Virologia

Anbal Campos | Gil Rocha | Pedro Milheiro

Introduo

Objetivo do estudo
Investigar o impacto das estirpes de rotavrus A na populao Paquistanesa com menos de 5 anos de idade Identificar a relao filogentica das estirpes circulantes no Paquisto com aquelas identificadas noutros pases a nvel mundial; Fornecer informao fivel e atual que as autoridades possam usar como guia para planear estratgias com vista a melhorar as condies de sade publica.

Material e Mtodos

Objectivo?

Deteo dos antignios especficos do RVA; (VP6)

Kit IDEIA
SUSPENSO FECAL (10%) adicionada aos MICROPOOS do kit que esto REVESTIDOS com ANTICORPOS POLICLONAIS;

Adio de anticorpos ESPECFICOS para o RV CONJUGADOS COM UMA ENZIMA;

Incubao durante 60 minutos T ambiente;

lavagem
Adio de um substrato da enzima (cromognio);

Imagem ilustrativa de um imunoensaio do tipo sandwich;

Anlise dos resultados: ELISA plate reader a 450 nm

Extrao do RNA
QIAamp Spin Procedure Sample QIAamp V acuum Procedure Sample

Inativa RNAses

as

L yse

Bind
Vacuum

1. 560 ul de soluo AVL + 140 ul de suspeno fecal (10%); 2. Adicionar 560 ul de etanol;

Wash (Buffer AW1)

Vacuum

Figura 3 -Coluna QIAamp spin dentro de um tubo de microcentrifuga

Wash (Buffer AW2)

Vacuum

Figura 1 ligao de molculas de cido nucleico ao gel de slica

Elute

Pure viral nucleic acid

Figua 2 Procedimento do QIAamp RNA Viral por centrifugao e vcuo

Tampo AVEgua sem RNAses que contem 0,04% de azida de sdio;

RT-PCR amplificao dos genes VP4

e VP7
30 ciclos de amplificao

45C 30 min

95C 3 min

42C 2 min

72C 2 min

Formao do dsDNA

Desnaturao do DNA

Annealing Ligao dos primers

Extenso

Primers RT-PCR

Adaptado de Gouvea, V., Glass, R.I., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H.F., Forrester, B., Fang, Z.Y., 1990. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 28, 276282.

Esquematizao da posio e direo de amplificao dos primers con2 e con3. Adaptado de

Gouvea, V., Santos, N., Timenetsky Mdo, C., 1994a. Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. J. Clin. Microbiol. 32, 13381340. Adaptado de Gouvea, V., Santos, N., Timenetsky Mdo, C., 1994a. Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. J. Clin. Microbiol. 32, 13381340.

As AMOSTRAS NEGATIVAS aos PRIMERS Beg9 e End9 foram enviadas para a Belgica;

Amplificadas com outros primers

Adaptado de Gomara, M.I., Cubitt, D., Desselberger, U., Gray, J., 2001. Amino acid substitution within the VP7 protein of G2 rotavirus strains associated with failure to serotype. J. Clin. Microbiol. 39, 37963798.

Beg9deg End9deg VP7F VP7R

Genotipagem por multiplex PCR

O Multiplex PCR uma variante do PCR, onde 2 ou mais sequncias de bases (loci) so amplificadas ao mesmo tempo na mesma reao Distino entre os diferentes gentipos G e os gentipos P

Adaptado de Gouvea, V., Glass, R.I., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H.F., Forrester, B., Fang, Z.Y., 1990. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 28,

Primers especficos para o gentipo G

Adaptado de Gouvea, V., Glass, R.I., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H.F., Forrester, B., Fang, Z.Y., 1990. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 28, 276282

Primers especficos para o gentipo P

Adaptado de Gouvea, V., Santos, N., Timenetsky Mdo, C., 1994a. Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. J. Clin. Microbiol. 32, 13381340.

Resultados
Total de 311 amostras
ELISA

Prevalncia de infees segundo a idade (meses)

5, 7% 4, 5% 3, 4%
RTPCR

0a5 6 a 10 19, 26%

105 positivos 74 positivos para RVA 23.8%

11 a 15
16 a 20 21 a 25

9, 12%

4, 6%

21, 28%
9, 12%

26 a 30 31 a 35 36 a 40

Resultados
Sintomas:
Vomitos (2- Diarreia (43 dias) 5 dias) Associao frequente com febre

Gentipos circulantes

Combinaes mais frequentes: G1P[8] G2P[4] G9P[8] ou P[6] G1P[6] G12P[6] 6.7% 24.3% 24.3% 16.2% 12.1%

Infees combinadas: 5 casos G2 e G9 G1 e G2 6.7% 5.4% 1.3%

Casos sem gentipo 3 casos 4.0%

Filogenia das VP7

Filogenia das VP4

Discusso de Resultados
Este estudo relata a enorme diversidade gentica das estirpes humanas de RVA em co circulao

23.8%
RVA em casos de gastroenterite

a maioria dos pacientes includos neste estudo (Rawalpindi) apresentavam uma gastroenterite num estado avanado e estavam severamente desidratados Sintoma Comum da Gastroenterite por RVA a maior prevalncia de outros agentes patognicos de gastroenterite no perodo de amostragem do estudo anterior

Discusso de Resultados

30 25 20 15 10 5
Fig. 4 Comparao

Karachi, 2005-2007 Rawalpindi , 2010

dos gentipos detetados em Karachi, 2005-2007, e em Rawalpindi, 2010.

Discusso de Resultados

Heterogeneidade
presena global persistente circulao e co-existncia de mltiplas linhagens G1

Discusso de Resultados

Fcil Disseminao

Discusso de Resultados

Discusso de Resultados
S recentemente emergiu como um importante patogneo

humano

Discusso de Resultados

Discusso Discusso de de Resultados Resultados

Concluso