IMUNOHISTOCHIMIE Cursul II

Complexul antigen-anticorp Punerea n contact a unui antigen cu anticorpul specific determin formarea unui complex antigen-anticorp, ntre cele dou molecule existnd o analogie structural la nivelul determinanilor antigenici de tip lact-cheie. Acest complex este meninut prin:

- formarea unor puni de hidrogen,

- apariia unor fore electrostatice - formarea de legturi Van der Waals. Combinarea unui anticorp cu antigenul su este o reacie imun prin care se urmrete neutralizarea toxicitii sau patogenitii antigenului.

Complexele antigen-anticorp pot fi vizualizate numai prin marcarea anticorpului specific cu fluorocromi sau cu enzime.

1. Marcarea fluorescent

1.1. Metoda direct const n punerea n contact a antigenului cu anticorpul specific, marcat fluorescent.
Cei mai frecveni reactivi utilizai pentru marcarea anticorpilor sunt izotiocianatul fluoresceina (FITC) i izotiocianatul tetrametilrodamina (TRITC). Aceste substane, n soluie alcalin (pH 9-10) se combin covalent cu proteinele, reacionnd n principal cu grupul amino al lizinei. Materialul care urmeaz a fi marcat este un antiser primar. Fluorocromul se va conjuga cu toate tipurile de proteine prezente n ser, nu numai cu anticorpul sau anticorpii interesai. Materialul fluorescent nelegat va fi de asemenea prezent din cauza unor hidrolize ale agenilor de marcaj care survin n mediu alcalin necesar dezvoltrii reaciei cu aminele.

Materialul fluorescent neconjugat trebuie s fie eliminat din

cauz c ar colora nespecific esuturile. Serul marcat este dializat pentru

a ndeprta moleculele mici (gm < 5000 daltoni) i pentru a nlocui solventul alcalin cu o soluie salin cu un pH fiziologic. Apoi serul imun

este trecut printr-o coloan filtru de gel, care reine moleculele mici sau
poate fi tratat cu crbune activat. Rezultatul final duce la obinerea unui ser ce conine n cea mai mare parte anticorpul specific marcat cu un fluorocrom. Acest ser este pus n contact cu esutul care conine antigenul ntr-o atmosfer umed, timp de aproximativ o or. Apoi se nltur

excesul cu o soluie salin i se monteaz ntre lam i lamel utiliznd

un amestec de glicerol i tampon alcalin.

Aceste tenhici prezint mai multe dezavantaje:

- prezena unui microscop cu lamp de ultraviolete, filtre speciale i obiective microscopice speciale;

- preparatul histologic trebuie examinat i fotografiat ct mai repede deoarece emisia de lumin se reduce progresiv cu trecerea timpului;
- montare nu se poate face n balsam de Canada i de aici imposibilitatea de a fi pstrat mult timp (nu poate fi pstrat ca preparat permanent).

Procedura de imunocolorare.

Materialul biologic care conine antigene pe care vrem s le studiem sunt secionate la microtom i montate pe lame histologice. Seciunile sunt cltite cu soluie de ser fiziologic dup care se adaug o pictur de antiser marcat, pe fiecare lam, acoperind toat seciunea. Pentru o reacie bun se vor efectua mai multe diluii ale serului n soluie salin. (Diluii mai slabe de 1:8 ale anticorprului primar nu sunt utilizate pentru metodele directe cu anticorpi fluoresceni). Serul este lsat n contact cu seciunile, n atmosfer umed, aproximativ o or. Apoi este ndeprtat surplusul de ser primar cu soluie salin dup care se aplic o lamel (se realizeaz montarea preparatului histologic). Preparatele imunofluorescente sunt de obicei montate n amestec de glicerol i un oarecare tampon alcalin, deoarece mediul de montare permanent scade intensitatea fluorescenei.
Seciunile colorate i montate sunt examinate la microscopul cu fluorescen, cu excitaie i filtrare adecvate pentru marcaj.

Deficienele metodei directe.

