PROTOCOLO- FASE I

Antes de comenzar debes tener la bata puesta, debes lavarte las manos y ponerte los guantes que estn en la poyata.

PROTOCOLO- FASE I FASE 1.- MICROPROPAGACIN DEL MATERIAL VEGETAL 1.- Preparacin del medio de cultivo o crecimiento: Ve a la poyata y toma un vaso de precipitados llnalo de agua destilada en el grifo. Ve a la poyata donde se encuentra el agitador coloca el vaso sobre el agitador y ve aadiendo (toca cada bote) los siguientes ingredientes por este orden: 1X Murashige Skooh -S1b. 2% Sacarosa. Ajustar el pH a 5,8 colocando el vaso en el medidor de pH. Ahora aadir: 0,8% bactoagar, pH 5,8

Chopo (Populus sp. 3 meses)

2.- Pasar el medio a una botella, (ponerle una cinta de autoclave en la tapadera) y llevar al autoclave.

PROTOCOLO- FASE I 3.- Encender la cabina de flujo laminar, y poner las pinzas y tijeras que estn en la cabina en el esterilizador de boles de vidrio. 4.- Recoger bandeja con botes estriles cercanos al autoclave. Recoger ahora el bote con medio del autoclave y llevarlo a la cabina. 5.- Una vez que el medio de la botella est atemperado (ojo!! si se endurece pasa de amarillo a gris y debes volver a empezar). Aadir: cido indolactico o auxina (IAA, 0,5 mg/L ) (frigorfico de 4C). 6.- Repartir 2 cm del medio en cada bote estril y dejar solidificar (cambia el color de amarillento a grisceo). 7.- Sacar con las pinzas el rbol y colocarlo sobre la placa petri de cristal, cortarlo en brotes con al menos una hoja cada uno y transferir cada brote a un tubo, clavando el brote. Llevar los brotes nuevo al fitotrn y dejarlos durante durante 6 semanas, all estarn a 25C con un fotoperiodo de luz de 16horas de luz y 8 horas de oscuridad. Ahora sal del fitotrn, vuelve a entrar y comprueba si tus plantas han crecido correctamente, si es as habrs pasado la fase I, (cada vez que salgas y entres habr pasado una semana de tiempo).

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformacin Bacteriana Pasos a llevar a cabo: - la PCR. - la ligacin. - la transformacin bacteriana. PCR 1.- Enciende la mquina de PCR, el termobloque tarda en calentarse. 2.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorfico a -20C : - ADN molde a partir del cual se amplificar el gen (100ng/ul). - Oligonucletidos (primer) derecho e izquierdo 100uM (forward and reverse). - Tampn de la enzima polimerasa. - Cloruro de Magnesio 25mM. - Mezcla standard de dNTP 1mM (dinucletidos trifosfato). - ADN polimerasa (5u/ul). - Agua destilada. 3.- Ve a tu poyata y suelta la bandeja de hielo.

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformacin Bacteriana 4.- Toma una caja de tubos eppendorf de la vitrina llvala a la poyata y tcala para sacar un tubo. 5.- Ve a tu poyata y en el tubo de PCR mezcla todos los componentes, para ello debes tomar primero la pipeta y una punta amarilla, los componentes se mezclan de forma automtica en el tubo al seleccionarlos de la lista que se abre al tocar la bandeja.

6.- Al terminar la mezcla toma el tubo y ve al aparato de PCR.

7.- Introduce la mezcla en la PCR y pulsa start, cuando acabe la PCR (tarda un tiempo), guarda el fragmento de ADN (el gen) amplificado a -20C.

En un entorno real todos los reactivos deben ser devueltos al frigorfico lo antes posible.

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformacin Bacteriana LIGACIN 1.- Enciende el termobloque a 16C. 2.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorfico a -20C : ADN plasmdico (el vector). ADN amplificado por PCR (el gen de inters, tubo verde). Tampn de la enzima ligasa. Enzima ligasa. Agua destilada.

3.- Toca la caja de tubos eppendorf para sacar un tubo.

