1

Capacitador: Lic. Sergio Gustavo Chesniuk

Email: sergio@chesniuk.com
Telfono: +54 351 4710602
Skype: sergio.chesniuk
Curso-Taller: Estimacin de la Incertidumbre de
la Medicin en Mtodos Microbiolgicos
2
Se pretende que al finalizar el curso el
participante sea capaz de plantear y
desarrollar el calculo de la incertidumbre de
los resultados analticos microbiolgicos
siguiendo los lineamientos de la norma
ISO/IEC 17025:2005 o su equivalente
nacional
3
4
Las herramientas cualimtricas.
Por qu mediciones repetidas o replicadas?
5
Las herramientas cualimtricas. Media y Varianza.
Parmetros estadsticos usados en el
tratamiento de datos analticos
Estimador del
valor central
Media
aritmtica
Estimador de la
dispersin
Varianza
6
Las herramientas cualimtricas. Media y Varianza.
Qu mide
y que nos
indica la
varianza?
7
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
n
Media
aritmtica
Desviacin
estndar
Poblacin (n > 30)
o
Muestra (n < 30) s
x
8
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Resultados de 50 determinaciones de concentracin de NO
3
-
en
g/mL
0.51 0.51 0.51 0.50 0.51 0.49 0.52 0.53 0.50 0.47
0.51 0.52 0.53 0.48 0.49 0.50 0.52 0.49 0.49 0.50
0.49 0.48 0.46 0.49 0.49 0.48 0.49 0.49 0.51 0.47
0.51 0.51 0.51 0.48 0.50 0.47 0.50 0.51 0.49 0.48
0.51 0.50 0.50 0.53 0.52 0.52 0.50 0.50 0.51 0.51
9
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Tabla de frecuencias para medidas de
concentracin de ion nitrato
[NO
3
-
/

g/mL] Frecuencia
0.46 1
0.47 3
0.48 5
0.49 10
0.50 10
0.51 13
0.52 5
0.53 3
10
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Herramientas para graficar mediciones
repetitivas
Histogramas
Curva de
distribucin
normal
# clases = n
rea total = 1 (100%)
+
11
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
La ecuacin de la
curva normal
viene dada por la
expresin
Los valores de x estn distribuidos
normalmente con promedio y una varianza
o
2
] 2 / ) ( exp[
2
1
) (
2 2
o
t o
= x x f
) , (
2
o N x ~
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Funcin de densidad de probabilidad normal para distintos valores de
2
y
o
2
.
14
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
La desviacin estndar, o, mide la distancia desde la media, , hasta el
punto de inflexin de la curva.

Un 95% de los valores estn comprendidos en el interyalo 1,9600o.

Un 99% de los valores estn comprendidos en el intervalo 2,576o.

Un 99,7% de Ios valores estn comprendidos en el intervalo 3,290o.
15
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
16
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Estandarizacin de
variables
Planillas de
clculo, tablas
o

=
x
z
|
|
.
|

\
|
=
2
exp
2
1
) (
2
z
z f
t
17
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Intervalos de confianza
Para una distribucin normal el 95 % de los datos cae dentro de los lmites z=-1,96
a z=1,96 ( 1,96o)
Los promedios de las
muestras tambien se
distribuyen normalmente
Existe un 95 % de probabilidad de
que (estimador de ) este
comprendido en ese rango
X
n
o
96 . 1
18
Las herramientas cualimtricas. Distribucin Normal.
Para muestras grandes (n>30), los lmites de confianza de la media
vienen dados por :
n zo
Donde z depende del nivel de confianza requerido

