Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire Ministre de lEnseignement Suprieur Et de la Recherche Scientifique Universit de Jijel

Facult des sciences

Dpartement de Biologie molculaire et cellulaire Option: microbiologie applique Degr: Master I

Exemple de production dhormone

Prpar par *Bellal .Ch *Boudjelida .H *Kaaboub .K Propos par:Mme Barhi

Anne universitaire: 2011/2012

Introduction
En raison de limpossibilit pour la chimie de synthse de mettre au point certaines macromolcules usage thrapeutique, en raison galement des dangers prsents par les protines dextraction dorigine humaine ou animale, il a fallu recourir dautres stratgies pour obtenir de grandes quantits de ces molcules selon lventail trs large des besoins et qui soient, de plus, de qualit satisfaisante Cest ainsi que la production dOGM vise thrapeutique a pris naissance, selon des modalits qui ne sont pas toutes au mme stade de dveloppement. Prs de 80 principes actifs sont actuellement produits par culture de cellules procaryotes (E. coli) ou eucaryotes (hamster chinois) dont la majorit naurait pas pu tre obtenus par synthse chimique et dont certains permettent le traitement de maladies restes incurables jusqu prsent.

Il devient possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces mthodologies, de reprogrammer le code gntique d'un micro-organisme en lui insrant un gne prcis, qui lui permettra de produire une protine recombinante prcieuse ( usage mdical -interfron, insuline, hormone de croissance...ou industriel -enzymes...-) .

Quelles sont les tapes dun procd gnrale de production dhormone ?

Chapitre I:
Gnralit sur les protines recombinantes

I. Dfinition
Protine produite par expression dun ADN recombin insr dans le gnome dune bactrie, dun plasmide ou dune ligne cellulaire (pour que ce gne soit exprim, il doit tre prcd dun promoteur efficace).
Une protine recombine produite par une bactrie a partir dun gne deucaryote na pas toujours les proprits de la protine originale.

I.2. Procd gnral de production

dans un procd gnral de production dit biotechnologique

lexpression dune protine dintrt thrapeutique est assure par un systme cellulaire gntiquement modifie . ).

I.2.1. Etape pralable toute production la mise au point du systme dexpression, notion du gnie gntique

Le gne codant pour la squence protique dintrt est le premier lment de ce systme, puisque seule une squence gnique correcte permettra dobtenir lexpression dune protine dont la squence primaire sera conforme.

Le gne le plus souvent de squence humaine, doit tre insr dans la cellule qui aura t choisie comme systme hte pour la production. ).

 La biotechnologie a donc pour but dinsrer un transgne

codant pour la protine produire dans un organisme producteur systme dexpression .

Ce lui ci est conserv sous forme de banques

cellulaires banques maitresses et de travail pour garantir la reproductibilit du systme de production.

Les cellules issues des banques cellulaires sont mises en

culture afin de produire la protine dintrt ).

 Cellules htes et systme dexpression

Les htes les plus utiliss l'heure actuelle sont

incontestablement:
la bactrie Escherichia coli : pour la production de:

hormone de croissance humaine, insuline, chymosine, interfron- , interleukine-2..) la levure Saccharomyces cerevisiae: pour la production de: antigne de surface du virus de l'hpatite B, insuline, hirudine... autres bactries : Bacillus subtilis, Streptomyces ).

 Notion de banque cellulaire

Afin dassurer lhomognit et la reproductibilit de la production de la protine dintrt, un systme de banque cellulaire ou encore appel systme de lot de semence deux niveaux est tabl partir du clone producteur initialement slectionn . ).
la banque cellulaire maitresse

issue directement de lamplification de clone slectionn (MCB). amplifiant un ou

banque cellulaire de travail (WCB)

deux tubes /ampoules de la MCB. ).

I.2.2. Conditions de fermentation ou de culture cellulaire

Une fois que le systme dexpression a t construit, la cellule hte

gntiquement modifie et le clone producteur tablit en banque, il faut procder la mise en culture de la cellule hte afin que celleci produise, dans des conditions de culture spcifiques et optimises, la protine dintrt. ).
La culture de ces organismes se fait dans des fermenteurs ou des

systmes de culture cellulaire.