4.- Ve a tu poyata y en un tubo de PCR mezcla todos los componentes, tomando la pipeta amarilla y una punta. 5.- Introduce el tubo con la mezcla en el termobloque, deja o/n (overnight) es decir, 8-10h a 16C. 6.- Guarda el plsmido a -20C. Si los has hecho bien, ya tienes el gen dentro del plsmido para el siguiente paso, ahora debes introducir el plsmido en la bacteria.

Revisa los mensaje del tutor para ver qu errores has cometido.

Gracias por participar en el Laboratorio Piloto de Biotecnologa Agroforestal!!!!!!!!!!!

PROTOCOLO- FASE II: Transformacin Bacteriana TRANSFORMACIN BACTERIANA

1.- Recoge el soporte con hielo y saca un tubo de bacterias de -80C y djalo en hielo, las bacterias deben descongelarse lentamente para disminuir la tasa de mortalidad.
2.- Toma del frigorfico a -20C el ADN plasmdico que contiene el gen y djalo en hielo. 3.- Ve al aparato de electroporacin que est dentro de tu cabina, toca la cubeta para depositar en ella una mezcla del plsmido y de la bacteria que acabas de descongelar, el choque elctrico abre las paredes bacterianas y el plsmido entra en la bacteria. 4.- Coloca el tubo en el horno a 37C para que las bacterias se recuperen durante 1hora (20 segundos virtuales), (despus las bacterias del tubo se pasaran a una placa petri con medio de cultivo en presencia de antibitico, slo creceran las bacterias que contienen tu gen con el plsmido que le confiere resistencia a dicho antibitico, de la placa se toma una colonia que se crece en medio lquido en el horno a 37C, estos pasos se realizan virtualmente dentro del horno y no los realiza el avatar) del horno obtendrs finalmente un tubo falcon con la bacteria lista para transformar la planta. Si el cultivo ha crecido, pasa a la siguiente fase!!!!

PROTOCOLO- FASE III TRANSFORMACIN VEGETAL 1.- Recoge el Falcon con las bacterias del horno y llvalo a la cabina de flujo. 2.- Recoge los rboles de 3 meses de la cmara visitable y llvalas a la cabina. 3.- Al tocar el material vegetal ste pasa a quedar cortado en trozos este material quedar dentro del medio con la bacteria la cual transforma el material. 4.- Lleva las placas a la cmara visitable y espera a que se vayan generando callos, entra y sale de la cmara para observar los resultados, recuerda que la fase de desdiferenciacin celular se salta en la prctica virtual.

5.- Cuando observes explantos sobre el callo llvalos a la cmara y traslada los brotes a botes de plstico con medio, estos botes son de plstico, son ms grandes y serviran para inocular los rboles crecidos en su interior.
6.- Lleva los botes a la cmara, espera a que crezcan y llvalos a la cabina de flujo para inocularlos con patgenos.

PROTOCOLO- FASE VI INOCULACIN Y FENOTIPADO 1.- Recoge las plantas de los botes de plstico, llvalos a la cabina. 2.- Recoge el inculo de hongo o de bacteria marcado como tal en el horno de incubacin. (el paso de preparado del inculo no se lleva a cabo en virtual). 3.- Traslada el inculo del erlenmeyer al bote de spray tocndolo. 4.- Inocula con spray tomndolo y acercndolo al bote de plstico que contiene el rbol. 5.- Cierra el bote y llvalo a la cmara, observa los sntomas al cabo de 1,2,3 y 4 semanas virtuales (recuerda que cada vez que entras y sales pasa una semana). 6.- Anota los resultados del fenotipado y extrae conclusiones.

FUNDAMENTOS FASE V: DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD IN VITRO DEL ANTIBITICO VEGETAL

FUNDAMENTOS FASE VI: LOCALIZACIN SUBCELULAR Y TISULAR DEL ANTIBITICO VEGETAL

ESTAS FASES SE ENCUENTRAN EN PROCESO..

cido indolactico
Se trata de una fitohormona reguladora del crecimiento vegetal del grupo de las auxinas. Estas hormonas desempean un papel fundamental en el desarrollo vegetal ya que promueven la elongacin celular, el desarrollo radicular, el crecimiento del fruto y son responsables de la dominancia apical. Se sintetizan en la yemas, en los tejidos jvenes, frutos y embrin. Todas las auxinas son compuestos que poseen un anillo aromtico y un grupo carboxlico. El miembro ms importante y potente de las auxinas es el cido indolactico. Existen anlogos sintticos de las auxinas como el 2,4-D (cido 2,4diclorofenoxiactico), el cido indol butrico (IBA) y el cido naftalen actico (ANA).