Para el 95%, z = 1.96
Para el 99%, z = 2.58
Para el 99.7%, z = 2.97
19
Las herramientas cualimtricas. Distribucin t de Student.
Para muestras pequeas (n<20), los lmites de confianza de la
media vienen dados por :
n ts x
Donde t depende del nivel de confianza requerido y los grados de
libertad.
20
21
22
23
24
Distribucin de Poisson
Es un caso especial de la distribucin binomial
Asociada con eventos raros
Tiene a la normalidad cuando es grande
25
Funciones transformacin Distribucin normal
26
28
5.4.6.1 Un laboratorio de calibracin, o un laboratorio de ensayo que realiza sus
propias calibraciones, debe tener y debe aplicar un procedimiento para estimar la
incertidumbre de la medicin para todas las calibraciones y todos los tipos de
calibraciones
5.4.6.2 Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para
estimar la incertidumbre de la medicin. En algunos casos la naturaleza del mtodo
de ensayo puede excluir un clculo riguroso, metrolgicamente y estadsticamente
vlido, de la incertidumbre de medicin. En estos casos el laboratorio debe, por lo
menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una
estimacin razonable, y debe asegurarse de que la forma de informar el resultado no
d una impresin equivocada de la incertidumbre.
Una estimacin razonable se debe basar en un conocimiento del desempeo del
mtodo y en el alcance de la medicin y debe hacer uso, por ejemplo, de la
experiencia adquirida y de los datos de validacin anteriores.
5.4.6.3 Cuando se estima la incertidumbre de la medicin, se deben tener en cuenta
todos los componentes de la incertidumbre que sean de importancia en la situacin
dada, utilizando mtodos apropiados de anlisis.
29
Aspectos generales. Factores que influyen en los ensayos.
Resultados
Analticos
Factores
Humanos
Confort y
Condiciones
ambientales
Mtodos de
ensayos
Y calibracin
Validacin de Mtodos
Equipamiento
Trazabilidad en las
mediciones
Muestreo
Manipulacin de los
tems de ensayo y
calibracin
30
Parmetro no negativo que caracteriza
la dispersin de los valores atribuidos a
un mensurando, a partir de la
informacin que se utiliza
(VIM 2008)
31



La norma ISO 17025 recomienda que cada resultado vaya
acompaado de dos parmetros de calidad bsicos
Trazabilidad
Incertidumbre
32



Valor 1 Valor 2
Trazabilidad
Estimacin del valor
verdadero
Incertidumbre
33
La incertidumbre es el primer ndice de calidad
de una medida, que es tanto mayor cuanto
menor es aquella
Precisin
Incertidumbre
especfica
Exactitud
Bias o sesgo
Veracidad
relativa
Cuando se refiere a
un resultado
Cuando se refiere a
un mtodo (n < 30
det)
Cuando se refiere a
un mtodo (n > 30
det) | - |
n X

X'
'
X x '

X xi '

Errores aleatorios
o indeterminados
Fluctuantes
Distribucin
Normal de Gauss
Errores sistemticos
o determinados
Alteraciones
operacionales
bien definidas
Desviaciones
de signo
determinado
Pueden
depender o no
de la [analito]
Errores crasos o espurios
Caractersticas similares a los errores
sistemticos con excepcin de la magnitud
34
Proximidad entre el resultado de una medicin y el
valor verdadero del mesurando. Es la combinacin
de la precisin y la veracidad (ISO 3534-2: 2006)
En caso de aplicarse a un conjunto de resultados, implica
una combinacin de componentes aleatorios y una
componente de error sistemtico comn.