Cu metoda direct cu anticorpi fluoresceni nu este posibil totdeauna s localizm antigenele prezente n esutului, unele antigene fiind n cantitate foarte mic, deci sensibilitatea metodei este foarte redus, cel puin pentru unele antigene. Dac concentraia antigenului este sczut, densitatea moleculei fluorocrom legata nu poate fi suficient de mare pentru a permite detectarea lor la microscop. n plus, procesul de marcare al anticorpului primar poate fi deficitar, reducnd capacitatea acestuia de a pune n eviden complexul antigen-anticorp. Un ser ideal marcat are aproximativ 10 molecule fluorocromice ataate la fiecare molecul de IgG.
Alte deficiene al acestei tehnici este faptul c antiserurile primare sunt greu de preparat sau scumpe i adesea sunt disponibile n cantiti mici.

1.2. Metoda indirect const n cuplarea antigenului cu un anticorp primar, cuplat la rndul sau cu un anticorp secundar marcat fluorescent. Cu aceasta tehnic (indirect) este posibil s se identifice orice antigen sau anticorp n esut. Anticorpul secundar reprezint un anti-anticorp. Procedeele de obinere al anticopului secundar sunt extrem de variate. n principiu, un antigen este injectat unei specii de animale (ex. iepure). Prezena unei structuri imunogene va duce la producerea de ctre plasmocitele de iepure a unui anticorp specific numit anticorp primar =gama globulin (ser primar). Dup recoltare i purificare o parte din acest anticorp este injectat la alt specie de animale (capr). Aceasta va reaciona i plasmocitele sale vor produce imunoglobuline mpotriva anticorpului primar. Aceste imunoglobuline noi poart numele de anticorp secundar sau ser anti-iumunoglobulinic. Anticorpul secundar va fi marcat cu un fluorocrom.

Procedura de imunocolorare. O seciune coninnd antigenul este mai nti incubat pentru 30-60 minute cu o concentraie adecvat (de obicei 1:20 sau 1:50) anticorpul primar. Moleculele de anticorpi care se ataeaz la situsurile antigenice (se leag de epitropi) din esut, sunt imunoglobuline. Ele se cupleaz cu antigenele prin intermediul fragmentelor Fab. Segmentele Fc ale moleculelor de imunoglobuline din anticorpul primar pot nsele servi ca antigene. n stadiul urmtor al metodei de colorare, seciunea este tratat cu antiserul secundar marcat fluorescent. Moleculele anti-IgG (anticorpul secundar) se vor lega de fregmentele Fc ale moleculelor de imunoglobuline deja ataate derivate din antiserul primar. Aceast metod este o metod de amplificare a cantitii de fluorocrom si deci, de amplificare a semnalului luminos emis de fluorocrom.

Aceast metod este superioar metodei directe pentru 2 motive: - nu este necesar marcarea anticorpului primar. Obinerea antiserurilor secundare i marcarea lor este mai ieftin; - mai mult de o molecul de anticorp fluorescent din antiserul secundar va putea s se ataeze de fiecare molecul a anticorpului primar. Fiecare molecul de antigen a legat de dou ori mai multe molecule fluorescente dect ar fi legat dac s-ar fi folosit metoda direct de imunofluorescen. n realitate factorul de amplificare poate fi mult mai mare (nu numai de 2 ori), deci tehnicile imunohistochimice indirecte sunt ntotdeauna mai sensibile dect cele directe. Metoda imunofluorescenei indirecte este foarte sensibil, mai rapid i mai eficient.

Folosind antiserurile primare dezvoltate la specii diferite, este posibil localizarea a cel puin trei antigene diferite n aceeai seciune, prin conjugarea antiserurilor secundare cu fluorocromi

diferii. Procedurile de marcaj multiplu sunt constituite din mai

multe etape i sunt folosite n principal n cercetare. Microscopia confocal asigur o rezoluie nalt i posibilitatea colectrii i manipulrii electronice a imaginilor obinute de la specimene care conin fluorocromi diferii.

CD34 (verde) + alfa SMA (rou)

CD34 (verde) + alfa SMA (rou)

CD34 (verde) + alfa SMA (rou)

CD34 (verde) + alfa SMA (rou)

II. Marcarea enzimatic Enzimele sunt cei mai folosii markeri n imunocitochimie. Prin aceste tehnici anticorpii sunt marcai prin conjugare cu

enzime. Incubaia complexului antigen-anticorp-enzim cu un

cromogen folosind o metod histochimic standard genereaz un produs final de reacie, colorat, stabil, uor de examinat la

microscopul optic obinuit. n plus, varietatea enzimelor i

cromogenilor disponibili, permit utilizatorului alegerea culorii produsului final de reacie.