ADN
ADN (cido desoxirribonucleico) o DNA (deoxyribonucleic acid). Tipo de cido nucleico, macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido. Cada nucletido, a su vez, est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato que acta de enlace entre nucletidos. Para ms informacin: http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna

ADN molde
Secuencia de ADN que sirve de referencia para la ADN polimerasa.

Agar
Polisacrido sulfatado complejo compuesto principalmente por galactosa y cido glucurnico. Se extrae normalmente de algas rojas y se usa como agente solidificante en medios de cultivo. Tiene dos propiedades importantes: -No es asimilable por los microorganismos, slo es un sustrato o matriz, esto hace que el medio de cultivo no se altere por el crecimiento. -Se funde por encima de 100C pero no solidifica hasta temperaturas por debajo de 45C, esto permite ser utilizado en el laboratorio a temperaturas toleradas por las manos humanas, y cultivar los microorganismos en un amplio rango de temperaturas. Su utilizacin en medios de cultivo data del siglo XIX cuando la esposa de W. Hesse (colaborador de R. Koch) se enter de las dificultades de su esposo para cultivar microorganismos en medios slidos, y le aconsej utilizar el espesante de sus mermeladas (el agar).

Agitador de laboratorio
Instrumento de laboratorio diseado para mezclar lquidos, o lquidos y slidos. Existe una variedad de agitadores basados en la aplicacin:
- Agitador de bandeja: se trata de una superficie que gira en el plano accionada por un motor . Se suele utilizar para mezclar cosas delicadas, como geles para tincin. Los agitadores orbitales poseen balanceo, lo que contribuye a una mezcla mas eficiente.

- Agitador magntico: se basa en un motor elctrico regulable en velocidad de giro que crea un campo electromgnetico que hace girar un imn colocado en el recipiente de mezcla (matrz, vaso de precipitados, etc). Este tipo de mezcladores suelen presentar una superficie calefactora que facilita la disolucin de solutos. Estos agitadores son muy populares para la elaboracin de soluciones, medios, etc, en volmenes que van desde los pocos ml a varios litros.
- Agitador de noria: los recipientes estancos giran en el plano vertical, como una noria. - Agitador de vrtice (vortex), se trata de agitadores para mezclar volmenes relativamente pequeos (desde pocos microlitros hasta ml) en una amplia variedad de tubos de laboratorio (eppendorf, falcon, tubos de ensayo, etc). El movimiento excntrico del eje orbital crea un vrtice o vortex que facilita una mezcla rpida y eficiente.

Agrobacterium tumefaciens
Bacteria que origina una enfermedad denominada tumor de cuello en algunas plantas. La bacteria infecta heridas de la planta e incorpora un fragmento de ADN llamado ADN-T de su plsmido Ti (inductor de tumores) en el genoma de la planta hospedadora. Este ADN-T contiene genes de virulencia que inducen el tumor . Este mecanismo puede utilizarse para transferir ADN forneo a una clula vegetal, para ello se modifica el plsmido Ti sustituyendo parte del ADN-T por el ADN (gen) de inters y eliminando los genes de virulencia.

Cabina de flujo laminar

Cmara diseada para mantener el ambiente estril requerido para trabajar con cultivos de clulas o tejidos. Se consigue mediante el paso de un flujo continuo no turbulento de aire esterilizado por filtracin a travs de la zona de trabajo. El flujo de aire puede ser horizontal o vertical. En las cabinas de flujo horizontal, el aire filtrado mediante filtros de alta eficiencia HEPA, atraviesa la cmara central en una corriente laminar horizontal que se expulsa por la abertura frontal de la cabina. En las campanas de flujo vertical, el aire filtrado fluye a modo de cortina y evita que las micropartculas y aerosoles que se puedan crear en la manipulacin contaminen al manipulador y al ambiente. Mediante un sistema de aspiracin se recoge el aire contaminado y despus de pasarlo por unos filtros, se expulsa al exterior.