35
Exactitud: Veracidad (bias)
Proximidad entre el promedio de una serie grande de resultados y el
valor verdadero del mesurando (ISO 3534-2: 2006)
Exactitud: Precisin
Proximidad entre los resultados de mediciones independientes,
obtenidos bajo condiciones estipuladas (ISO 3534-2: 2006)
36
Precisin
(errores aleatorios)
+
Veracidad
(errores sistemticos)
EXACTITUD
37
38
Exactitud
vs
Precisin
Veracidad
vs
Precisin
39
1)
2)
Correccin
X
X
Aseguramos
la veracidad
Sesgo significativo
Sesgo no significativo
X
Mi valor individual
Valor verdadero
Mi media
39
40
Operacin que bajo condiciones especificadas establece, en
una primera etapa, una relacin
entre los valores y sus incertidumbres de medida
asociadas obtenidas a partir de los patrones de medida,
y las correspondientes indicaciones con sus
incertidumbres asociadas y, en una segunda etapa, utiliza
esta informacin para establecer una relacin que permita
obtener un resultado de medida a partir de una
indicacin
VIM 2008
40
41
Copias oficiales
Pesas certificadas
Balanza
Futuras medidas
Unidad base S.I.
Kilogramo de
Svres
Mximo nivel
Nivel mnimo
0
u
1
(u
2
1
+ u
2
2
)
1/2
(u
2
1
+ u
2
2
+ u
2
3
)
1/2
(u
2
1
+ u
2
2
+ u
2
3
+ u
2
4
)
1/2
Incertidumbre Nivel de trazabilidad
41
42
Cadena ininterrumpida de
comparaciones
Incertidumbres
determinadas
Documentacin
Competencia
Referencia al S.I.
Recalibraciones
42
Mtodos primarios o definitivos
Materiales de referencia certificados
Mtodos de referencia
Ejercicios de intercomparacin
Materiales de referencia de trabajo
Laboratorios de referencia
Instrumentos de referencia
Elaboracin de materiales de referencia
Muestras adicionadas
Tcnicas alternativas
Mximo nivel
de trazabilidad
Mnimo nivel
de trazabilidad
43
44
RESULTADO VERAZ
RESULTADO TRAZABLE
44
45
Instrumento
de medida
Pesas
certificadas
Copias
oficiales
Unidad
fundamental
S.I.:
Kilogramo
de Svres
Futuras medidas
hechas con el
instrumento de
medida
45
46
CRMs, Metodos
Referencia,
Ejercicios
interlaboratorios,
etc.
Mtodo analticos
Futuras medidas
Unidad base S.I.
Kilogramo de
Svres
Mximo nivel
Nivel mnimo
Incertidumbre
0
u
1
(u
2
1
+ u
2
2
)
1/2
(u
2
1
+ u
2
2
+ u
2
3
)
1/2
Nivel de
trazabilidad
46
47
47
48
48
49
49
50
50
X
Mi valor individual
Valor verdadero
Mi media
X
A lo sumo la dispersin
puede minimizarse
51
Dispersin de resultados de ensayos mutuamente independientes utilizando el mismo mtodo
aplicado a alcuotas de la misma muestra en diferentes condiciones: distintos operadores, diferente
equipamiento o diferentes laboratorios. La reproducibilidad necesita una especificacin de las
diferentes condiciones experimentales, las mas frecuentes son: entre das, entre operadores y entre
laboratorios.
Dispersin de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo mtodo
aplicado a alcuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el
mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo. Es una medida de la variabilidad (varianza)
interna y un reflejo de la mxima precisin que el mtodo pueda alcanzar.
Repetibilidad (ISO)
Reproducibliad (ISO)
52
Repetibilidad
Reproducibilidad
Aumenta variabilidad
Reproducibilidad
Interna (precision intermedia)
53
m
x p s s *
0
+ =
La funcin
precisin
54
55
Lmite legal
Resultados sin incertidumbre
56
Lmite legal
Resultados con incertidumbre
57
Resultados sin incertidumbre
Laboratorio 1
Laboratorio 2
58
Resultados con incertidumbre
Laboratorio 1
Laboratorio 2
X
A lo sumo la dispersin
puede minimizarse
X
Mi valor individual
Valor verdadero
Mi media
59
Desviacin tpica o estndar
( )
30 Para
1
2
<

=

n
n
x x
s
i
i ( )
30 Para
2
>
'

=

n
n
x
i
i

o
60
Desviacin estndar relativa
30 Para
% 100
s
%
s
RSD
<
=
=
n
x
CV
x
30 Para
% 100 %
RSD
>
'
=
'
=
n
CV

o
61
Varianza: su propiedad mas
importante es la aditividad
Desviacin estndar
de la media.
( )
1
2
2

n
x x
s
i
i
( )
( ) 1
2

= =

n n
x x
n
s
s
i
i
X
62
63
Informacin obtenida en la validacin del
mtodo analtico
ISO o Bottom-up
Informacin obtenida desde ejercicios inter-
laboratorios
Simulacin de Monte-Carlo
Cual es mas conveniente de utilizar?
Las mas
empleadas
64
Estrategia basada en utilizar la informacin obtenida
en la validacin del mtodo (VM)
Estrategia propuesta por la ISO o Bottom-up
Estrategia desde ejercicios interlaboratorios
Estrategia Simulacin de Montecarlo
65
Naturaleza del mtodo de ensayo y datos metrolgicos disponibles (Tipos A y B)
Requisitos del cliente
Especificaciones
Recursos del laboratorio
Qu debe tenerse en cuenta al momento de elegir una
metodologa para estimar la incertidumbre analtica?
66
Especificacin
Modelado del proceso de medicin
Identificacin
Identificacin de las fuentes de incertidumbre
Cuantificacin, Reordenamiento de fuentes
Clculo de la incertidumbre estndar
Combinacin
Clculo de la incertidumbre estndar combinada
Incertidumbre a informar
Clculo de la incertidumbre expandida
67



