TEMA 9. Técnicas Luminiscentes.

Curso acadmico: 2012/13
Asignatura: ANLISIS QUMICO Grado: Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
CONTENIDOS
1. Introduccin
Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia Caractersticas analticas
1. 2. 3.
Teora de la Fluorescencia y Fosforescencia Tipo de espectros Variables que afectan a la Fluorescencia

Fluorescencia y estructura Fluorescencia y entorno qumico Fluorescencia y concentracin
1. 2.
Instrumentacin Aplicaciones al anlisis de alimentos
1. Introduccin
Mtodos luminiscentes moleculares

Basados en la emisin de radiacin electromagntica por molculas que previamente han sido excitadas. Cada especie A emite radiaciones de caractersticas Anlisis cualitativo La intensidad de la radiacin IF es proporcional a la [A] Anlisis Espectr Anlisis cuantitativo cualitativo
A + h
A*
o de emisi n
Anlisis Cuantitativo
Absorcin de fotones (h )
Reaccin qumica
Fluorescen cia
Fosforescenci a
Quimioluminiscen cia
1. Introduccin
La fluorescencia es un fenmeno que fue conocido en Excitaci Emisin el siglo XIX por Stoke: observ n Luz Luz fluorescencia en el mineral de mayor UV Fig. 1 fluorita . El agua tnica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del rbol de la quina, y tiene propiedades antipirticas, analgsicas y contra la malaria. La quinina es una sustancia fluorescente Agua tnica
Bajo luz del sol
Fig. 2
Bajo luz ultravioleta
1. Introduccin
Caractersticas analticas Sensibilidad (ppb) Gran intervalo lineal Caractersticas Selectividad Menor aplicabilidad que los mtodos de absorcin Mayor interferencia ambiental
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2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia
A + hexcitacin hemisin
A*
A+
E1 hexcitaci E0
n
hexcitacin hemisin excitacin emisin
hemisi
n
Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.

Estado electrnico molecular singlete: los espines de los eestn apareados
Estado singlete fundamen tal Estado singlete excitado Estado triplete excitado
Estado electrnico molecular triplete: los espines de los eestn desapareados

6
Fluorescen cia
Fosforescenci a
Diagrama parcial de energa para un sistema Estados fotoluminiscente Estados singletes

S2
excitados Relajaci Conversi n n vibracion interna al
tripletes excitados
Cruce entre sistemas S1 T1
Energi a
Absorci n excitac in
S0
Fluoresce ncia
Conversi n interna
Fosforescenc ia
Estado fundamental
Relajaci n vibracion al
Velocidad de absorcin y de emisin La velocidad a la que un fotn de radiacin es

absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s La emisin fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente ms lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso de excitacin La emisin fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ms.
El camino el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado Estado excitado RELAJACIN VIBRACIONAL: no radiante CONVERSIN INTERNA: no radiante CONVERSIN EXTERNA: no radiante CRUZAMIENTO radiante FLUORESCENCIA: emisin de un fotn de radiacin ENTRE SISTEMAS: no FOSFORESCENCIA: emisin de un fotn de radiacin
Procesos de msdesactivacin probable hacia
Estado fundamental La fotoluminiscencia slo la presentan un nmero relativamente pequeo de sistemas con caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de
3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia
Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia y fosforescencia Fenantreno Espectro de excitacin: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la emisin y variando la excitacin Espectro de emisin : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la excitacin y variando la emisin. Los anlisis se efectan
Excitaci n
Emisin Fluorescen te
Emisin Fosforesce 10 nte
Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia
Cada uno es una imagen especular del otro. Las emisin son mayores que excitacin
11
Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia
Antraceno a) espectro excitacin b) espectro fluorescente

Cada uno es una imagen especular del otro
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
Estructura qumica
Entorno qumico
Sustancia fluorescente
Intensidad de emisin fluorescente
13
= n molculas que emiten fluorescencia/n total de molculas excitadas = n fotones emitidos/n fotones absorbidos
Rendimiento cuntico de fluorescencia:
= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd
K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivacin posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversin externa (Kce), conversin interna (Kci), predisociacin (Kpd) y disociacin (Kd ).
Rendimiento cuntico y tipo bajos de Las variables que conducen a valores altos de K y valores F KF, Kpd, Kd Estructura qumica transicin: del resto de velocidades exaltan la fluorescencia La eficacia cuntica es mayor para las Kces, Kce, Kci Entorno qumico transiciones -*
14
Pueden presentar fluorescencia: Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados. Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas La fluorescencia ms intensa es la que presentan los Fenantreno compuestos que contienen grupos funcionales aromticos Latransiciones mayora de con los * de baja energa Antraceno hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin. Fig. 1 Fig. 2 La eficacia cuntica normalmente aumenta con el 15 nmero de anillos y con su
Fluorescencia y estructura
Fluorescencia y estructura
Heterociclos sencillos no fluorescentes Fusionados con anillos bencnicos s presentan fluroescencia
N O
Furano
S
Tiofeno
H N
Pirrol
Piridina
H N
Quinoleina
Isoquinoleina
Indol
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Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes La sustitucin en el anillo bencnico produce:
Desplazamientos de la de los mximos de excitacin y emisin Un aumento o disminucin de la intensidad de fluorescencia segn el sustituyente Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno
Compuesto Benceno Tolueno Propilbenceno Fluorobenceno Clorobenceno Bromobenceno Iodobenceno Fenol In fenolato Anisol Anilina In anilinio cido benzico Benzonitrilo Nitrobenceno Frmula C6H6 C6H5CH3 C6H5C3H7 C6H5F C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5OH C6H5O C6H5OCH3 C6H5NH2 + C6H5NH3 C6H5COOH C6H5CN C6H5NO2 Longitud de onda de la fluorescencia, nm 270-310 270-320 270-320 270-320 275-345 290-380 285-365 310-400 285-345 310-405 310-390 280-360 Intensidad relativa de la fluorescencia 10 17 17 10 7 5 0 18 10 20 20 0 3 20 0
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s electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazndola a mayores .
Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes
s electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y NO 2, reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transicin n- Los halgenos producen efecto de tomo pesado interno
Los grupos sulfnicos no modifican significativamente la fluorescencia
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Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural
Fluoreno
C HH
Bifenilo
= = 0,2 1 La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. La emisin fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie slida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorcin
La influencia de la rigidez tambin explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando forman complejos con iones metlicos. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8hidroxiquinolena es mucho menor que la de su complejo de zinc 19
Fluorescencia y entorno qumico Disolvente