Callo
Los tejidos daados que crecen de forma desorganizada se conocen, en las plantas, como callos. En las tcnicas del cultivo in vitro, se denomina callo al tejido desdiferenciado formado por clulas vegetales totipotentes (clulas capaces de regenerar un organismo completo si las condiciones ambientales y los estmulos son los adecuados) que crecen en medios con nutrientes. Los callos se pueden obtener al introducir explantes o pequeas porciones de tejidos como hojas, cotiledones o races , en medios de induccin de callo. Tambin se pueden obtener callos al pasar protoplastos aislados a medios de induccin de callo, donde se regeneran de nuevo las paredes celulares y se induce su divisin celular. Para regenerar con xito una planta a partir de una clula individual indiferenciada es necesario cultivar los callos en un medio que posea nutrientes y hormonas de crecimiento (fitohormonas) . stas controlan el crecimiento y la diferenciacin de las clulas vegetales: las auxinas regulan el crecimiento de la raz, y las citoquininas inducen el crecimiento de los brotes e inhiben de este modo el crecimiento de la raz. La proporcin entre citoquininas y auxinas es decisiva.

Clonacin
En sentido general es obtener copias idnticas de un organismo, clula o molcula. Clonacin gnica es la insercin de un fragmento de ADN en un vector o en un cromosoma hospedador para diferentes propsitos como su multiplicacin o su expresin entre otros.

Codificar
Segn la Real Academia de la Lengua Espaola, codificar es transformar mediante las reglas de un cdigo la formulacin de un mensaje.

En gentica molecular se dice que los genes codifican protenas. Esto quiere decir que los genes contienen un mensaje (la informacin necesaria para la sntesis de una protena) que sigue las reglas de un cdigo (el cdigo gentico). Para entender el mensaje codificado de un gen, ste tiene que ser traducido (traduccin gentica).

Cdigo gentico
El cdigo gentico es el conjunto de normas por las que la informacin codificada en el material gentico (secuencias de ADN o ARN) se traduce en protenas (secuencias de aminocidos) en las clulas vivas. El cdigo define la relacin entre secuencias de tres nucletidos, llamadas codones, y aminocidos. Un codn se corresponde con un aminocido especfico. El nmero de codones posibles es 64, de los cuales 61 codifican aminocidos (siendo adems uno de ellos el codn de inicio, AUG) y los tres restantes son sitios de parada (UAA, llamado ocre; UAG, llamado mbar; UGA, llamado palo). La secuencia de codones determina la secuencia aminoacdica de una protena en concreto, que tendr una estructura y una funcin especficas.

El cdigo gentico es universal, especfico, continuo y degenerado.

Para ms informacin: Los cdigos genticos (tablas):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgencodes#SG1

Cultivo de bacterias (lquido y en placa).

Los microorganismos que se utilizan en el laboratorio son cultivos puros, proceden de una sola clula. Las bacterias se cultivan en el laboratorio en condiciones aspticas, todo el material utilizado debe ser estril. Se utilizan incubadores donde se controla que la temperatura y las necesidades de oxgeno sean las ptimas para cada bacteria. Dependiendo de las necesidades el medio de cultivo puede ser lquido o slido. -los medios lquidos se utilizan para obtener gran cantidad de clulas de un microorganismo concreto, se utilizan matraces o tubos que se incuban en agitacin. -los medios de cultivo slido se consiguen aadiendo antes de la esterilizacin agar como agente solidificante. El medio, estril, fundido a T>45C, se reparte en placas de Petri (circulares con tapa no hermtica). Esto permite inmovilizar las clulas permitindoles crecer y formar masas visibles, las colonias. Generalmente se utiliza para conseguir aislar colonias.

Cultivo in vitro
El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estriles, de semillas, rganos, explantos, tejidos, clulas y protoplastos de plantas. En el cultivo in vitro se controlan y optimizan los factores fsicos (luz, T y humedad), nutricionales y hormonales, y se excluyen todos los microorganismos y plagas que puedan afectar a la planta.

Planta de chopo de 3 meses de edad cultivada in vitro

Desoxirribonucletidos trifosfato (dNTPs)

Unidades fundamentales del ADN formadas por tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5 de un azcar desoxirribosa y una base nitrgenada (adenina (A), tionina (T), citosina (C) y guanina (G)).

