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Serumenzyme

Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

Enzyme - Eigenschaften
Die Bestimmung von Enzymaktivitten in Serum, Plasma oder Harn hat fr die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen. Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt z.B. ALAT (GPT) 100 g/ Liter (Gesamteiwei 60-80 g/l) Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren kommen in hheren Konzentrationen vor. Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

Enzyme - Eigenschaften
Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivitt im Blut. Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drsen z.B. Pankreasamylase, -lipase zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivitt im Blut. Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivitt im Blut.

Enzyme - Eigenschaften
Von der im Serum enthaltenen Aktivitt eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird z.B. CHE -, kann auf eine Schdigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivitt im Blut sinkt. Von der im Serum enthaltenen Aktivitt eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird z.B. CK -, kann auf eine Schdigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivitt im Blut steigt.

Enzyme - Eigenschaften
Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor das heit, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor z.B. Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen. LDH-1 kommt berwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor. Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

Serumenzyme Diagnostisches Ntzen


Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgnge im Krper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des Anoder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhltnis von Enzymen zueinander, gibt zustzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie. Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden mssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.

Enzyme Messung der Aktivitt


Die Internationale Union fr Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen fr die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitten erarbeitet. Die Bedingungen fr diese optimierten Methoden sind: Optimaler pH-Wert Definierte Temperatur d.h. 37 C Optimale Substratkonzentration Optimale Coenzymkonzentration Optimale Konzentration an Aktivatoren

Enzyme Messung der Aktivitt

Enzymaktivitt wird in Einheiten/l (U/l) angegeben. 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivitt, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 mol Substrat katalysiert. (Dies wird fr Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen). Die Messtemperatur ist 37 C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur fr 25 C vorhanden!)

Enzyme - Nomenklatur
Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im Enzyme Nomenclature [1972] sowie dem Enzyme Handbook und seinen Supplements (Springer-Verlag). Die EC-Nummer hat 4 Komponente: Stelle 1 definiert die Funktion z.B. 1 = Oxidoreduktasen Stelle 2 definiert die Donorgruppe z.B. 1 = CH-OH Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe z.B. 1 = NAD(P) Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe. Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

Enzyme - Nomenklatur
Die Hauptgruppen von Enzymen sind: 1.x.x.x Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3, LDH: EC 1.1.1.27) 2.x.x.x Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2, ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2) 3.x.x.x Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase: EC 3.1.3.1, -Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3) 4.x.x.x Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1) 5.x.x.x Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase: EC 5.3.1.9) 6.x.x.x Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoffcarboxylase: EC 6.3.4.6)

Enzyme Messung der Aktivitt


In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt fr das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdnnungen und Umrechnung der Ergebnisse. Es gibt verschiedene Messmglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

Enzyme Berechnung der Aktivitt Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten -


Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung: c = (E / [ mol * d]) c = Konzentration der Substanz E = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)H d = Schichtdicke der Kuvette in cm mol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

Enzyme Berechnung der Aktivitt


Die Enzymaktivitt entspricht der nderung der Konzentration von Substrat oder Produkt whrend der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivittsbestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche /Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir: Volumenaktivitt = c / t = E / (t* mol *d) mol/min * ml Messlsung c = nderung der Konzentration von Substrat oder Produkt t = Messzeit in Minuten

Enzyme Berechnung der Aktivitt


Ein Substratumsatz von 1 mol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlsung und das Probenvolumen zu bercksichtigen. Volumenaktivitt = E * V/ (t* mol *d * v) U/ml V = Volumen der Messlsung v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren. Wird verdnntes Material eingesetzt, muss dies auch bercksichtigt werden.

Serumenzyme - Herkunft
Sekretionsenzyme Cholinesterasen Reaktion: Acylcholin + H2O Cholin + R.COOH Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. Die Bestimmung von AChE hat im Gegensatz zur CHE so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum betrgt ca. 10 Tage.

Cholinesterase diagnostisches Nutzen


Aktivittsnderungen bei der Cholinesterase: Erhhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frhform der alkoholischen Leberschdigung), funktionelle Hyperbilirubinmie, Hypertriglyceridmie, Adipositas, Diabetes mellitus. Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikmie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anmien)

Weitere Serumenzyme Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung


Andere Enzyme mit Aktivitt im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehren u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die berwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die whrend des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivitt im Form von globalen Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: 70-130%).

Serumenzyme als Globalteste in der Gerinnung


Andere Globalteste (mit hnlichen Abkrzungen!) sind: Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte partielle Thromboplastinzeit [aPTT] Prft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMWKininogen durch den Zusatz von Oberflchenaktivatoren, wie Kaolin. Plasma Thrombinzeit [PTZ] Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prfen.

Enzyme Messung der Aktivitt Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode


Die Bestimmung der LDH-Aktivitt im Serum. Reaktion: Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+ Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im Spektralphotometer. Als Substrat dient Lactat. Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im berschuss haben und einen anderen pHWert einstellen. NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form NADH NAD reduzierte Form

Enzyme Messung der Aktivitt Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion


Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum ASAT Aspartat-Amino-Transferase GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

Reaktion: Enzym ASAT/GOT L-Aspartat + -Oxoglutarat L-Glutamat + Oxalacetat Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase Oxalacetat + NADH + H+ Malat NAD+

Messprinzip Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

Enzyme Messung der Aktivitt Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfsund Indikatorreaktion
Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum:
Reaktion: Enzym Creatinkinase Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase ATP + D-Glucose ADP + D-Glucose-6-Phosphat Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase G-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