Metodologa general, aplicable a todo tipo de mediciones
Metodologa unificada, consistente y bien estructurada
Incorpora el conocimiento disponible sobre el ensayo
Da lugar a estimaciones cuantificables de significado no ambiguo
Mejora el conocimiento de los principios y tcnicas analticas
68



El analista debe efectuar estimaciones basadas en datos previos o experiencia
(Estimaciones tipo B)
El costo en tiempo y esfuerzo es considerable
Debe desarrollarse una expresin matemtica entre el mensurando (y) y los
parmetros x
i
sobre los que y depende: y = f(x
1
, x
1
... x
n
)
Como alternativa el proceso de medida puede dividirse en bloques y puede
calcularse la incertidumbre de cada bloque
La incertidumbre de cada paso se evala normalmente mediante anlisis
estadsticos de una serie de observaciones
Deben evaluarse las covarianzas asociadas a cualquier serie de parmetros que
estn correlacionados
Presenta tendencia a subvalorar la incertidumbre
69
Aplicacin de la ley de propagacin de errores
70
Aplicacin de la ley de propagacin de errores
Coeficiente de
sensibilidad
71
Magnitudes de entrada
no correlacionadas
Aplicacin de la ley de propagacin de errores
72
Magnitudes de entrada
correlacionadas
Aplicacin de la ley de propagacin de errores
73
Se multiplica la incertidumbre estndar combinada por un factor de
cobertura, k.

Est basado en distribuciones normales.

Garantiza que el intervalo valor medido U contiene el valor
verdadero con una cierta probabilidad:
74
Determinacin de GL
para incertidumbres de
tipo B
Determinacin de GL
efectivos (ecuacin de
Welch-Satterthwaite)
75



Ventajas
Engloba las fuentes y facilita enormemente la estimacin de la
incertidumbre.

Inconvenientes
No disponibilidad de los datos del ejercicio interlaboratorio.
La incertidumbre determinada puede no ser representativa del
laboratorio
76




Los resultados obtenidos desde una
participacion en un ejercicio entre laboratorios
pueden utilizarse a los fines de cuantificar la
incertidumbre de los resultados generados
(Condiciones de reproducibilidad)

77



Repetibilidad
Reproducibilidad
Aumenta variabilidad
Informacin desde ejercicios
inter-laboratorios
Cuantificacin bajo mxima
agrupacin de las fuentes
de incertidumbre
78
Incluye factores individuales intrnsicamente desconocidos



Ventajas
Los errores sistemticos y aleatorios que ocurren dentro de los laboratorios
individuales se convierten en errores aleatorios entre laboratorios cuando se
observan desde un nivel superior
Seleccin de los laboratorios
Limitaciones
Disponibilidad de informacin interlaboratorio
Las estimaciones de la reproducibilidad individual pueden no ser representativas
Algunos de los componentes de la incertidumbre (muestreo, pretratamiento)
pueden no estar incluidos
Diferencias entre medidas pasadas y condiciones actuales del laboratorio
79
Ventajas
Implica podo esfuerzo adicional pues siempre
debe determinarse trazabilidad y precisin en
condiciones de reproducibilidad interna.
Menos costosa que la aproximacin ISO
80
Inconvenientes
No disponibilidad de un adecuado material de referencia con elevada
jerarqua metrolgica.
Pueden existen factores que pueden no variar representativamente
al momento de determinar la trazabilidad.
No permite cuantificar las fuentes de manera individual.
En ocasiones es dificultoso el diseo experimental para cuantificar
alguna fuente de incertidumbre.
Sobrestimacin de algunas fuentes de incertidumbre.
81
En el Proceso de Verificacin de la Trazabilidad (PVT ) se genera
informacin en condiciones intermedias de reproducibilidad
idad producibil sesgo
u u U
Re
2 2
* 2 + =
Se deben incluir todas las
fuentes de variacin en el
mtodo analtico
82
Expresin de la incertidumbre