Electroforesis de ADN
Tcnica separativa utilizada para resolver fragmentos de ADN de distinto tamao en funcin de la carga elctrica. La separacin electrofortica se lleva a cabo sobre matrices semislidas, generalmente de agarosa o de poliacrilamida (slo para molculas de ADN de tamao menor a 100,000 pb). El ADN tiene una carga elctrica neta negativa debido fundamentalmente a los grupos fosfato que contiene, de manera que, al someterlo un campo elctrico, se desplazar hacia el polo positivo (nodo). En principio las molculas de una mezcla de ADN se movern a una velocidad proporcional a su tamao. Las molculas de ADN mas pequeas se mueven mas rpido a travs de los poros de la matriz y son las que migran mas lejos.

Enzimas de restriccin
Fueron descubiertas en los aos 60 por Werner Arber y Hamilton D. Smith como mecanismo de proteccin de las bacterias contra los virus bacterianos (bacterifagos). Las bacterias cortan el ADN (digestin del ADN) del virus exgeno con enzimas, las denominadas endonucleasas de restriccin (enzimas de restriccin). El ADN propio de las bacterias, en cambio, est protegido por grupos metilo (-CH3) adicionales, que bloquean su accin. En 1970 Herbert W. Boyer, descubri que estas enzimas no cortan arbitrariamente el ADN, sino slo exactamente en determinadas pares de bases. Cada tipo de enzima es capaz de reconocer y cortar una secuencia especifica de ADN, generando extremos de ADN romos (p. ej.: SmaI) o cohesivos (p. ej.: EcoRI). Hoy se conocen ms de 1200 enzimas de restriccin. Sin embargo, slo algunas de ellas son interesantes para la ingeniera gentica. Los fragmentos de ADN obtenidos por una de estas enzimas pueden ser unidos entre si por enzimas de ligacin. SmaI 5 C C C G G G 3 3 G G G C C C 5 EcoRI 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5

Extremos complementarios de ADN

Extremos escalonados o cohesivos de una molcula de ADN que son producidos por una enzima de restriccin, y que presentan afinidad especfica entre s.

Fenotipado:
Definir el fenotipo de un organismo

Fenotipo:
Apariencia externa de un organismo; caractersticas visibles de un organismo debidas a la interaccin de su genotipo y el medio ambiente.

Fitotrn
Cmara en la que se puede realizar el cultivo de plantas en condiciones ambientales (luz, T y humedad) estrictamente controladas. El crecimiento de plantas en un fitotrn minimiza el impacto de las variaciones ambientales en el crecimiento de las plantas, reduce la incidencia de contaminaciones por patgenos o plagas, y permite unas condiciones de confinamiento ideales para el crecimiento de plantas en fase de experimentacin.

Fotoperiodo
Duracin de la luz del da o perodo de iluminacin diaria que se suministra durante el crecimiento de las plantas. La duracin de los periodos de iluminacin o de oscuridad regula actividades de las plantas asociadas al crecimiento, desarrollo, formacin de rganos de reserva, floracin y letargo. Las plantas se clasifican segn su respuesta fotoperidica en: Plantas de da corto: aquellas que florecen con periodos de luz inferiores a un cierto valor crtico. Plantas de da largo: aquellas que florecen con periodos de luz superiores a un cierto valor crtico. Plantas neutras: aquellas que florecen con independencia del fotoperiodo.

Gel de agarosa
Matriz semislida formada por polmeros derivados de carbohidratos que se utiliza como soporte para la separacin mediante electroforesis de fragmentos de cidos nucleicos o protenas. La agarosa es un compuesto soluble en agua a temperaturas superiores a los 60C y solidifica posteriormente por debajo de los 45C.

Gen
Un gen es una secuencia ordenada de nucletidos en la molcula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la informacin necesaria para la sntesis de una macromolcula con funcin celular, que puede ser una protena (a partir de ARN mensajero), ARN ribosmico o ARN de transferencia. El gen es considerado como la unidad de almacenamiento de informacin gentica y unidad de herencia al transmitir esa informacin a la descendencia. El conjunto de genes de una especie se denomina genoma.