Peroxidaza din hrean este cea mai folosit enzim, i n

combinaie cu un cromogen favorabil diaminobenzidina (3,3diaminobenyidi tetraclorid)(DAB), conduce la formarea unui produs

de reacie maro nchis, stabil, insolubil i permanent. Cu toate c

DAB a fost considerat potenial carcinogen, actual riscul demonstrat a fi mic. n afar de DAB, peroxidaza poate fi combinat i cu ali

cromogeni: 4 clor-1-naftol (rezultnd o coloraie albastr), alfa

naftol pironina (rezultnd o coloraie roie purpurie), etc. Amplificarea semnalului const n faptul c la o singur

molecul de imunoglobulin pot fi ataate mai multe molecule de

enzim marcate cu un cromogen.

Procedura de imunocolorare. Pot fi folosii anticorpii primari marcai cu enzim ntr-o reacie direct. Aceast metod nu se mai folosete curent, ci se folosesc metode indirecte, n care antiserurile secundare sunt marcate enzimatic. La ora actual sunt foarte muli productori de reactivi de imunohistochimie i fiecare productor recomand metodologia de utilizare, inclusiv diluia anticorpului primar. Soluia ce conine un anticorp marcat peroxidaz din hrean (HRP) este folosit la fel ca antiserul secundar marcat fluorocromic. Locurile de ataament al HRP la esut sunt detectate histochimic, de obicei cu ajutorul reaciei DAB-peroxid de hidrogen. Legarea HRP e capabil s catalizeze oxidarea multor molecule de DAB prin peroxid de hidrogen cu acumulare consecutiv de cantiti substaniale ale unui produs maro insolubil. Mrimea aparent a fiecrui loc antigenic n esut este de aceea mrit pn cnd enzima este inhibat de acumularea produilor activitii sale. Factorul de amplificare este mai mare dect poate fi obinut n tehnicile cu anticorpi fluoresceni.

n forma sa ea mai simpl metoda urmtorii timpi: - cltirea seciunilor n soluie salin; - aplicarea anticorpului diluat primar dup indicaiile productorului; se folosesc diluii seriate de la 1:20 la 1:320. Se las n contact cu seciunile 30-60 min la temperatura camerei i atmosfer umed; - se cltesc seciunile de trei ori n soluie salin; - se aplic antiser secundar marcat enzimatic la recomandrile productorului; se utilizeaz diluii 1:20 i 1:80, 30-60 min; - se cltesc seciunile de trei ori n soluie salin; - se aplic metoda histochimic pentru detectarea marcrii enzimatice. Pentru HRP se folosete metoda DAB, pentru c produsul final este stabil i insolubil; - splare n soluie salin; - deshidratarea cu soluii de alcool etilic n concentraii crescnde; - clarificare, montare n balsam de Canada. Complexele antigen anticorp sunt puse n eviden printr-o coloraie maronie.

Marcaje enzimatice, altele dect HRP Peroxidaza din hrean este cea mai utilizat marcare enzimatic pentru anticorpi, dar nu este unica folosit. Alte enzime utilizate: fosfataza alcalin, -galactozidaza i glucozoxidaza. Aceste enzime pot fi de asemenea folosite la metodele enzimatice cu anticorpi nemarcai i cu metoda avidin-biotin, folosindu-se marcaje duble sau triple, care pun n eviden mai muli antigeni n acelai timp, n culori diferite. Cnd locurile antigenice sunt puine i departe ntre ele, o tehnic indirect cu anticorpi fluoresceni este preferat, pentru c este mai uor de observat pete fluorescente izolate pe un fundal ntunecat dect s gseti acumulri mici ocazionale de produi de reacie enzimatic pe un fundal luminos. Anticorpii marcai enzimatic sunt utilizai i pentru imunohistochimia ultrastructural, pentru c produii finali ai multor reacii histochimice, inclusiv metoda DAB-H2O2 pentru peroxidaz, pot fi detectate de microscopia electronic.