Les conditions de culture, la faon dont la cellule hte est

entretenue, nourrie, oxgne,sont autant dlments dterminants dans les rendements de production et dans la qualit intrinsque de la protine produite.

 On observe ainsi quun changement de pH, modification

de la pression partielle doxygne ou encore une modification dans la vitesse des apports en hydrate de carbone entraine des modifications.

I.2.3 la purification
Lobjectif de cette purification est dextraire le produit et

dliminer lensemble des substances dites contaminantes, notamment celle issus des cellules productrices, des matires premires utilise (ractifs, milieu de culture) ainsi que les produits de dgradation.
Un second objectif de la purification est dliminer les agents

pathognes (virus) A lissue de ce procd , on obtient une protine dite purifie dont le degr de puret doit tre qualifi et vrifi par apport des normes fixes.

I.2.4. La mise en forme pharmaceutique

Cette tape consiste inclure la protine dintrt

thrapeutique sous une forme permettra son administration au patient.

il faut donc prparer un mdicament qui sera administr

par voie injectable.

pour cela il faut procder la mise au point dune formule

avec des expdients dont le rle sera dassurer la meilleur solubilisation possible de la protine et le maintien de son intgrit physique et chimique.

Chapitre II
Exemple de production d hormones

II.1. Dfinition
Une molcule chimique produite par une cellule endocrine et libre dans le sang. Elle agit sur des
cellules cibles qui possdent les rcepteurs fixant spcifiquement lhormone.

II.2. Exemples de production industrielle dhormone

II.2.1. Lhormone de croissance

Lhormone de croissance est une protine de 191 acides amins qui est produite par lhypophyse et qui rgule la croissance et le dveloppement.
Les enfants ns avec une dficience en hormone de croissance des nanismes hypophysaires- natteignent jamais une taille normale. *Des injections rgulires dhormone de croissance stimulent la croissance de ces enfants afin quils aient un jour des tailles presque normales.

Les hormones de croissance animales s'tant montres inefficaces, il a fallu recourir l'hormone de croissance humaine hGH , extraite de l'hypophyse d'tres humains aprs leur dcs Jusqu'en 1985, celle-ci tait fabrique par extraction, aprs la mort, de cerveaux humains . Cela a prsent deux inconvnients :

la quantit d'hormones ainsi prleve

tait insuffisante pour traiter l'ensemble des cas (un cas sur deux) ; ces prlvements humains pouvaient contenir des agents infectieux (Creutzfeldt-Jacob, VIH ...)

Figure 1 :Place de l'hypophyse humaine par rapport l'encphale. http://www.gnis-pedagogie.org

En 1977, la production massive d'hormones a t obtenue

partir de bactries gntiquement modifies, c'est--dire contenant le gne de croissance humaine.

 Procd de fabrication de lhormone de

croissance

Etape 1: identification et isolement du fragment d'ADN

humain contenant le gne de l'hormone de croissance.

Figure2:Extraction du gne[6]

 Etape2 :
Insertion du fragment d'ADN humain dans un plasmide .

Introduction du plasmide modifi dans la bactrie Escherichia coli.

Figure3:Cration de vecteur recombin

Figure4:transfert de plasmide recombin

Etape 3 :

Expression du gne humain et synthse de l'hormone de croissance par les bactries places en culture sur un milieu appropri dans un fermenteur.

Culture
Les cellules bactriennes sont d'abord multiplies dans de petits bioracteurs (fermenteurs) contenant une solution nutritive. La dure de la multiplication dpend du cycle de croissance des cellules. Les cellules d E. coli se divisent toutes les 20 minutes. En l'espace de 24 heures et dans des conditions idales, une seule et unique cellule peut donc produire 4,7 x 1021 descendants.