Genoma
Material gentico correspondiente a la dotacin cromosmica completa de una especie.

Hospedador
Organismo que alberga a otro organismo o a un vector de clonacin.

Inocular:
Introducir un patgeno o sus partes en una planta husped o un rgano de la planta.

Inculo:
Un patgeno o sus partes capaces que pueden causar infeccin cuando son transferidos a un sitio favorable.

Ligacin y clonaje
Proceso de Ligacin.- Se inserta o pega el gen (fragmento obtenido en la PCR dentro del vector (normalmente un plsmido) el gen se inserta en un cassete de secuencia conocida que generalmente, concede resistencia a un antibitico . (enzima ligasa) Tras el proceso de polimerizacin amplificacin la ligasa establece puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas complementarias formando enlaces covalentes entre las mismas. Los extremos de ADN podrn ser romos cohesivos.

Reaccin de ligacin: Contiene la enzima de ligacin (ligasa), el tampn adecuado para la actividad enzimtica, el ADN plasmdico obtenido mediante midiprep y el inserto amplificado por PCR. La relacin de cantidades entre ADN plasmdico e inserto en la reaccin depende de sus tamaos. La reaccin suele llevarse a cabo durante una noche en un bao a 16C de temperatura.

Medidor de pH (tambin denominado pH-metro)

Instrumento para medir la acidez o basicidad de una solucin acuosa. El pH-metro tpico consta de una sonda sensor o electrodo conectado a un medidor electrnico que procesa y muestra la lectura de pH. La mayora de las sondas de pH se fabrican en vidrio. El diseo de la sonda se basa en un tubo hueco a modo de celda en cuyo interior hay un electrodo inmerso en una solucin tampn referencia (0.1 mol/L KCl a pH 7). La parte exterior de la sonda tambin llamada bulbo esta hecha en un slice poroso muy fino (SiO2) donde se aloja un segundo electrodo expuesto a la solucin a valorar. Cuando los dos electrodos estn conectados con un medidor de pH, la diferencia de voltaje se amplifica permitiendo la lectura el pH de la muestra. La precisin de un pH-metro depende en gran medida de la calibracin previa al uso, es por ello que se recomienda que se calibre diariamente usando al menos tres soluciones tampn de referencia (pH 4, pH 7 y pH 10 suelen ser los recomendados). El proceso de calibrado corrobora el voltaje producido por la sonda (aproximadamente 0.06 voltios por unidad pH) con la escala pH de la solucin tampn standard.

Medio de cultivo
Son soluciones estriles con todos los nutrientes necesarios para cultivar microorganismos en el laboratorio. A menudo los medios estn tamponados para que el pH sea el ptimo.
Lo medios de cultivos se clasifican segn su composicin en: -medios de cultivo definido- se conoce la composicin exacta de todos su nutrientes. -medios de cultivo complejos- incluye en su composicin un hidrolizado del que se desconoce su composicin qumica exacta como peptonas (hidrolizado de carne), extracto de levadurasetc. Adems se pueden disear medios de cultivos especficos para seleccionar o enriquecer un microorganismo concreto.

Medio de des-diferenciacin de clulas

Es un medio que promueve la desdiferenciacin es decir, la prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. Los medios de induccin de callo se encontraran dentro de este tipo de medios.

Medio de induccin de callo

Medio que se emplea para la induccin de la formacin de callos a partir de explantes. Se trata de un medio nutritivo al que adems se aaden citoquininas y auxinas, como reguladores del crecimiento, con el fin de promover la divisin celular y obtener clulas con elevada capacidad regenerativa.

Micropropagacin
Micropropagacin es el conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente de forma rpida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagacin se utiliza para multiplicar o propagar plantas idnticas a una planta madre, que puede haber sido obtenida por transformacin, mutagnesis o mejora gentica. La micropropagacion se utiliza tambin para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

En la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada (llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genticamente idnticas, denominadas clones. El explanto ms usado para los procesos de propagacin in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Dentro del proceso de micropropagacin se pueden diferenciar varias fases o etapas: 1. Preparacin de la planta madre. 2. Desinfeccin de explantos. 3. Cultivo in vitro del material seleccionado. 4. Multiplicacin de brotes 5. Enraizamiento 6. Aclimatacin

Miniprep
Consiste en el proceso de extraccin y purificacin de ADN plasmdico (plsmido). Muchos mtodos han sido desarrollados para purificar los plsmidos de bacterias, pero en todos ellos se pueden diferenciar tres pasos comunes: 1.- Crecimiento en medio selectivo (p. ej.: en presencia del antibitico adecuado) del cultivo bacteriano. Las condiciones de crecimiento pueden variar dependiendo de la capacidad de replicacin del plsmido.

