Universidade Federal do Cear Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular Laboratrio em Bioqumica

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO MOLECULAR (FILTRAO EM GEL)

Prof. Dra. Norma Maria Barros Benevides Leonardo Primo; Antnio Viana; Renata Line; Aline Kelly; Iara Flvia; Stelamaris
Outubro/ 2012

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO MOLECULAR

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Histrico
PORATH e FLODIN;
Nature, 1959; Mtodo simples e rpido para fracionamento de substncias solveis

em gua;
Uso de um polmero hidroflico reticulado e insolvel em gua; Referncia a Sephadex, outros gis hidroflicos, derivados, por ex

amido, e lcool polivinlico...

Coluna 4 X 36,5 cm;

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O fracionamento depende, primariamente do tamanho molecular; Referncia a eletroforese...

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Protenas do soro; Saturao com sulfato de amnio, Gel de dextrano; Coluna 2,5 X 17,5 cm gua destilada 25ml/h;

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Sinonmia:
Filtrao em gel; Permeao em gel;

Excluso molecular;
Peneira molecular de difuso restrita

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Princpios da Cromatografia de Excluso

Fases; Eluio;

Espalhamento de zona e resoluo.

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Fases
Usa- se um recheio na forma de Gel que contm poros em seu interior.

FONTE: http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/EXCLUSAO.htm

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FONTE: Collins e colaboradores, 2006.

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Fase
Deve-se considerar: i. Volume da Matriz (gel) (Vg); ii. Volume dos Poros (Intragel)(Vi); iii. Volume da Fase Mvel (Vo);
iv. Volume Total da Coluna: Vc= Vo + Vi + Vg. v. Volume Total da Fase Mvel: : Vt= Vo + Vi.

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Eluio

Separao sequencial de uma ou mais substncias concomitantemente pela passagem de uma fase mvel adequada. (Rothschild, 2006).

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Vazo: mL/h.cm2.
A vazo realizada por uma bomba ou diferena no nvel de entrada e sada do eluente. VR/ VO= Volume relativo de ELUIO. VR= VO + KO.Vi. Ke: tempo que as molculas que entram ou no entram nos poros ficam na coluna.

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O Eluato colocado em frascos de mesmo volume. medido as concentraes ( montado o cromatrograma). Cada tubo da frao uma Unidade de Distncia (dm: primeira molcula a ser detectada)! MIGRAO DIFERENCIAL!

FONTE: Lehninger, 2011.

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FONTE: Linhares Carreira e Colaboradores, 2003.

FONTE: dos Santos e Silva Curvelo, 1999.

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FONTE: Linhares Carreira e Colaboradores, 2003.

usado unidade de Tempo ou Volume em vez de distncia.

FONTE: dos Santos e Silva Curvelo, 1999.

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FONTE: Site da Shimadzu (www.shimadzu.com.br)

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Resoluo Cromatogrfica
Depende de 3 fatores: i. Seletividade;

ii. Fator de capacidade (k); iii. Eficcia (ou eficincia) da Coluna.

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Rs = tr1 - tr2 / Wb.

Rs = separao real dos picos.

Rs = 0 (sem separao); Rs = 1(separao parcial);

Rs= 1.5(separao da linha base).

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Recheios usados em cromatografia por excluso

Caractersticas da fase estacionria

O termo gel infere material elstico, contendo gua. Tecnicamente, uma estrutura tridimensional cuja estabilidade mecnica dada pelo material contendo ligaes cruzadas. Substncias naturais que podem formar gis: Polissacardeos de frutas e razes, protenas, silicatos inorgnicos e fosfatos.

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A microestrutura do gel pode ser homognea ou heterognea: Homogneo- o gel tem propriedades que indicam uma distribuio homognea de matriz atravs de seu corpo.
So mais moles; Podem perder ou absorver o lquido, Permitem a entrada de molculas de pequena massa molar.

Heterogneo- possui regies de grande concentrao de matriz e outras quase vazias. Essa estrutura com espaos grandes permite a entrada de molculas
maiores.

