 residuos de tirosina

Espectro uv de la RNasa en funcin del pH

Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el mximo de absorcin pasa de 280 nm a 295 nm

RNasa tiene 6 residuos de tirosina. El resultado muestra que unas 3 tirosinas se titulan reversiblemente con un pKa = 10.2 Las otras 3 tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH ms elevado que provoca la desnaturalzicacin de la protena

Absorcin a 295 nm en funcin del pH

Los cidos nucleicos, absorben en el uv-vis?

Absorcin en el UV lejano de los cidos nucleicos

Cromforo, responsable de la absorcin, las bases nitrogenadas

Diferencias en estructura secundaria, afecta el espectro de absorcin uv?

Cuando tenemos ms de un grupo que absorbe: La orientacin relativa de los cromforos y las interacciones entre cromforos, afecta la energa e intensidad de la absorcin

Polipptido con estructura ovillo estadstico, es el espectro de una amida (). Polipptido con estructura hlice () que tiene grupos amida orientados y que interaccionan unos con otros, el espectro cambia: banda a 195 nm menos intensa y hombro a 205 nm

Seguir la desnaturalizacin de la protena por cambios en la absorcin uv

Inserto: Espectro de absorcin uv de RNasa nativa y desnaturalizada (8 M urea) Espectro diferencial

Seguir la desnaturalizacin de la protena por cambios en la absorcin uv

Cambios de absorcin de RNase a 286 nm y 292 nm al aumentar la temperatura

Cuando tenemos ms de un grupo que absorbe: La orientacin relativa de los cromforos y las interacciones entre cromforos, afecta la energa e intensidad de la absorcin

Espectro de absorcin uv de ADN de doble cadena (lnea slida), ADN cadena simple (lnea de trazos) y tras hidrlisis hasta obtener nucletidos libres (lnea punteada). Todos los espectros a igual concentracin de bases. HIPOCROMISMO

Aplicacin del efecto hipocrmico para seguir desnaturalizacin de ADN

Al perder estructura secundaria, los residuos nucleotdicos pierden rigidez, se desordenan, entonces la intensidad de absorcin a 260 nm aumenta (se pierde efecto hipocrmico). Se determina Tm (temperatura a la cual la mitad de ADN se desnaturaliz)

Cambios espectrales por perturbacin del solvente

A) Triptofano (N-acetil ster)(a),Tirosina (b), Fenilalanina (c) en agua (lnea slida) o en 20%DMSO (lnea punteada) B) Espectros diferenciales

Aplicaciones espectroscopa de absorcin uv-vis

Identificacin Cuantificacin Cintica Determinacin de parmetros estructurales: desnaturalizacin ubicacin de residuos ionizacin de residuos asociacin con ligandos