2.- Concentracin y lisado de las bacterias. Las bacterias son recogidas y concentradas por centrifugacin. Para poder lisarlas se usan mltiples mtodos, incluyendo tratamientos con detergentes, disolventes orgnicos, choque osmtico o trmico.
3.- Purificacin del plsmido. Son muy variados los mtodos empleados en el laboratorio. Lo que se pretende es poder obtener una gran cantidad de alta calidad de la estructura intacta del plsmido.

Patgeno
Que produce enfermedad, del griego (pathos), "enfermedad, y (gens) , "productor de". Es un agente infeccioso que produce un dao, la enfermedad, en el husped (planta o animal).

PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa: Mtodo para amplificar in vitro un segmento especfico de ADN que utiliza dos cebadores que hibridan en los dos extremos del segmento con polaridad opuesta, y que sirven como punto de inicio para la replicacin exponencial mediante ciclos sucesivos de la secuencia que se encuentra entre ellos. http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

pH
Forma de expresar la acidez y basicidad de disoluciones acuosas. Se define como el logaritmo negativo de la concentracin (moles/L) de ion H+ (H3O+): pH=log1/H3O+ o pH=-log[H3O+]

El agua destilada presenta un pH 7 o neutro a 25C. Soluciones con pH menores de 7 se denominan cidas, y soluciones con pH mayores a 7 se denominan bsicas.

Protena
Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms verstiles y ms diversas, realizando una enorme cantidad de funciones diferentes. Las protenas de todos los seres vivos estn determinadas mayoritariamente por su gentica (con excepcin de algunos pptidos antimicrobianos de sntesis no ribosomal). Las protenas son largas cadenas de aminocidos unidas por enlaces peptdicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminocido adyacentes. La secuencia de aminocidos en una protena est codificada en su gen mediante el cdigo gentico. Los residuos en una protena sufren a veces modificaciones qumicas en la modificacin postraduccional: antes de que la protena sea funcional en la clula, o como parte de mecanismos de control. Las protenas pueden tambin asociarse para formar complejos proteicos estables. Las protenas se sintetizan dependiendo de cmo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a seales o factores externos. El conjunto de las protenas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.

Regulacin transcripcional de un gen

Las clulas necesitan regular los tipos y cantidades de macromolculas que generan, el primer nivel de regulacin es en la expresin gnica, es decir el control de la transcripcin o la cantidad de ARNm que se produce de ciertos genes. Hay protenas y molculas que siempre son necesarias en la clula (expresin constitutiva) sin embargo, la mayora slo se requieren en momentos puntuales de su desarrollo. El control de la transcripcin se hace a travs de protenas que se unen al DNA. El control negativo se hace a travs de protenas represoras que impiden la unin de la RNA-polimerasa. Por el contrario, el control positivo lo llevarn a cabo protenas que se unen al DNA y activan la transcripcin

Resistente (frente a patgenos)

Es el organismo que expresa resistencia, que es capaz de evitar o reducir el ataque de agentes infecciosos causantes de enfermedad. En contraposicin con el organismo susceptible, el resistente presenta menor acumulacin del patgeno en su organismo que se manifiesta con frecuencia en una apariencia sana sin sntomas de enfermedad. As mismo, el trmino tolerante describe al organismo que muestra una apariencia normal o con menores sntomas de enfermedad, an presentando una acumulacin elevada del patgeno.
La resistencia puede deberse a la existencia de barreras preexistentes o a mecanismos inducibles. Entre los mecanismos inducibles se distinguen: Defensa inducible por PAMPS (PTI, PAMP triggered immunity), debido al reconocimiento por parte de un receptor presente en la membrana del hospedador de un patrn molecular asociado al patgeneno (PAMP). Defensa inducible por efectores (ETI, effector triggered immunity), debido al reconocimiento por parte de una protena de resistencia del hospedador de un efector, una factor producido por el patgeno para alterar el metabolismo de la clula hospedadora.