Intervalo de confianza (U)
El ltimo dgito significativo en el resultado y
en la incertidumbre debern coincidir
(1,23 0,08) mg/L (1,2305 0,08) mg/L (1,234 0,083) mg/L
83
Estimacin de la
Incertidumbre de una
Medicin Microbiolgica
84
Uncertainty of Quantitative Determination Derived
by cultivation of micro Organisms
Publication J3/2003
Centre for Metrology and Accreditation
Helsinki- Finland
(Seppo I. Niemel)
85
Resultado del ensayo
Valores observados
Mediciones
Incertidumbre
86
Incertidumbre estndar relativa
w
Incertidumbre estndar combinada
u
c ,
u
y
o w
y
Incertidumbre expandida
U=ku
c

k: F(distribucin de probabilidad).
Ej: Poisson o binomial negativa
87
Instrumentos cuantitativos
Suspensin de ensayo Suspensin final
Instrumentos
Sistema de tubos
Sistema de placas
88
Expresin de la incertidumbre
Resultado: x (unidades) con una incertidumbre estndar u
c
(unidades)

Intervalo de confianza (U)
El ltimo dgito significativo en el resultado y
en la incertidumbre debern coincidir
89
Expresin de la incertidumbre
Resultado: x (unidades) con una incertidumbre estndar u
c
(unidades)
y = x*10
k
y = 1300000 g
-1
con una incertidumbre del 25%


y = 1.30 * 10
6
g
-1
con una incertidumbre estndar 0.33 * 10
6
g
-1


90
Principios de estimacin de la incertidumbre
Tipo A
Tipo B
Otros
medios
Ley de Propagacin de las
incertidumbres
Hallazgo de las fuentes
predominantes
91
Fuentes de informacin
Calibracin
Anlisis de varianza de mediciones ya realizadas
Suposicin de distribuciones estadsticas (Poisson, binomial) o (rectangular y
triangular)
Experiencia, fabricantes de equipos, especificaciones, literatura cientfica,
experiencia de errores instrumentales, homogeneidad de materiales, reportes de
calibracin y certificacin, valores de incertidumbres citados en handbooks
92
Distribucin rectangular
Distribucin triangular
simtrica
Distribucin triangular
asimtrica
93
Clculo de la incertidumbre combinada
Ley de propagacin de incertidumbres
(A/B)
94
Variables dependientes
Coeficiente de correlacin
95
Transformacin de escala
El error relativo de una cantidad es aproximadamente igual al error
absoluto de su logaritmo. Myrberg (1952)
base e
96
Caractersticas metrolgicas de los mtodos de
cultivo microbiolgicos
Detectores
Detector de recuentos de colonias
(placas de Petri)
Detector presencia/ausencia
(tubos)
97
98
Una placa
N de colonias
Volumen de la suspensin final
99
Mltiples placas
100
MPN a una dilucin
101
MPN a dilucin mltiple
102
Resultados de ensayos
confirmados
Confirmacin In Situ
Confirmacin total
Confirmacin parcial
Confirmacin universal
103
Estimacin de componentes de la
incertidumbre
Incertidumbre de
lectura
Incertidumbre de
F
104
Incertidumbre de la lectura
Incertidumbre media por
lectura en una placa
Recuentos repetidos
Incertidumbre combinada
media por lectura en varias
placas
Incertidumbre de resultados
MPN
Generalmente no disponible
105
Dispersin de Poisson
Recuento simple de colonias
Suma de recuentos de colonias
106
Incertidumbre del volumen de ensayo
Repetibilidad de l dispositivo de medicin (llenado y vaciado)
Especificacin del fabricante de glassware
Efectos de la temperatura (Tcalibracin vs Tmedicin)
Un volumen de ensayo
Suma de volmenes de ensayo
107
Incertidumbre de recuentos confirmados
108
Incertidumbre de recuentos confirmados
109
Confirmacin general en instrumentos de
placas mltiples
110
Confirmacin dilucin-especfica en un
instrumento de placas mltiples
111
Confirmacin placa-especfica en un
instrumento de placas mltiples
No suele ser necesario suponer condiciones en cada placa del instrumento
de placas mltiples
En caso de ser necesario debe trabajarse como en Confirmacin dilucin-
especfica en un instrumento de placas mltiples