La fermentation
C'est durant cette phase qu'a lieu la vritable production de lhormone de croissance aprs contrle de la temprature, la pression, l'oxygnation et d'autres paramtres encore. Pour viter toutes mutations, un lot de semence primaire de bactries productrices d'hormones sert de rfrence pour toutes comparaisons avec les bactries cultives dans les fermenteurs.

 L'hormone est rejete au del de la membrane

cytoplasmique et elle apparat tout fait identique l'hormone de croissance humaine.

Figure5: Expression de gne[7]

Une seule cuve contenant 500 litres produit la mme quantit d'hormones de croissance que 35 000 hypophyses humaines.

Etape 4 :
on peut rcuprer l'hormone sans dtruire la bactrie, ce qui vite tout risque de contamination par des molcules ou des virus contenus dans la bactrie. l'hormone n'est pas rejete dans le milieu extrieur, il s'accumule dans un espace situ entre la membrane cytoplasmique et la paroi. Il suffit alors de dissoudre cette paroi pour rcuprer l'hormone de croissance

Figure6:Extraction de lhormone de croissance

La purification
La purification doit se faire dans les meilleures

conditions afin de prserver l'intgrit et les proprits de lhormone. Fondamentalement, la purification est base sur la chromatographie d'affinit.
Toutefois, si un grand degr de puret est souhait, nous

associons dautres techniques chromatographique : change ionique, filtration sur gel, chromatographie d'interaction hydrophobe.

 La mise en forme pharmaceutique Seules quelques grandes compagnies pharmaceutiques mondiales disposent les moyens de produire dhormone de croissance. Elle est alors disponible sous forme injectable, mais l'obtention d'un traitement base d'hormones de croissance est coteux (environ 1500 euros par mois) et ne peut tre dlivr que sur prescription mdicale.

II.2.2.Linsuline
II.2.2.1. Dfinition
Hormone peptidique scrte par les cellules des ilots de

Langerhans. Elle est constitue de deux peptides (chanes) de 51 acides amins (chane A constitu de 21 acides amins et chane B constitue de 30 acides amins) unis par deux ponts disulfures.
Cest Le premier mdicament produit par gni gntique

pour lequel un brevet a t dpos.

II.2.2.2.Procd de fabrication de linsuline

Avant la production de molcule recombinante, linsuline tait obtenue

partir de pancras de porc ou de vache mais cette dernier avait

plusieurs inconvnients dont la production danticorps contre linsuline

injecte.
Linsuline humaine recombinante tant identique au produit naturelle

ne devrait plus constituer un problme.

La fabrication de linsuline recombinante passe par plusieurs tapes :

1. Lisolement ou la synthse du gne codant linsuline humaine :

Celui-ci est gnralement rduit par digestion enzymatique laide

denzymes de restriction sous la forme de petits fragments facilement manipulables.

Actuellement le gne codant linsuline est synthtis comme

suivant :

Un fragment dADN codant pour chaque chaine a t construit par

hybridation de deux oligonuclotides complmentaires synthtiques.

2.Linsertion du fragment dADN humain dans le plasmide dEscherichia Coli (le vecteur):
Chaque fragment a t ligatur dans un vecteur dexpression

bactrien, de faon ce que la chaine dinsuline soit traduite soit fusionne lextrmit carboxy de la -galactosidase.

Figure7 : linsertion de lADN dans E .coli

3. La Transformation dans la bactrie (Escherichia Coli)

E. coli est transforme par les vecteurs dexpression, et les

protines de fusion insuline-- galactosidase vont saccumules

dans les cellules bactriennes.

Figure 8: transformation de E. coli

4. Slection et culture des souches productrices

La slection aussi se fait par diffrentes mthodes, elle consiste isoler les microorganismes (cellules) transgniques qui possdent le plasmide recombinant.
Aprs la slection on passe une culture de ces bactries au niveau du laboratoire pour voir si ces bactries vraiment produisent de linsuline. Si on a une production de linsuline on passe ltape des essais cliniques de cette substance.