Metoda peroxidaz - antiperoxidaz

Principiul metodei. Peroxidaza din hrean poate servi drept antigen cnd este injectat la un animal (de exemplu la iepure). Se obin imunoglobuline (anticorpi) antiperoxidaz. Prin amestecarea atent a acestor anticorpi cu peroxidaza din hrean se obine un complex antigenanticorp solubil cunoscut sub numele de peroxidaz-antiperoxidaz (PAP). Dou molecule de IgG specifice sunt asociate cu 3 de peroxidaz. Acest complex este disponibil comercial. Fiecare molecul complex de PAP are 2 segmente Fc, care sunt apte pentru ataamentul la moleculele anti-IgG adecvate. De exemplu, segmentele Fc de PAP la iepure se vor lega de segmentele Fab ale IgG specifice la anti-(-globulina de iepure) la capr. Complexul PAP este de aceea un reactiv imunohistochimic valoros pentru detectarea locurilor de legare ale anti-anticorpilor. Combinarea cu anticorp nu inhib activitatea peroxidazei.

Procedura de imunocolorare: - se aplicarea anticorpul primar de iepure (antiserul primar) pe seciuni, 1 or la temperatura camerei. Dac acesta nu a mai fost folosit, se ncearc cteva diluii (n soluie salin tamponat cu fosfat) de la 1:50 la 1:20000. O expunere mai mare (12-24 ore la 4oC) este avantajoas cnd este necesar un antiser primar foarte diluat sau dac investigaia necesit folosirea unor seciuni groase (50-150m); - se cltete de 3 ori n soluie salin tamponat cu fosfat; - se aplic antiserul secundar, anti-(imunoglobulin de iepure) de la capr, 30 minute la temperatura camerei. Se folosete o diluie a serului de 1:10 i 1:40. Concentraia nu este critic, dar ea trebuie s fie mult mai mare dect cea a antiserului primar sau PAP; - se cltete de 3 sau 4 ori n soluie salin tamponat cu fosfat;

- se aplic complexul peroxidaz-antiperoxidaz de la iepure (PAP de la iepure) 30 min. la temperatura camerei. Acest reactiv este pus la dispoziie ca o soluie ce conine 1 mg proteine/ml. Este diluat 1:50 cu soluie salin tamponat cu fosfat;

- se cltete de 3 sau 4 ori n soluie salin tamponat cu fosfat;

- se incubeaz pentru demonstrarea activitii peroxidazei. Metoda DAB-H2O2 este de obicei folosit cu mediul de incubare tamponat la ph 7,6.

- se spal n ap. Dac a fost folosit DAB, se deshidrateaz, se clarific

i se monteaz folosind un mediu rinos. Intensitatea colorrii produsului final este influenat de diluia antiserului primar. Cnd antigenul este prezent n concentraie mare n esut, densitatea produsului final este mai mare dup aplicarea soluiilor mai diluate ale antiserului primar.

Aprecierea metodei

Principalul avantaj al metodei anticorp-enzim (PAP) este marea ei sensibilitate. Rezultate pozitive pot adesea fi obinute cu seciuni de esut fixat i prelucrat prin metode ce denatureaz majoritatea antigenelor prezente. Este posibil chiar s se foloseasc lame vechi colorate H-E de la care lamelele, mediul de montare i coloranii au fost ndeprtai. Marea sensibilitate de datoreaz atarii celor 3 molecule de peroxidaz la fiecare loc de legare al complexului PAP.
Dei procedurile de control sunt necesare pentru a exclude colorarea nespecific, aceasta este o metod mai curat dect altele, probabil pentru c reactivul PAP este un complex antigen-anticorp pur, incapabil s se asocieze cu alte proteine dect anticorpii si specifici.

Folosirea metodei PAP ne permite s apreciem destul de bine cantitatea de antigen dintr-un esut, celul, etc i s facem comparaii importante ntre regiunile colorate mai puternic i mai slab n cadrul unei singure seciuni.

Metoda avidin-biotin
Biotina, un metabolit al multor tipuri de microorganisme, este o vitamin ce formeaz coenzim sau grup prostetic al ctorva enzime ce transfer grupul carboxil.
Avidina este o glicoprotein din ou. Fiecare molecul este format din 4 subuniti identice, fiecare capabil s lege o molecul de biotin. Afinitatea ntre biotin i avidin este foarte mare, dei nu sunt formate legturi covalente, astfel nct legarea apare repede i este reversibil numai n condiii extreme, precum aciditate puternic.