112
El factor de dilucin
a: Suspensin microbiana
b: Diluyente estril
113
Incertidumbre del factor de dilucin
114
K etapas similares
Si difieren en configuracin de
volmenes
Modelos matemticos de resultados de ensayos
cuantitativos y sus incertidumbres
Correcciones sistemticas para:
Factor de dilucin
Coeficiente de confirmacin
Variables para mtodos de recuento
cuantitativo de colonias
Factor de dilucin: F
Volumen para ensayo v
Nmero de colonias z
Coeficiente de confirmacin p
Tiempo y temperatura de incubacin
Se asume estricta adhesin a los
prescripto por las normas
115
Instrumento monoplaca
W
t
: Incertidumbre relativa
personal por lectura
116
Diseos multi-placas. General
117
p: Coeficiente de confirmacin
derivado de analizar un
subconjunto de las colonias
118
Diseos multi-placas. Recuentos confirmados
119
Instrumento MPN. Dilucin simple
120
Instrumento MPN. Dilucin simple.
Incertidumbre del volumen promedio de ensayo
121
Instrumento MPN. Dilucin simple.
Incertidumbre relativa de la estimacin MPN
i) Al 95% de confianza
ii) Un error estndar del log
10
MPN puede convertirse a incertidumbre relativa
w
MPN
simplemente transformando a escala logartmica natural (multiplicando
por 2.303)
iii) Sin otras fuentes de informacin, la incertidumbre relativa estndar puede
obtenerse suponiendo que el numero s de tubos estriles es una cantidad
aleatoria que varia acorde a la distribucin binomial. Por lo tanto su varianza
es s(n-s)/n
122
x
H
x
A
123
Instrumento MPN. Dilucin simple.
Incertidumbre combinada del resultado
124
Instrumento MPN. Dilucin mltiple.
125
Instrumento MPN. Dilucin mltiple.
126
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas
Las distribuciones estadsticas de los ensayos microbiolgicos son mas o menos
sesgados (asimtricos) prcticamente sin excepcin
Una adicin o sustraccin aritmtica simple de una incertidumbre expandida no
siempre da una estimacin satisfactoria del intervalo de confianza al 95% para
resultados de ensayos microbiolgicos
127
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas.
Estimacin por el uso de distribuciones de probabilidad
El modelo de Poisson
Aplicable cuando:

Observado < 25
Dilucin innecesaria
Hasta 100 por placa
128
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas.
Estimacin por el uso de distribuciones de probabilidad
El modelo binomial negativo
Se aplica cuando la incertidumbre procedimental no es
despreciable
Debe excluirse la incertidumbre de la distribucin
Debe incluir otras componentes pre-analticas como la
variabilidad de muestreo
Hasta 100 por placa
129
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas.
Aproximacin general.
130
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas.
Resultados basados en recuentos bajos
Condicin de aceptabilidad
131
Intervalos al 95% de confianza de distribuciones
sesgadas.
Mtodos MPN
Los intervalos son provistos por programas de
computacin (o tablas)
132
Un atajo al calculo de la incertidumbre para instrumentos multi-placa
Estadstico ratio log-likelihood
133
Estadstico ratio log-likelihood
134
Confirmacin

Cada recuento presuntivo debe ser convertido a su correspondiente recuento
confirmado.
Si solo una parte de las colonias son confirmadas deben aplicarse los coeficientes
respectivos.
135
136
137
Modelos completos para correcciones sistemticas y sus incertidumbres
Naturaleza de las correcciones sistemticas en microbiologa
Errores espurios:
Contaminacin, antibioticos, interacciones competitivas entre colonias
Temperatura

Errores sistemticos:
Inhabilidad ocasional de una partcula viable para expresarse como colonia
reconocible
Solapamiento geomtrico de colonias vecinas
Desvo sistemtico del estilo de recuento
Disminucin del rendimiento de un lote de medio
138
139
Ejemplo 1. Placa simple muestra no diluida
Se siembra una placa simple con un 1 l (loop calibrado). Su incertidumbre
relativa es de 12 % (w
v
= 0,12)
z = 75
Mensurando: y = z/v