5. Les essais cliniques

Les essais cliniques permettent de vrifier linnocuit,

limmunognicit et/ou lefficacit du produit au sein de la population la quelle il est destin.

Gnralement on ralise des tests sur les animaux du laboratoire. Si les rsultats sont favorables, on ralise dautres tests sur les animaux suprieurs et les humains. Si les rsultats sont favorables on passe la fermentation industrielle.

6. la fabrication de linsuline grande chelle

Lorsquon est sur de la construction gntique du produit et quon parvient obtenir une quantit raisonnable, il faut passer des fermenteurs de 100 litre ou plus aux fermenteurs industriels de grand volumes pour raliser la fermentation.
Il est rare que lon passe directement du flacon de laboratoire au fermenteur industriel, Dans ce cas, on sest servi dun fermenteur de 20 litres pour dterminer les conditions de fermentation c'est--dire: la composition du milieu de culture, les lments chimiques utiliss, limportance de linoculum, les facteurs de croissance, le pH, la concentration doxygne dissout ainsi que le moment o la rcolte donnerait le meilleur rendement.

 Ce dernier paramtre repose la fois sur la biomasse totale

produite et le degr dexpression gntique.

Il est ncessaire de cerner les conditions qui minimiseront la perte ou la mutation des plasmides et de les dfinir pleinement avant le passage la fermentation industrielle. Pour lobtention dune grande quantit de produit (insuline), il est ncessaire de recourir un procd de fermentation continu.

7. Transformation fine
Aprs multiplication, les cellules sont prleves du fermenteur et
sont lyses pour extraire les chanes A et B qui sont toute les deux relies la -galactosidase.
Les deux chane du proinsuline sont ensuite traites avec du

bromure de cyanogne, un ractif qui coupe la chaine protique au niveau de lacide amin mthionine, ce qui permet la sparation de la chaine dinsuline de la -galactosidase restant.
Les deux chaines sont ensuite mlanges et relies par des ponts

disulfures en mettant en point des ractions de rductionroxydation, un agent oxydant est ajout.

 Le lot est ensuite plac dans une centrifugeuse pour sparer les

composants cellulaires selon leur taille.

Le produit obtenu est ensuite purifi de sorte que seules les

chaines dinsuline restent,

Les mthodes utilises incluent une chromatographie dchange

dions, chromatographie en phase inverse liquide haute performance et une filtration sur gel.
Les lots dinsuline sont tests pour assurer quaucune protine de

la bactrie ne soit mlange avec linsuline.

8. Les contrles de qualit

Aprs la synthse de l'insuline humaine, la structure et la puret

des lots d'insuline sont tests au moyen de plusieurs procds diffrents. Chromatographie liquide haute performance est utilise pour dterminer s'il ya des impurets dans l'insuline.
Les fabricants ont galement test l'emballage du flacon afin de

s'assurer qu'il est correctement scell.

La Fabrication de l'insuline humaine doit se conformer linstitut

national de la sant, et des procdures pour des oprations d'envergure.

9. Remplissage et emballage : Cette tape est galement complexe, le produit doit tre transfr dans des rservoirs de stockage aux ampoules Sans tre dnatur et en demeurant strile.

Figure9: ampoules dinsuline

10. Commercialisation : Il existe certaines difficults particulires pour la mise en march des produits de la biotechnologie. Il est essentiel que les directeurs de programme , les chercheurs et le personnel attach la production gardent en tte une dfinition claire du produit final et de lusager ainsi que de savoir faire des connaissances de ce dernier comme des conditions dans lesquelles sera utilis le produit.

Conclusion
La production de protines usage mdical a t ralise en milieu confin faisant appel des micro-organismes, tels que Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, une grande varit de substances actuellement autorises qui ont t obtenues par culture de microorganismes : hormone de croissance, insuline, chymosine, interfron (alpha, bta), interleukine 2. Certaines de ces protines recombinantes ont permis de faire des progrs importants dans le traitement de maladies .Cependant, les techniques de production en bioracteur sont la fois coteuses et limites en volume.