Estratgias mais utilizadas de transferncia de DNA para plantas

Vetor biolgico:
Agrobacterium (uma bactria do solo com duas espcies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes) Vetores virais: O CaMV permite inseres de no mximo 0.8 Kb

Transferncia direta:
De protoplastos - A membrana celular permeabilizada por choques
elctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) eletroporao

Plantas intactas - Bombardeamento com micropartculas, de ouro ou

tungstnio (com cerca de 1 m de dimetro)

MTODOS DIRETOS DE TRANSFORMAO

Dois grupos:
Aqueles que se utilizam de clulas desprovidas de parede celular (protoplastos), Aqueles que possibilitam a transformao de clulas intactas ou tecidos.
Em ambos mtodos, o gene de interesse juntamente com o marcador seletivo e/ou reprter so transferidos como constituintes de um pequeno plasmdio de E. coli.

PROTOPLASTOS
Clulas somtica vegetais desprovidas da parede celular. Estado transitrio que permite a manipulao exemplo das clulas animais e de microorganismos. Parede celular - Celulose e hemicelulose: rigidez - Pectina: agregao celular

Processo de obteno de protoplastos

Enzimas pectocelulticas: Tratamento enzimtico -Celulase Onozuka Trichoderma viride: despolimerizao da celulose (1% p/v);

-Pectinase Macerozyme R 10 (0,2%p/v);

- Pectinase Pectolyase Y 23. -Celulose Driselase Irpex lacteus: pectinoltica e celuloltica (0,05%0; -Celulose Cellulysin (o,2%); - Hemicelulase Rhozyme;

Obteno de plantas via protoplastos

Eletroporao de protoplastos

Necessita de DNA carreador

Transformao de protoplastos via Polictions

Polictions
Polietilenoglicol
Polivinil lcool DEAE-Dextran PEG

Baixa eficincia1/1.000 e 1/10.000 Protegem o DNA exgeno das nucleases das clulas

PVA

DEAE-Dextran

Microinjees de protoplastos

Principais vantagens: Preciso da liberao do DNA, no limitao da quantidade de DNA inserido, Freqncia de transformao alta (1525%). Desvantagem: Oneroso e demorado.

Transferncia direta de paredes celulares intactas

Macroinjeo; Biobalstica; Utilizao do tubo polnico; Transformao do plen; Vortex (microfibrilas); Ultra sonicao; Eletroforese;

Macroinjeo
Injeo de DNA em partes florais da planta

DNA liberado junto as clulas destrudas pela agulha-precisa migrar para clulas intactas

Macroinjeo de protoplastos
Vrias barreiras:
O DNA deve passar por uma ou mais paredes celulares; Baixa eficincia em vulos, plen ou embries.

Sucesso relatado para centeio:

Vantagem: No precisa de uma etapa in vitro.

Acelerao de partculas
DEFINIO:
consiste em introduzir o DNA na clula, rompendo a barreira da parede celular e da membrana plasmtica, sem o uso de vetores biolgicos. (Sanford et al., 1987)

Utiliza micro projteis em alta velocidade para introduzir cido nuclicos e outras molculas em clulas e tecidos in vivo.

Acelerao de partculas
Tambm chamado de bomardeamento com microprojteis, gene gun (arma de genes), acelerao de partculas, entre outros,

Baseado:
gerao de uma onda de choque com energia suficiente para deslocar uma membrana carreadora cotendo as micropartculas cobertas com DNA.

Pode ser:
gerada por uma exploso qumica (plvora seca),

descarga de hlio a alta presso,

vaporizao de uma gota de gua decorrente de descarga eltrica com alta voltagem e baixa capacitncia ou com baixa voltagem e alta capacitncia, descarga de ar comprimido.

Acelerao de partculas

Acelerao de partculas
Micropartculas
dimetro), velocidades superiores a 1.500 km/h, penetram de maneira no-letal, alojandose aleatoriamente nas organelas celulares, dissociao do DNA das micropartculas pela ao do lquido celular,

(de

0,2

de

Micrografia eletrnica de varredura das micropartculas cobertas com DNA: (A) tungstnio; (B) ouro.

Esquema de funcionamento:
1. O tubo de acelerao preenchido com gs hlio, que rompe a membrana a uma determinada presso, O fluxo de gs impulsiona as partculas e o DNA, colocados em uma segunda membrana, na direo do tecido vegetal, Uma tela de proteo bloqueia as membranas e apenas o DNA e as partculas atingem o tecido e Todo o processo ocorre dentro da cmara de vcuo

2.

3.

4.

Acelerao de partculas
Tamanho das membranas: Membrana de ruptura KaptonTM, 2 mil = 50 um de Espessura, 13,2 mm de dimetro (1 membrana p/ cada 300 psi de presso).

Membrana carreadora KaptonTM 24 um de Espessura, 13,2 mm de dimetro.

Acelerao de partculas
Preparo do material:

Cuidados com contaminao, Escolha de regies meristemticas,

Preferncia por explantes de plantas produzidos em casa de vegetao,

Cuidado com o meio de cultura

Usar Phytagel 0,8% ou agarose 1,5%,

O material a ser bombardeado no deve estar mido.

Acelerao de partculas
PRECIPITAO DE DNA SOBRE AS MICROPARTCULAS
Lavagem com gua e adio de glicerol 50%

juntar DNA, espermidina, CaCl2 e etanol absoluto

Distribuio sobre as membranas carreadoras

Utilizao do tubo polnico

Definio Insero de DNA no tubo polnico durante a sua germinao.

Arroz

Transformao de plen
Definio Transformao de plen maduro ou em processo de germinao, embebendo-o em uma soluo de DNA, antes de se efetuar a polinizao.

Transformao por Vortex ou Microfibrilas

As clulas so submetidas a agitao, em uma soluo aquosa de DNA contendo microfibrilas que provocam perfuraes na clula. Microfibras de carboneto de silcio.

Ultrasonicao
Consiste na transformao de segmentos foliares ou outros explantes atravs sonicao do material vegetal em uma soluo aquosa de DNA. Frequncia de transformao de 22%.

Eletroforese
Usada para tentar transformar calos sementes e vulos a partir do estigma da planta. Sem muito sucesso.

Transformao direta
No controlada, Dois caminhos:
Integrao no genoma, Expresso transiente,