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Caractersticas para um gel adequado: Inrcia qumica

Estabilidade Natureza qumica do gel: deve permitir
Natureza fsica do gel:
Deve conter partculas de tamanho e distribuio controlados; Fluxo deve ser ajustado, a resistncia ao fluxo maior em uma coluna com partculas pequenas. Os gis so fabricados, de maneira geral, na forma de prolas, que facilitam o fluxo. E, deve ter rigidez mecnica para no ser deformado pelas foras causadas pelo fluxo.
variaes para o fracionamento em diferentes intervalos de massa molar.

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Tipos de gel
Gis de dextrana
um polissacardeo com unidades glicose, obtido por fermentao de sacarose. As ligaes so do tipo (16) e ramificaes podem variar entre 12; 13 e 14. Possui trs OH livres. O tratamento com substncias que produzem ligaes cruzadas nas cadeias polissacardicas fornece um material que, em contato com gua, incha e produza um gel com estrutura tridimensional.

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Sephadex

fabricado por Pharmacia, na Sucia, representa um marco na histria da cromatografia. Slida constituda de dextranos modificados por ligaes cruzadas (epicloridrina em meio alcalino) formando malha tridimensional.

Muito estvel quimicamente vendido com vrios graus de ligaes cruzadas e propriedades de entumescimento.
Caracterizados pela letra G, seguida de um nmero que representa o nmero de mL de gua absorvidos por 1 g do gel x 10 (G-50).

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Para fracionar protenas com massa molecular acima de 10.000, devem-se usar gis que absorvam 7,5 a 20 g de gua G-75 e G- 200 Sephadex LH-20 hidroxipropil derivado da dextrana com ligaes cruzadas, que pode ser usado com solventes orgnicos polares ou misturas aquosas contendo esses solventes. Excelente instrumento no fracionamento de lipdeos, hormnios e outros tipos de pequenas biomolculas.

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Gis de Poliacrilamida
O uso de poliacrilamida na forma de gel para cromatografia foi proposto em 1962. Acrilamida H2C=CH-CO-NH2, solvel em gua e insolvel em solventes no-polares. Pode ser polimerizado com metileno-bis acrilamida, gerando poliacrilamida H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. vendido como Bio-Gel e apresenta-se sob a forma de p seco com estrutura de prolas.

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A matriz ganha e perde gua espontaneamente; inerte e sua ligao qumica sensvel o grupo amida.

Caracterizam-se pela letra P, seguida de um nmero que indica o limite de excluso para o gel, considerando protenas globulares ou peptdeos em unidades de 1.000. Para Bio-Gel P-300, haveria um limite de excluso de 300.000.

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Gis de gar e agarose

As propriedades cromatogrficas do gar foram descritas em 1961, demonstrando que esse tipo de gel adequado alta massa molar, com a vantagem de apresentar estabilidade mecnica. So um complemento dos gis de dextrana e poliacrilamida. Gis de gar para as menores massas molares correspondem aproximadamente a dextranas e poliacrilamidas, que fracionam as maiores. Fracionam no limite entre molcula e partcula.

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Obtido de algas, constitudo de polissacardeos lineares de lactose e dioxi-L-galactose.

As macromolculas na matriz do gel no so ligadas entre si por ligaes covalente. O tamanho dos poros do gel de gar e sua estabilidade talvez sejam consequncia da formao de microcristais.

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O gar tem certo nmero de grupos carregados negativamente, sulfatos e/ou carboxilas (agarose pectina). Sendo necessrio realizar experimentos com alta fora inica, a fim de minimizar os efeitos de troca inica. Agarose componente do gar, pode ser separado e usado para a cromatografia sem esse inconveniente.

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Tipos de gel de agarose:

Sagavac; Gelarose; Sepharose- possui trs faixas de fracionamento, 2B, 4B e
6B. Correspondente ao percentual de material seco no gel;produzida em forma de prolas com dimetros dentro do intervalo, 45-200 m;

Bio-Gel A- geralmente possui 1%, 2%, 4%, 6%, 8% e 10% de agarose no gel.

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Superose- tambm usado para cromatografia por excluso com base na agarose e para separaes de alta resoluo, com caractersticas para ampla faixa de massas molares e sistemas funcionando com presses mdias. Usado com bons resultados em separaes de biopolmeros, como fragmentos de restrio de DNA.