IFCC Methode Creatin Kinase


Messbedingungen fr die CK Temperatur: 37,0 C 0,1 C Wellenlnge: 339 nm 1 nm Bandbreite: 2 nm Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm 0,01 mm Inkubationszeit: 180 s Verzgerungszeit: 120 s Messinterval: 120 s Anzahl der Messpunkte: mindestens 6

Enzyme Messung der Aktivitt


Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes
Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:
Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP) pNP + PO4 pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10 Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH 9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm) Kontinuierliche (kinetische) Messung Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 bentigt EDTA- bzw. Citratplasma knnen, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

Enzyme - Diagnostik
GPT / ALAT Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt GPT ist berwiegend im Zytoplasma der Leberparenchymzellen zu finden. Wichtigster Leberzellnekroseparameter in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und Skelettmuskulatur Strungen Stark lipmische Seren knnen nicht analysiert werden. Referenzbereiche: (37 C) m: <41; f: <31 U/l

Enzyme - Diagnostik
GOT / ASAT Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt GOT ist berwiegend in der Leber sowie im Herz- und Skelettmuskulatur zu finden in kleinen Mengen auch im Gehirn Wichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung mit der GPT Hinweis auf die Schwere der Leberzellschdigung. Erhhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und Muskeldystrophie. Strungen Stark lipmische Seren knnen nicht analysiert werden. Referenzbereiche: (37 C) m: <38; f: <32 U/l

Enzyme - Diagnostik
Laktatdehydrogenase - LDH LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die hchste Aktivitt in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet Aufgrund der fehlenden Organspezifitt eignet sich die Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter. LDH-1 als Sptindikator fr einen Herzinfarkt LDH erhht bei: hmolytische Anmien, Lungenembolie Skelettmuskelerkrankungen Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis, akute Parenchymzellschdigung durch Intoxicationen Strungen Hmolytische Seren knnen nicht analysiert werden. IFCC Referenzmethode (37 C) - m: <225; f: <215 U/l

Enzyme - Diagnostik
Glutamatdehydrogenase - GLDH Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH ausschlielich intramitochondrial in Leber vorkommt. Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine schwere Leberschdigung hin, insbesondere der zentroazinren Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber. Reaktion: -Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD+ + H2O Referenzbereiche: (37 C) m: <6,4; f: <3,8 U/l

Enzyme - Diagnostik
Gamma-Glutamyltransferase GT GT findet sich in der Leber berwiegend in den kanalikulren Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege. GT ist ein Leberzellnekrose- und Cholestaseparameter Reaktion: -Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin Glutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm) Referenzbereiche: (37 C) m: <49; f: <32 U/l

Enzyme - Diagnostik
Alkalische Phosphatase - AP Cholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit erhhter Osteoblastenaktivitt Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die Aktivitt im Normalserum ist hauptschlich auf das Leberund Knochenisoenzym zurckzufhren. Strungen nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht Citrat und EDTA verwenden. Referenzbereiche: (37 C) m: <270; f: <240 U/l. Kinder in Wachstumsalter haben hhere Werte (Knochenbau)

Enzyme - Diagnostik
Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an. erhhte gesamt AP kommt auch bei andere Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhhter Osteoblastenaktivitt, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren. -GT Erhhungen im Serum sind bei etwa 95% aller Flle durch eine hepatobiliren Erkrankung zustande gekommen. -GT ist ein guter Marker fr Alkoholabusus Mig erhhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven Hepatitis, primr bilire Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.

Bedeutung von Quotientenbildung


De-Ritis Quotient = GOT/GPT - akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1 - nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1 Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Mastab fr den Schweregrad der Hepatozytenschdigung. - < 20 bei schwerer Schdigung - 20 50 bei miger Schdigung

Bedeutung von Quotientenbildung


Beispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-A Typischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf Wochen AST/ALT 25 C 37 C 1 3 5 7

0,54 / 0,49 0,54 / 0,49

0,28 / 0,28 0,28 / 0,28 107 / 109 160 / 164

0,31 / 0,36 0,31 / 0,36 49 / 200 74 / 300

0,65 / 0,31 0,66 / 0,31 38 / 88 57 / 132

(AST +ALT)/ 116 / 93 GLDH 174 / 140

Enzyme - Diagnostik
Creatinkinase - CK CK kommt in hoher Aktivitt in der Skelettmuskulatur, im Herzmuskel und im Gehirn 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp) und CK-BB (Gehirntyp) Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis, progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen) Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis Referenzbereiche: (37 C) m: <170; f: <145 U/l

Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt


CK-MB erreicht im Myokard ihre hchste Konzentration Obwohl CK-MB nicht vollstndig kardiospezifisch ist, wird sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker fr den akuten Herzinfarkt eingesetzt. Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da standardisiert Cardiac-Troponin-I Troponin-C ist nicht spezifisch genug fr die Herzinfarktdiagnostik. CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem Infarkt. Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH) nach 6-12 h;

Serumenzyme Referenzbereiche fr gesunde Erwachsene 37 C


-GT M: < 50 U/l; F: < 32 U/L (IFCC) AP M: 40-120 U/l; F: 30-90 U/L GPT M: < 40 U/L; F: < 33 U/L (IFCC mit P-5-P) GOT M: < 43 U/L; F: < 36 U/L (IFCC mit P-5-P) CK M: 24-207 U/L; F: 24-170 U/L (IFCC) CK-MB M: < 18 U/L; F: < 18 U/L GLDH M: < 6,7 U/L; F: < 4,8 U/L LDH M: 135-225 U/L; F: 135-215 U/L (IFCC) LDH-1 (HBDH) M: < 171 U/L; F: < 202 U/L
(Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)