Streptavidina este o protein microbian care nu conine carbohidrai. Proprietile sale sunt similare cu cele ale avidinei. Cele 2 proteine sunt folosite n aceleai scopuri, dar streptavidina este de aproximativ 5 ori mai scump dect avidina.
Este posibil ca i alte molecule mari proteice s se conjuge cu biotina. Aceast reacie este cunoscut ca biotinilaie. Molecula de biotin este suficient de mic pentru a nu interfera cu activitatea biologic a macromoleculelor pe care le marcheaz, iar reactivitatea sa cu avidina este neschimbat. La ora actual exist n comer multe seruri biotinilate i enzime sunt disponibile.

Procedura de marcare avidin-biotin:

secine deparafinat, hidratat, splat n ap distilat

- aplicarea antiserului primar;

- splare n 3 bi de PBS;
- aplicarea antiserului secundar biotinizat; - aplicarea soluiei de avidin ce a fost conjugat covalent cu fluorocrom sau o enzim demonstrabil histochimic, precum peroxidaza din hrean. Enzima este apoi localizat histochimic n modul obinuit.

Metoda ABC
Sensibilitatea metodei avidin-biotin a putut fi crescut prin folosirea ca agent de imunomarcare a complexului avidin-biotin (ABC) proaspt preparat, realizat prin amestecarea soluiei de avidin cu peroxidaz din hrean (HRP) biotinilat. Recaia este asemntare cu procedura anterioar, dar difer de acesta prin faptul c acest complex peroxidaz din hrean (HRP)-avidin-biotin preformat este o molecul enorm, legat ncruciat, ce conine mai mult de 3 molecule HRP per loc liber pe biotin. Procedura de detectare a antigenului Fixarea materialului biologic (esutului) i procesarea sunt similare altor metode imunohistochimice. Seciunile histologice sunt deparafinate, hidratate i echilibrate cu PBS. (PBS = soluie salin de tampon fosfat).

Soluiile necesare

1. Un antiser primar ce se va combina cu antigenul cutat.

2. Un antiser biotinilat secundar ce se va combina cu imunoglobulinele speciilor din antiserul primar.

3. O soluie avidin. Aceasta conine tipic 10g de avidin/ml n PBS.

4. O soluie peroxidaz biotinizat horseradish n PBS. 5. ABC realizat prin combinarea soluiilor 3 i 4. Se amestec 15-20 min. nainte de ntrebuinare. 6. Reactivii pentru demonstrarea activitii peroxidazei la pH neutru. 7. Orice soluie colorant (DAB).

Tehnica de lucru
- deparafinare; - hidratare; - splare 5 minute n PBS; - se inhib peroxidaza endogen prin tratarea seciunilor pentru 30 minute cu peroxid de hidrogen 0,3% n PBS; - splare n 2 bi de PBS; - se incubeaz n antiser primar diluat adecvat (gradul diluiei poate varia ntre 1:200 o i 1:6400) . Incubrile lungi (12-48 ore) la 4 C sunt preferate pentru seciunile subiri (50150m). Incubrile mai scurte (ca 1 or) la temperatura camerei sunt satisfctoare pentru seciunile montate la parafin. - cltire n 3 bai de PBS; - se incubeaz n antiserul secundar biotinilat 30-60 minute la temperatura camerei n diluie de 1:10 la 1:40; - cltire de 3 ori n PBS; - se incubeaz seciunile n soluie ABC timp de o ora la temperatura camerei; - se cltesc de 3 ori n PBS; - se activeaz peroxidaza; - se pune soluia marcatoare (DAB); - se spal n ap, - se coloreaz de contrast cu Hematoxilin Mayer ct se dorete - se deshidrateaz i se monteaz.

Rezultate

Locurile de imunoreactivitate recunoscute de antiserul primar sunt marcate prin culoare maro.
Aprecierea metodei

Metodele ABC i PAP sunt probabil de intensitate aproximativ egal. n ambele proceduri sunt folosite molecule mari, complexe, pentru a introduce enzima detectoare la locurile unde sunt legai anticorpii. Totui, tehnica ABC este preferat pentru obinerea unor preparate curate. Unii utilizatori pretind c rezultatele sunt mai exacte cu streptavidin dect cu avidin.