Sntomas de enfermedad
Los sntomas de la enfermedad son el conjunto de manifestaciones externas o internas del husped diferentes del estado normal que estn asociadas generalmente al desarrollo de una enfermedad.
La palabra sntoma proviene del griego , "accidente, infortunio, aquello que ocurre. Suelen ser caractersticos de cada tipo de agente patgeno. Se utilizan con frecuencia para la identificacin del agente responsable de la enfermedad <1 >. Tienen la contrapartida de que la percepcin de un sntoma es frecuentemente es subjetiva y difcilmente mesurable.

Ejemplos de sntomas asociados a enfermedades de plantas son:

Clorosis o amarilleamiento de partes de la planta por destruccin de la clorofila Marchitez o falta de frescura y/o inclinacin de las hojas por carencia de agua. Necrosis o muerte del tejido de la planta Podredumbre o destruccin hmeda del tejido vegetal
<1> http://extension.oregonstate.edu/catalog/pdf/ec/ec1562-s-e.pdf

Susceptible (frente a patgenos).

Es el organismo que est en riesgo de ser infectado por un agente infeccioso. En contraposicin con el organismo resistente, el susceptible cuando es infectado presenta una mayor acumulacin del patgeno en su organismo, que se manifiesta habitualmente con la presencia de unos sntomas asociados a la enfermedad. La susceptibilidad puede ser debida a que el hospedador no dispone de barreras o mecanismos de resistencia contra el agente patgeno o a que el agente patgeno produce una serie de factores (efectores) que alteran el metabolismo de la clula hospedadora suprimiendo la resistencia.

Tampn
Solucin que previene el cambio de pH tras la adicin de pequeas cantidades de cidos o bases. Est compuesto por un cido dbil y su correspondiente sal con una base fuerte, o por una base dbil y su correspondiente sal con un cido fuerte.

Traduccin gentica
La traduccin es el segundo proceso de la sntesis proteica (el primer proceso es la expresin gnica). La traduccin ocurre en el citoplasma de la clula, donde se encuentran los ribosomas. Los ribosomas estn formados por una subunidad pequea y una grande que rodean al ARNm. En la traduccin, el ARN mensajero se decodifica para producir un polipptido especfico de acuerdo con las reglas especificadas por el cdigo gentico. Es el proceso que convierte una secuencia de ARNm en una cadena de aminocidos para formar una protena. Es necesario que la traduccin venga precedida de un proceso de transcripcin. El proceso de traduccin tiene cuatro fases: activacin, iniciacin, elongacin y terminacin (entre todos describen el crecimiento de la cadena de aminocidos, o polipptido, que es el producto de la traduccin). Programas on-line para la traduccin de secuencias: http://web.expasy.org/translate/

Transformacin
La transformacin refiere a un cambio gentico estable producido al transferir ADN exgeno a una clula. Un cierto nmero de mecanismos estn disponibles para transferir ADN a clulas vegetales: 1. La transformacin mediada por Agrobacterium, es la ms simple transformacin vegetal. El tejido vegetal (generalmente hojas) es cortado en pequeos pedazos, ej. 10x10 mm, y sumergidos por 10 minutos en una solucin que contiene Agrobacterium. Algunas clulas adyacentes al corte sern transformadas por la bacteria, que transfiere su ADN a la clula. Estas clulas son regeneradas in vitro en medio selectivo. Algunas especies pueden ser transformadas tan slo al sumergir las flores en la suspensin de Agrobacterium, y luego sembrar las semillas en un medio selectivo. 2. Biobalstica: Pequeas partculas de oro o tungsteno cubiertas de ADN, que se disparan a clulas vegetales jvenes o embriones vegetales. La eficiencia de transformacin es ms baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayora de las plantas pueden ser transformadas con este mtodo. 3. Electroporacin: Crea agujeros momentneos en la membrana celular utilizando golpes elctricos, lo que permite que el ADN entre a la clula.