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Outros gis
Sepharose CL
Sepharose 2,3 dibromopropanol

Estabilidade trmica e qumica

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Sepharose 4B (cromatografia de afinidade)

acoplamento ligantes como glutationa; separao de protenas dependentes de glutationa;

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Sephacryl
alil-dextrana N, N - metilenobisacrilaminda

Estabilidade entre pH 3 a 11; Autoclavagem a 120 C em pH 3; Poros de tamanhos controlados;

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Desenvolvimento de materiais com resistnica mecnica a altas presses;

Gis rgidos de divinilbenzeno: amostras com ampla faixa de massas molares;

Superdex

Presses altas e mdias e separao de biomolculas entre 100 e 7000;

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Classificao das tcnicas cromatogrficas

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EQUIPAMENTOS PARA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO

1. Coluna cromatogrfica:
Tubo de vidro com um bloqueio em uma das pontas.
- Bloqueio temporrio; - Bloqueio permanente;

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EQUIPAMENTOS PARA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO

2. Controle da vazo da fase mvel:

Gravidade: Frasco (presso constante);

A vazo pode ser controlada por bombas ou pisto.

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EQUIPAMENTOS PARA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO

3. Registro das curvas de eluio:

- Deteco por propriedades dos Solutos. Absorbncia: Condutividade: ndice de refrao:

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PARMETROS EXPERIMENTAIS EM CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO

Boa resoluo dos componentes da mistura;

Recuperao mxima com menor diluio;

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Tamanho da coluna
Resoluo aumenta com a raiz quadrada do comprimento da coluna;

Tamanho da amostra
A amostra deve ter de 1 a 5 % do volume da coluna; Baixa viscosidade para evitar instabilidade;

Vazo da fase mvel

Resoluo pode diminuir com o aumento da vazo;

Tratamento da coluna
Homogeinidade da coluna: Blue Dextran 2000; Movimento da cor azul deve ser compacto e uniforme.

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APLICAES DA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO

Separao de tamanhos especficos; Separao de polmeros e protenas; Determinao da massa molecular.

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O objetivo deste trabalho foi estudar a purificao da polifenoloxidase (POLYPHENOLOXIDASE-PPO) da polpa de pinha madura atravs de cromatografia de troca inica e excluso molecular.

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Pinha (Annona squamosa L.) Extrao (Tampo fosfato de potssio 0,025M pH 7,5) Purificao
Depois do fracionamento da PPO com sulfato de amnio, foi realizado uma purificao posterior atravs de cromatografia em coluna de DEAE-Toyopearl 650M (troca-inica) , seguida por uma Toyopearl HW-55F (excluso molecular).

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Purificao
Toyopearl HW-55 (F):

Fonte: http://www.separations.us.tosohbioscience.com

Algumas pesquisas tm sido realizadas para purificao da PPO de diferentes fontes vegetais, utilizando colunas cromatogrficas de DEAE - Toyopearl 650M e colunas de Toyopearl HW 55F em diversas etapas da purificao com berinjela (FUJITA; TONO, 1988), com alface (FUJITA et al., 1991), mas (MURATA et al., 1992).

Fonte: http://www.separations.us.tosohbioscience.com

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Determinao do peso molecular da PFO

Enzima purificada teve o peso molecular estimado por filtrao

em gel Sephadex G-200, (coluna de 100cm x 2,5 cm); Coluna de vidro da Pharmacia ( 1,5 x 80 cm);

Tampo fosfato de potssio 0,025M (pH 7,0).

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Protenas Padres (SIGMA MW-GF 200) lcool desidrogenase Soro albumina bovina Anidrase carbnica

PM (daltons) 150.000 66.000 29.000

10mg de Blue Dextran 2.000 diludo em

tampo fosfato de potssio 0,025M (pH 7,0) frente de eluio; Amostra de 10ml de soluo de PPO purificada (~ 1,0mg ), com vazo de 10ml/h Coletas de fraes do eluente de 2ml,

Citocromo C

12.400

sendo monitoradas a 280 nm.

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O peso molecular da PFO purificada de polpa de pinha madura foi estimado em 90.700 daltons atravs da filtrao em gel de Sephadex G-200.

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A utilizao da RV possvel mostrar esses detalhes, de maneira mais satisfatria para o aprendizado e permitir maior entendimento com relao ao assunto.