Alte metode imunohistochimice

Tehnicile descrise pn acum sunt cele mai larg utilizate pentru demonstrarea antigenelor n esuturi. Dar la ora actual exist i alte tehnici ingenioase pentru localizarea antigenelor i anticorpilor.
Tehnica sandwich pentru anticorpi n esut Anticorpii dintr-un esut sunt demonstrai prin aplicarea antigenului purificat, urmat de antiserul marcat fluorescent al antigenului. Metoda este adesea folosit pentru studiul nodulilor limfatici. Anticorpii, n general, sunt detectai prin combinare lor cu antigenele specifice. De exemplu o imunoglobulin G uman, poate fi localizat pe seciunile histologice cu ajutorul antiserului de iepure mpotriva imunoglobulinei G umane, urmat de combinarea acestui complex cu un antiser marcat provenind de la o alt specie de animal (capr) mpotriva imunoglobulinei de iepure.

Detectarea anticorpului n ser

n bolile autoimune, sngele conine anticorpi circulani mpotriva anumitor componente ale esuturilor pacientului sau animalului. Existena i specificitatea unor asemenea anticorpi poate fi detectat imunohistochimic prin aplicarea serului suspect pe seciunile criostatice nefixate de esut cunoscut ce conine auto-antigene adecvate. Locurile de legare ale anticorpilor la seciuni sunt fcute vizibile prin aplicarea antiserului fluorescent sau marcat enzimatic mpotriva imunoglobulinelor speciilor de la care a fost obinut serul sub testare.

Metode ce folosesc proteina A stafilococic Peretele celular al Stafilococului aureu, conine o component numit proteina A ce este capabil s se lege de segmentele Fc ale multor tipuri de molecule IgG la mamifere. Legarea este nonimun rezult dintr-o afinitate similar celei existente ntre antigene i anticorpi. Molecula de protein A este bivalent i poate de aceea fi realizat pentru a servi drept punte ntre poriunile Fc ale moleculelor de IgG de tipuri diferite. Este de asemenea posibil s marcheze proteina A cu fluorocromi sau cu HRP. De aceea proteina A poate fi folosit pentru aceleai scopuri ca un antiser la IgG. Un conjugat al proteinei A cu HRP este implicat ntr-o tehnic asemntoare unei metode cu anticorpi marcai enzimatic. Antiserul primar specific este aplicat pe o seciune de esut, urmat de conjugatul HRP-proteina A. Locurile de legare HRP sunt demonstrate histochimic n modul obinuit. Aceast metod pune la dispoziie uneori o colorare mai curat, cu mai puin culorare de fond nonimunologic, dect tehnica cu anticorpi marcai enzimatic echivalent. Avantajul principal al proteinei A este c aceasta este capabil s se combine cu IgG de la toate mamiferele, aa nct ea are un numr mai mare de poteniale ntrebuinri dect un antiser la imunolgobulina unei singure specii.

Marcarea cu aur coloidal

Este uor de realizat deoarece este o suspensie coloidal (numit sol) de aur, coninnd particule cu diametru cunoscut n medie de 20150 nm. Pentru a preveni ca particulele suspendate s se grupeze sau s se scufunde, suspensia conine un agent stabilizator macromolecular care acoper suprafeele particulelor. Dac acest agent stabilizator este sau include o protein cu afinitate specific precum o lecitin sau o imunoglobulin, metalul va servi drept marcator ca si un colorant fluorescent sau o enzim demonstrabil histochimic. n mod obinuit, un ser anti-IgG, fie o protein A stafilococic este legat de particulele de aur. In acest fel aurul este folosit pentru a identifica locurile de ataament ale anticorpului primar. Avidina poate fi de asemenea folosit pentru a acoperi particulele de aur coloidale.
Metodele cu aur coloidal au fost introduse pentru a se folosi n microscopia electronic.

CD31_CD20_CD68

CD31_CD20_CD68

CD31_CD20_CD68

Helicobacter pylori (1)

Helicobacter pylori

HPV

HPV

Macrofage CD 68, esut de granulaie

Miocard, desmina

Miocard, desmina

Miocard, desmina