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INTRODUCCION
Clase I
HLA A, B y C. Expresadas en casi todas las clulas nucleadas del organismo (Ausente en eritrocitos y trofoblastos). Formados por una cadena pesada () codificada en el HLA y una cadena liviana () codificada en el Cr 15. Tambin contiene HLA-E, HLA-F y HLA-G (Molculas MHC no Clsicas). Unen pptidos derivados del citoplasma. Presentan antgenos peptdicos a linfocitos T CD8+ induciendo apoptosis o liberacin de citotoxinas.
Clase I
(Molculas MHC no Clsicas)
Limitado Polimorfismo. Baja expresin en la superficie celular. Distribucin celular y tisular muy selectiva. Son reconocidas por receptores NK (RNK). HLA G : expresado en trofoblasto fetal y clulas epitelio tmico. Se une a ILT-2, ILT4, KIR2DL ( - ) lisis por NK y LT. Induccin de tolerancia materno-fetal. Vigilancia del sistema inmune frente a tumores. HLA E : Se une a CD94/NKG2A que ( - ) actividad NK y de ciertos LT. HLA F : Se expresa en amgdalas, bazo y timo. Se unen a LIR 1 y LIR 2 e inhiben linfocitos
Clase II:
HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Expresados constitutivamente en clulas B, clulas dendrticas y monocitos. Pueden ser expresados en otras clulas durante la inflamacin (citoquinas: IL-2 y IFN-gamma). Constituidas por una cadena pesada () y una cadena liviana () ambas codificadas en el MHC. Unen pptidos derivados de protenas extracelulares. Presentan antgenos a Linfocitos T CD4+.
Clase III
No contiene ningun gen del HLA, pero codifica genes de importancia en la respuesta inmune:
Complemento (C2, C4 y factor B). Factor de Necrosis tumoral. Heat shock protein.
Crossmatch (XM)
Busca anticuerpos anti-HLA en el suero del receptor que reaccionen con los Antgenos HLA del donante. Suero del receptor + Clulas del donante
XM + : Presencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las clulas del donante contraindica el trasplante. XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las clulas del donante permite el trasplante.
Crossmatch (XM)
Objetivos:
Detectar Anticuerpos Identificar Especificidad
Mtodos:
CDC (Citotoxicidad Dependiente Complemento) ELISA Citometra de Flujo Luminex
Crossmatch (XM)
Variantes:
Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre y post trasplante.
CDC, ELISA, CF, LUMINEX
Fuerza
Especificidad
Menor Sensibilidad
METODOS
Diacetato de Fluorescena: colorante vital capaz de atravesar la membrana intacta de las clulas. Bromuro de etidio: se incorpora al ADN; las membranas intactas lo excluyen.
*Cantidad de anticuerpos anti-HLA menor al umbral de deteccin por mtodo estndar. *Anticuerpos no fijadores de C.
Para la determinacin del grado de PRA se necesita ensayar cada suero con un panel amplio de clulas (alrededor de 40), por lo que este tipo de determinaciones tiene una demora considerable.
Alo/Autoanticuerpos?
Aloanticuerpos: IgG Autoanticuerpos: IgM DTT: Rompe enlaces disulfuro que unen al pentmero de IgM.
Suero + DTT
POSITIVO NEGATIVO
IgG
IgM
Autoanticuerpos
Pac.con LES
ELISA
Deteccin de anticuerpos presentes en un suero que son capaces de reconocer antgenos purificados adheridos a un soporte slido. Revelado uso de un segundo anticuerpo marcado con un enzima y adicin de un sustrato de la enzima que origina una reaccin colorimtrica interpretada por espectrofotometra.
ELISA
ELISA
Ventajas:
Determinacin rpida y especfica Cubren todas las especificidades No se requieren cel. viables Detecta slo IgG (se usa para screening de ac antiHLA: IgG) Detecta Ac contra Ag de clase I y II Detecta Ac HLA especficos y Ac HLA que no unen complemento (IgG2,IgG4) > sensibilidad, detecta Ac de bajo ttulo Se puede realizar el XM despus del trat. con antiCD3, anti-timogl, anti-CD20
ELISA
Limitaciones de la tcnica
Slo podra utilizarse para el estudio de anticuerpos anti-HLA presentes en el suero de pacientes en lista de espera, pero no en la prueba cruzada pretrasplante. La fuente de la que se obtengan los antgenos purificados es fundamental para la interpretacinde resultados. Algunas casas comerciales utilizan plaquetas para obtener los antgenos por lo que estas preparaciones a pesar de contener tericamente slo molculas HLA suelen estar contaminadas con antgenos plaquetarios que pueden dar lugar a falsos positivos
Citometra de Flujo
Reaccin antgeno-anticuerpo sobre la superficie celular visualizada mediante la utilizacin de un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo y el uso de un citmetro de flujo. Tcnica de anlisis celular; medicin de caractersticas de dispersin de luz y fluorescencia de las clulas. Suspensin celular. Las muestras son las mismas que para CDC, pero no es necesario separar las poblaciones T y B, ya que el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos nos permite distinguirlas en el citmetro. Las clulas deben tener tambin buena viabilidad Es hasta cien veces ms sensibles que el mtodo de CDC en la deteccin de anticuerpos en linfocitos y adems no requiere fijacin del complemento (Stites y cols., 1997).