La fluorescencia de una molcula disminuye en presencia de disolventes que contengan tomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo
Temperatura
Un aumento de temperatura provoca disminucin de I F
IF
Temperatura C
20
pH
Fluorescencia y entorno qumico

H H N: H+ H N H H + N
HHH N+
Influye en la fluorescencia de compuestos aromticos con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo.
Anilina If = 20
In anilinio IF = 0
Oxgeno disuelto
Reduce la intensidad de fluorescencia de una disolucin
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es La intensidad de emisin fluorescente (IF) proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentracin de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolucin es pequea a las longitudes de onda de excitacin y de emisin .
Anlisis cuantitativo
Fluorescencia y concentracin
IF = k P0 c Relacin entre la intensidad de fluorescencia y la IF = K c

concentracin Anlisis de trazas
Al aumentar P0 aumenta IF
Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c

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5. Instrumentacin
Fuente de radiacin
Esquema de un espectrofluormetro
Monocromador de excitacin exc
Una longitud de onda
Cubeta de muestra
Luminiscencia a muchas longitudes de onda
Muchas longitudes de onda
en ngulo recto
Monocromador de emisin
Una longitud de onda
em
Detector
Registrador o PC
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5. Instrumentacin
Fuente de luz
De mayor potencia que las que se utilizan en absorcin. La energa radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente.
Seleccin ex y em
Lmpara de arco de mercurio, Lmpara de arco de xenn, Lseres de N2 o de Ar Filtros: fluormetro Monocromadores : espectrofluormetro
Cubeta s Detectores
Vidrio o cuarzo Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas Tubos fotomultiplicadores.
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6. Aplicaciones
Anlisis cualitativo
Poca aplicacin. la fluorescencia es valiosa en la identificacin de derrames de petroleros.
Anlisis cuantitativo La aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al

anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales Los mtodos fluorescentes son : Aplicables a intervalos de concentracin ms bajos los de absorcin Tienen sensibilidades mayores que los mtodos de absorcin. Tienen una precisin y exactitud menor que las de los de absorcin. 25 Muy selectivos, con una selectividad mayor que los mtodos
6. Aplicaciones
Anlisis cuantitativo
Se han desarrollado mtodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgnicas, orgnicas y bioqumicas.
Determinacin de especies inorgnicas
Los basados en la reaccin del analito con un agente de complejacin para formar un complejo fluorescente.
Se utilizan para cationes

Determinacin de Al (III) El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 g/mL. GAR + Al (III) GAR - Al (III)
Los indirectos, basados en la disminucin de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interaccin del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinacin de oxgeno en disolucin. Determinacin de anin F-, se basa en la desactivacin de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III) GAR - Al (III) + FGAR + 26 Al(III)-F
6. Aplicaciones
Anlisis cuantitativo Determinacin de sustancias orgnicas y El nmero de aplicaciones de los mtodos fluorimtricos a bioqumicas
problemas orgnicos es muy elevado Pueden determinarse por fluorescencia los aminocidos, protenas, coenzimas, vitaminas, cidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, cido antranlico, hidrocarburos policclicos aromticos, cistena, guanina, isoniazida, naftoles, cido saliclico, Tambin muchos agentes medicinales pueden determinarse por triptfano, cido rico y numerosos metabolitos. fluorimetra, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina y dietilamida del cido lisrgico (LSD). La aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales.
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6. Aplicaciones
Aplicaciones al anlisis de alimentos Determinacin de cationes y aniones Determinacin de quinina Determinacin de colorantes Determinacin de pesticidas Determinacin de vitaminas
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CRDITOS DE LAS ILUSTRACIONES PICTURES COPYRIGHTS
-Logo encabezado pginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Direccin web: http://ocw.um.es.. -Pgina 4. Fig. 1. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg. Author: Didier Descouens. -Pgina 4. Fig. 2. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg. Author: User:Splarka from en:wp -Pgina 15, Fig. 1. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1. Author: Calvero. -Pgina 15, Fig. 2. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG.
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Bajo luz ultravioleta

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hexcitacin hemisin excitacin emisin

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excitados Relajaci Conversi n n vibracion interna al

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Antraceno a) espectro excitacin b) espectro fluorescente

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Rendimiento cuntico de fluorescencia:

= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd

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