Dispersin de Poisson
140
Replicados de muestras o muestras control en condiciones de reproducibilidad
(ISO TS 19036)
Elementos y suposiciones para calcular la incertidumbre
Muestras de control (no estndares)
Todas las etapas del mtodo
Duplicado, en diferentes das, diferentes analistas, diferentes equipos,
Diferentes batchs de reactivos
Se asume que la matriz empleada es representativa de las muestras
American Association for Laboratory Accreditation
141
142
Cules son las etapas para calcular la incertidumbre?
1.Transformar en log
10
los datos de CFU (columna 2 y 4)
2.Calcular la media global de los 40 resultados (columnas 2 y 4) . Su valor: 1.9219
3.Calcular la diferencia entre los replicados transformados (columna 5)
4.Elevar al cuadrado las diferencias entre los replicados transformados (columna 6)
5.Sumar las diferencias (columna 6) y dividirlas por 2n, donde n es el total de pares duplicados (en este caso n=20). El valor
es: 0.00919
6.Tomar la raz cuadrada del resultado obtenido en el paso anterior. Este valor , 0.0959, representa a la desviacin estndar
conjunta de reproducibilidad
7.Convertir esta desviacin estndar en desviacin estndar relativa dividiendo por el valor medio obtenido en la etapa 2. De
acuerdo a esto RSD = 0.0499
8.Para expandir el rango de valores , aplicar el factor de cobertura k=2 (95% de confianza). La RSD obtenida es: 0,098 (valor
en log
10
)
9.Para calcular la incertidumbre del resultado de cualquier otra muestra que llegue al laboratorio, su resultado debe ser
transformado a logaritmo decimal y multiplicado por 0,098. Esta incertidumbre expandida debe sumarse y sustraerse al
logaritmo en base 10 obtenido.
10. Para estimar la incertidumbre de la muestra, convertir el valor logartmico (volver) a UFC. Este valor debe ser acompaado
por el antilogaritmo de los extremos del intervalo obtenido en el punto anterior. Convencionalmente, el resultado del
extremo inferior debe redondearse hacia abajo y el extremo superior debe redondearse hacia arriba.
143
Replicados de recuperacin para muestras o muestras de control (ISO TS
19036)
Elementos y suposiciones para calcular la incertidumbre
Suposicin de que la recuperacin es razonablemente constante para determinados organismos en
determinadas matrices .
La variabilidad de la recuperacin en el tiempo refleja a varias fuentes de incertidumbre
Una misma cantidad de inoculo es sembrada con y sin la matriz de interes.
Las diferencias entre cada conjunto es una medida de la recuperacin del organismo expresada como
un %
Error aleatorio natural
Equipamiento
Condiciones ambientales

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145
Cules son las etapas para calcular la incertidumbre?
1. Transformar los valores de CFU a log
10
(columna 1 y 3)
2. Calcular el % de recuperacin de los valores logartmicos dividiendo la columna 4 por la columna 2
y multiplicando por 100.
3. Calcular la media y desviacin estndar del % de recuperacin de los valores logartmicos (97.0% y
3.6% respectivamente). La desviacin estndar es un estimado de la incertidumbre estndar
combinada.
4. Transformar a incertidumbre expandida multiplicando el valor anterior de desviacin estndar por
k=2 (7.2 %)
146
Desde Ejercicios Inter-Laboratorio (EIL)
Proviene de: ISO TS 21748: Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates
in measurement uncertainty estimation.

El EIL debe cumplir los requisitos de: ISO 5725-2: Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of
a standard measurement method.

Se sobreestima la incertidumbre calculada

Se requiere demostrar que el laboratorio es competente.

Se incluyen todas las etapas del proceso de medicion

147
Protocolo sugerido para el calculo de la incertidumbre desde EIL
1. Asegurase de que se dispone de un diseo de estudio de validacin y anlisis de datos apropiado (que incluya remocin de
outliers, clculos estadsticos, anlisis de efectos de concentracin, etc.) y que las estimaciones de Repetibilidad (S
r
) y
Reproducibilidad (S
R
) son apropiadas para el uso en el laboratorio.
2. Tomar la estimacin de la Reproducibilidad como una estimacin provisoria de la incertidumbre de la medicin (u ): =

.
3. Utilizar la estimacin de la Reproducibilidad y Repetibilidad para calcular la SD entre laboratorios (S
L
) de la siguiente manera:

2

4. Estimar el sesgo del laboratorio (B
L
) desde mediciones replicadas de materiales de referencia comparando con laboratorios de
referencia o desde interlaboratorios de aptitud: B
L
= (Media del Laboratorio Valor de Referencia)
5. Estimar la repetibilidad del laboratorio (S
i
) desde un estudio interno, el cual puede haber sido realizado previamente. Debe estar
basado en al menos 10 replicados. Nota 1: Si la estimacin del sesgo del laboratorio (B
L
) es menor que S
L
puede saltearse el paso 6.
Si la repetibilidad S
i
es menor que S
r
puede saltearse el paso 7 (pero considerar paso 7c)
6. Calcular el criterio de aceptabilidad para el sesgo del laboratorio de la siguiente manera: Sesgo limite = 2xS
L
. Si |B
L
| < Limite de
sesgo el sesgo del laboratorio es aceptable para el uso de este procedimiento. En caso de superar el limite verificar las razones y
corregir si es posible.
7. Calcular el criterio de aceptabilidad para la repetibilidad: Limite de precisin = 1,5xS
r

a) Si S
i
< limite de precisin la precisin es aceptable para este procedimiento
b) Si S
i
> limite de precisin el procedimiento puede aun emplearse, pero la incertidumbre provisoria debe ser expandida de
la siguiente manera: =

2

c) Si S
i
es mucho menor que S
r
el laboratorio podr querer disminuir la estimacin provisoria de la incertidumbre usando e
mismo calculo que en el paso 7.b.
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Protocolo sugerido para el calculo de la incertidumbre desde EIL
Nota 2: ISO TS 21748 requiere una prueba F, basada en el nmero de resultados en el estudio de validacin y el
nmero de resultados utilizados por el laboratorio para estimar la repetibilidad. Para el nmero mnimo de
resultados en un estudio aceptable, y al menos 10 replicaciones en el estudio de repetibilidad, el lmite de precisin
en este paso es el criterio ms apretado que se obtendra.


8. Agregar componentes de variabilidad (S
a1
, S
a2
, etc.) que no hayan sido incluidos en el experimento de
validacin, tales como submuestreo o preparacin de la muestra. Pueden haber mas de una componente adicional.
Agregar la componente(s) adicional a la estimacin provisoria (u) para generar la estimacin final de la
incertidumbre combinada estndar: =
2
+
1
2
+
2
2


9. Calcular la incertidumbre expandida con el 95% de cobertura y k = 2 de la siguiente manera: U = 2xu

Nota 3: Si la estimacin de la incertidumbre es un %, la incertidumbre actual deber ser calculara para cada
muestra a su nivel respectivo.

Nota 4: Los extremos del intervalo de incertidumbre debern ser calculados con calores log10 y luego vueltos a
transformar a UFC.
149
Ejemplo: AOAC mtodo 990.12. Recuento en placa. Aerbicos
Parmetros del Ejercicio Inter-Laboratorio

8 laboratorios
6 alimentos con distintos niveles de contaminacin
2 muestras por alimento
2 replicados por muestra
E conjunto de datos es cconsistente con ISO 5725-2
El EIL incluye todas las etapas del procedimiento analtico excepto el submuestreo
150
Ejemplo: AOAC mtodo 990.12. Recuento en placa. Aerbicos
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Ejemplo: AOAC mtodo 990.12. Recuento en placa. Aerbicos
Para estimar el sesgo (paso 4) el laboratorio realiza un estudio de comparacin con un
laboratorio de referencia y los resultados para vegetales y camarones estuvieron siempre
dentro de del 10% (B
L
< 10.0%) . La comparacin con muestras de harina mostraron
resultados por debajo de 5% (B
L
< 5.0%). Se declara al sesgo como aceptable.

Para estimar la repetibilidad (paso 5) el laboratorio gener una estimacin con una serie
de 10 replicados, y la repetibilidad para todos los alimentos fue del 5% o menos (S
i
<
5.0%). Se decide entonces que la repetibilidad es aceptable, as las estimaciones (bajas)
de la incertidumbre provisoria pueden ser calculadas como se describe en el paso 7c
(empleando la formula de 7b)

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Ejemplo: AOAC mtodo 990.12. Recuento en placa. Aerbicos
En consideracin a componentes adicionales (paso 8), asumimos que al preparacion de la
muestra (sub-muestreo, pesada) es estimada en un 3,0% de incertidumbre adicional.

Este componente fue agregado como se describe en el paso 8, y la incertidumbre final fue
expandida de acuerdo a (9).
Consultas? Material de estudio?
153
Auto - Matriculacin:
http://www.metroquimica.com.ar/cursos/moodle/course/view.php?id=141

Contrasea de matriculacin: vimm-3ccm-ads688131
Muchas gracias por su atencin
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