MC MARISOL CASTILLO MORALES

Cromatografa
Mtodo usado para la separacin de los componentes de
una muestra.
Tcnica
Cromatogrfica
Fase Mvil
Fase
Estacionaria
Interaccin
Ciencia de las separaciones.

Cromato= color/ Grafos= Escritura
separacin
Antecedentes
En los tiempos de Aristteles se
utilizaban los efectos absortivos
de distintas tierras para tratar
el agua de mar.

Sin embargo fue documentada
por primera vez por el cientfico
Ruso Tsweet en 1903-1906.
En el cual los componentes son distribuidos
entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria, mientras que la otra es
mvil. La fase estacionaria puede ser un
slido o un lquido soportado en un slido
o en un gel (matriz). Mientras que la
mvil es un solvente.

CROMATOGRAFIA
Slido Lquido
Gas
Slido Liquido
Fluido Supercrtico
Slido Lquido
Lquido
Modos de cromatografa
Slido
Fase
Normal
Fase
Reversa
Fase unida Int. Inico
Exclusin
por Tamaos
Permeacin
por Gel
Exclusin
Columna
Capa Fina Papel
Planar
Cromatografa
de Lquidos
TIPOS DE CROMATOGRAFA
Los mtodos cromatogrficos son
de dos tipos fundamentales:
Cromatografa en columna:
La fase estacionaria se mantiene
dentro de un tubo angosto y la
fase mvil se hace pasar por el
tubo con presin o por gravedad
Cromatografa plana
La fase estacionaria esta sujeta
por una placa plana en los poros
de un papel. En este caso la fase
mvil se mueve a travs de la fase
estacionaria por accin capilar
por la influencia de gravedad.

las retenciones mencionadas pueden tener su
origen en dos fenmenos de interaccin que se
dan entre las dos fases y que pueden ser :
La adsorcin
La absorcin
Adsorcion
La adsorcin, que es la retencin de una
especie qumica por parte de los puntos
activos de la superficie de un slido
quedando delimitado el fenmeno a la
superficie que separa las fases o superficie
interfacial.

El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase
mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una mezcla
de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con otra fase,
las sustancias se concentran ms o menos en la superficie de la otra
fase; esto se llama adsorcin.
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LQUIDO-GAS:
La fase fija es un liquido y la fase mvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIN SLIDO-GAS:
La fase fija es un slido y la mvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIN SLIDO-LQUIDO:
La fase fija es un slido y la mvil un lquido. Es la mas usual, se puede
hacer en columna o en capa fina.
ABSORCION
2. La absorcin, que es la retencin de
una especie qumica por parte de una
masa, y debido a la tendencia que esta
tiene a formar mezcla con la primera,
absorcin pura, o a reaccionar
qumicamente con la misma, absorcin
con reaccin qumica, considerando
ambas como un fenmeno msico y no
superficial.

METODOLOGIA
Algunos de los mtodos cromatogrficos son:


Cromatografa en papel
Cromatografa de capa fina
La cromatografa en capa
fina se basa en la
preparacin de una capa,
uniforme, de un adsorbente
mantenido sobre una placa
de vidrio u otro soporte.
Cromatografa de intercambio inico



Utilizan este mtodo para separar
istopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
Cromatografa de gel-filtracin
Fodin y Porath en 1958
descubren que usando
como fase estacionaria
geles se consigue
separar polmeros
sintticos de alto peso
molecular.
Cromatografa de afinidad.
Ideada por Porath en 1967,
usando como fuente un
pptido o protena unida
covalentemente a un ligando
y se utiliza para la separacin
de molculas proteicas.
Cromatografa de gas.

Es una de las tcnicas ms
utilizadas e importantes, de
forma que ha revolucionado el
campo de la qumica analtica.
APLICACIN
La cromatografa es un medio muy eficaz
para responder a las mas variadas
preguntas que tengan relacin con las
mezclas qumicas.




En 1906 Tswett :
Mtodo en el cual los componentes de una mezcla son
separados en una columna adsorbente dentro de un
sistema fluyente.
I.U.P.A.C :
Mtodo usado principalmente para la separacin
de los componentes de una muestra, en el cual
los componentes son distribuidos entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra es mvil. La fase
estacionaria puede ser un slido o un lquido
soportado en un slido o en un gel (matriz). La
fase estacionaria puede ser empaquetada en
una columna, extendida en una capa,
distribuida como una pelcula, etc...

Esta versin instrumental de la
cromatografa convencional resulta ms
ventajosa debido a los pequesimos
volmenes que se necesitan para el
estudio en cuestin y los resultados se
obtienen en un tiempo mnimo. Estos
aspectos la hacen preferida entre las
tcnicas de separacin.
APLICACION
Se ha convertido en una de las
herramientas ms poderosas para
el qumico analista en muy
diversos campos de aplicacin.
Qu es H P L C ?
High
Pressure
Liquid
Chromatography


Inicios de la instrumentacin
High
Performance
Liquid
Chromatography

Avance de la instrumentacin

Tcnica que realiza la separacin
fsica de una mezcla de compuestos
a travs de la interaccin selectiva
entre los solutos, una fase
estacionaria y una fase mvil,
haciendo uso de instrumentacin
automatizada de alta resolucin.
Qu es H P L C ?
SISTEMA CROMATOGRAFICO

La cromatografa de lquidos de alta resolucin ( HPLC )
es un mtodo fisicoqumico de separacin, basado en el
principio de la PARTICIN.



PARTICIN: es el reparto o distribucin de los componentes
de una muestra entre dos fases: una mvil que es un lquido
y una fija que puede ser un slido o un lquido.