Citometra de Flujo
Antgeno
Superficie celular
Citometra de Flujo
Citmetro de Flujo:
Instrumento que detecta cada clula presente en una corriente de lquido iluminada por un haz de lser (Janeway y cols.,2003).
Citometra de Flujo
Fundamento:
Estructura Bsica:
Sistema Fludrico (inyeccin de la muestra) Sistema ptico (Fuentes de luz) Sistema Elctrico (amplificador-convertidor)
Citometra de Flujo
Parmetros celulares medidos:
El tamao celular relativo ( Forward Scatter o FSC) La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) Intensidades relativas de emisin de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3, FL4, etc.)
Complejidad interna
Citometra de Flujo
Limitaciones de la tcnica
Se requiere de un aparataje sofisticado y calibracin ptima del citmetro. Determinamos es la presencia de anticuerpos pero no permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes y no relevantes en el trasplante. Para la determinacin del grado de PRA y de la especificidad de los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes en lista de espera las limitaciones son las mismas que en el caso de la microlinfocitotoxocidad.
Citometra de Flujo
Ventajas
Mayor sensibilidad que CDC. En determinados grupos de pacientes (aquellos en que existe rechazo previo, los que presentan PRA elevado y rin lmite) una prueba cruzada negativa con clulas T utilizando la microlinfocitotoxicidad y positiva usando citometra de flujo sera predictivo de una peor supervivencia del injerto frente a un resultado de prueba cruzada mediante citometra de flujo tambin negativo (Martn y cols., 2003) Permite diferenciar anticuerpos IgG de IgM
Luminex
Mtodo similar a la citometra convencional, utiliza microesferas recubiertas de molculas HLA en lugar de clulas. El uso de la citometra de flujo permite el escrutinio de anticuerpos sricos frente a antgenos HLA con una sensibilidad mayor que el mtodo convencional de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento.
PMT
Luminex
Limitaciones de la tcnica
No puede ser utilizado en la prueba cruzada pretrasplante. Se requiere de un aparataje sofisticado y calibracin ptima del citmetro. La fuente de la que se obtengan los antgenos purificados es fundamental para la interpretacin de resultados. Elevados costes.
Ventajas
Permite determinar de manera rpida la PRA y especificidad de los sueros de pacientes incluidos en lista de espera. Tericamente se detectan slo anticuerpos frente a molculas HLA. La sensibilidad de la tcnica es comparable a la de la citometra convencional.
SIGNIFICACIN CLNICA
HUMORAL.
Causar rechazo renal hiperagudo in vitro. Conducir a depsitos de C4d asociados con falla temprana del injerto renal. Buenos marcadores de sensibilizacin, conduciendo a rechazo agudo prematuros Presentes en 96% de 826 pacientes que presentaron rechazo del injerto renal. Asociados con rechazo crnico en 33 estudios de injertos renales, cardacos, pulmonares y hepticos. Aparecen en circulacin ANTES del rechazo renal.
Nuevas Hiptesis
Si la Teora Humoral es aceptada, pacientes que presentan anticuerpos pueden ser tratados con inmunosupresin hasta que los anticuerpos desaparezca, para demostrara hasta donde el rechazo crnico puede ser bloqueado. En pacientes que no presentan anticuerpos, la inmunosupresin puede ser reducida hasta que aparezcan los anticuerpos.
237 trasplantes renales ABO compatibles (221 cadavricos y 16 donantes vivos). CDCXM cel T y B negativos. Screening retrospectivo con ELISA para DSA. Episodios de rechazo confirmados por biopsia.
308 pacientes trasplantados renales. CDCXM T y B negativos. Se excluyeron 2 pacientes que estaban con terapia de desensibilizacin. 69 pacientes (22%) desarrollaron FCXM preoperatorio positivo. Seguimiento con FCXM trimestral. Dos grupos:
I: pacientes que negativizaron XM II: pacientes que no negativizaron XM
Igual esquema de inmunosupresin: Metilprednisolona + Tacrolimus + Micofenolato mofetil. Rechazo confirmado por biopsia segn criterios Banff 97.
Estudio prospectivo, unicntrico. Diseado ad hoc para determinar si la presencia de anticuerpos contra panel anti-HLA clase I y/o II son predictivos de prdida de injerto debido a CAN. 512 trasplantados, 91 (17.8%) con anticuerpos anti-HLA +
55 (10.7%) anti-HLA class II 20 (3.9%) anti-HLA class I 16 (3.1%) anti-HLA class I and class II
Conclusiones
Avances en materia de deteccin de anticuerpos Anti-HLA. Anticuerpos Anti-HLA son predictores de Rechazo Crnico y aparecen antes de que este se produzca. Principalmente Anticuerpos Anti-HLA II estn involucrados en Falla del Injerto. Nuevas lneas de investigacin para tratamiento de desensibilizacin y evitar progresin a Fallo de Injerto.
MUCHAS GRACIAS!