MUESTRA
FASE MVIL FASE FIJA
lquido
slido o lquido
Columna
Es un tubo ordinario de acero inoxidable de
dimetro interno uniforme.
Empaque
TIPOS DE COLUMNAS
ANALITICAS
Long. 5-30 cm.
Dimetro interno 2 a 10 mm
Tamao de partculas 2 a 10m

Preparativas
Long. 50 100 cm
DI desde 5cm

Tipos de empaque
CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA:
La fase estacionaria es apolar, y la fase mvil polar.
Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo
reaccionar qumicamente los centros silanoles activos
de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin se produce en esta especie de capa
lquida depositada qumicamente como
consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre
la fase estacionaria ( apolar) y la fase mvil (polar).
Los compuestos ms retenidos son los ms apolares. La
retencin y selectividad se controlan
fundamentalmente con la composicin de la fase
mvil. Para obtener una fase mvil de fuerza de
elucin ptima, se ensayan mezclas de metanol,
acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.



CROMATOGRAFIA EN FASE NORMAL
En esta cromatografa a diferencia de en fase reversa, la fase
estacionaria es polar y la mvil apolar. Las fases estacionarias
se obtienen haciendo reaccionar qumicamente los centros
silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin tambin (como la de fase reversa) tiene lugar en
esa especie de capa lquida depositada qumicamente,
como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la
fase estacionaria (polar) y la fase mvil (apolar). Donde el
analito menos polar ser el primero que se eluye y el ms
polar el ltimo en eluir.


PARTICION
Es el reparto o distribucin de los componentes de
una muestra entre dos fases: una mvil que es un
lquido y una fija que puede ser un slido o un
lquido
MUESTRA
FASE MVIL
FASE
ESTACIONARIA
slido o lquido

0.009"
0.020" 0.040"
Contribucin de la columna
BOMBA
Requisitos
6000 psi (lb/in
2
)
Flujo sin pulsaciones
Caudal 0.1 a 10 mL/min
Reproducibilidad del caudal
Componentes resistentes a la corrosin
Tefln, rub, zafiro, cermica, Tefzel


TIPOS DE BOMBAS
BOMBA RECIPROCA

Bomba de
desplazamiento


Bomba neumtica
Sistemas de inyeccin
Manual


Automtica
DETECTORES
INDICE DE REFRACCION
FRESNEL
DEFLEXIN
INTERFEROMETRICO
GENERALES
UV
FLUORESCENCIA
ELECTROQUIMICO
SELECTIVO
DETECTORES
REGISTRO
REGISTRADOR
Seal en un grafico X-Y
INTEGRADOR
Incluye tratamiento matemtico
COMPUTADORA
Software que incluye grafico, clculos y
almacenamiento de datos
En el proceso cromatogrfico se obtienen
seales o picos:
R
e
s
p
u
e
s
t
a

d
e
l

d
e
t
e
c
t
o
r

Tiempo
t
r
= Tiempo de retencin
t
r
= Tiempo de retencin ajustado
Inyeccin
t
r
t
r
t
m
t
m
= Tiempo de retencin de un soluto no
retenido


CROMATOGRAMA
Parmetros principales
t
R

t
M

t
R
= t
R
- t
M

TEMPO
S
I
N
A
L

t
r
= Tiempo de retencin
t
r
= Tiempo de retencin ajustado
t
m
= Tiempo de retencin de un soluto no
retenido

Inyeccin
h = altura del pico
W
b
= Ancho del pico en su base
W
1/2
= ancho del pico a la media altura
2 / 1 2 / 1 2 1 2 1
2
1
1 2
2 1
* 176 . 1
) (
* 2
) (
Re
b b
r
W W
t
W W
t
W W
t t
R solucin
b b
r
b b
r r
+
A
=
+
A
=
+

= =
Resolucin

CROMATOGRAMA
Parmetros principales:Platos tericos
t
r
Inyeccin
t
r
t
m
W
b

W
1/2

2
2 / 1
2
554 . 5 16 Tericos Platos
|
|
.
|

\
|
=
|
|
.
|

\
|
= =
W
t
W
t
N
r
b
r
N
L
H HETP
c
= = = terico plato un a eqivalente Altura
Lc = Longitud de la columna
CROMATOGRAMA
Parmetros principales:Platos tericos
Ecuacin Maestra de la Resolucin:
4
*
1
*
1
N
k
k
R
S
|
.
|

\
|

|
.
|

\
|
+
=
o
o
Capacidad Selectividad Eficiencia
Factor
de retencin
Factor
de separacin
Platos
Tericos
El Proceso Cromatogrfico
Cmo identificar cada compuesto cuando se tiene una serie
de picos en un Cromatograma?

Yo lo s por el Tiempo de

Retencin

de los picos de
Estndares puros
Tiempo
El Proceso Cromatogrfico
Cmo s qu cantidad est presente en la muestra?

Yo lo s por el rea y altura

de los picos
Medicin del rea o altura del pico
Clculo de la concentracin del analito
Normalizacin Interna
Estndar interno
Estndar externo
Estndar agregado

Cuantificacin
Estndar externo
Es el mtodo de cuantificacin ms utilizado
en HPLC. Consiste en la preparacin de
estndares de concentracin semejante al
analito en la muestra y en el ensayo
cromatogrfico de ambas, muestra y estndar
en las mismas condiciones operativas. Su
exactitud depende de manera importante de
la calidad del estndar utilizado.
P = (Am Cs / As) D * 100
Am = Area de la Muestra
Cs = Concentracin del estndar
As = Area del Estndar
D = Factor de Dilucin
GLOSARIO
Electronegatividad
Polaridad
Cromatografia
Tipos de cromatografias
Fase movil
Fase estacionaria
Bombas
Columnas
Fase normal
Fase reversa
Exclusion de tamao
quiralidad
Parmetros
cromatograficos
Rs. Rt, Vo, To, N, etc