Instrumentacin de HPLC

En esta seccin aprender lo siguiente:

Acerca de los sistemas de reparto de disolvente de HPLC. Cmo funcionan los muestreadores. Acerca de los detectores de HPLC habituales.

Descripcin general de la instrumentacin de HPLC

El principio
Muestreador

Un ejemplo

Mezclador

Cabina de disolventes Desgasificador de vaco

Bombas Bomba cuaternaria

Columna Muestreador

Mdulo de control

Detector

Compartimento de las columnas

Detector Disolventes

Desgasificador de vaco

Sensor Bomba

Circuito de control

Bomba de vaco

Membrana de plstico tubular Disolvente

Contenedor de vaco

Influencia en la lnea de base del detector

Disolvente: metanol; seal UV: 210 nm

sin desgasificacin

Absorbencia

desgasificacin de helio

desgasificacin en lnea

Tiempo (min)

Funciones del sistema de reparto de disolvente

El sistema de reparto de disolvente tiene tres funciones bsicas: 1. Ofrecer un flujo constante y preciso. 2. Ofrecer composiciones de fase mvil precisas.

3. Ofrecer la fuerza necesaria para empujar la fase mvil a travs

de la columna bien rellena.

Vlvula de gradiente multicanal

Determina la composicin de la fase mvil. El tapn de disolvente de mayor tamao se llena primero. La bomba cuaternaria 1100, 1090 PV5 y 1050.
7

Bomba de dos pistones en serie

El primer pistn desplaza el disolvente al doble de velocidad que el segundo pistn. Proporciona un flujo constante y la presin necesaria para desplazarse por la columna.

Formacin de gradientes

Gradiente de baja presin

Gradiente de alta presin

Resumen

La bomba es la pieza ms importante del equipo para conseguir un buen funcionamiento de la HPLC. Parmetros de rendimiento para bombas de HPLC:
Precisin de flujo Rango de flujo Volumen de retardo Pulso de presin Precisin de la composicin

10

Muestreadores

Requisitos: Introduccin reproducible del volumen de la muestra en el flujo de la fase mvil.

Dos diseos principales: Muestreadores automticos o muestreadores manuales

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Muestreadores manuales
Carga de la muestra
Desde la bomba A la columna
Entrada del disolvente Salida del disolvente Entrada de la muestra
Muestreador

Mezclador

Bombas

Columna

Detector

Disolventes

Desde la bomba A la columna

Entrada del disolvente Salida del disolvente

Entrada de la muestra

Inyeccin de la muestra
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Muestreadores automticos

Paso 1

Paso 2

Paso 3
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Sistema de inyeccin automtica

Tratamiento previo con sistema de inyeccin automtica:
Muestra Reactivo Dispositivo de medida

Reactivo

Unidad de muestreo

Vlvula de 6 puertos

Desde la bomba

A la columna

A residuos

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Horno de columnas
Tiempo de retencin
Tiempo de retencin con horno - temperatura constante

Tiempo de retencin sin temperatura estable

Da Noche

Da

Nmero de anlisis

Es necesario que la columna y el disolvente tengan una temperatura constante para conseguir resultados reproducibles.
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Detectores habituales de HPLC

Radioactividad Conductividad LC/IR

MS
FLD 8%

Electro 10% RI LS 10% UV-VIS 65%

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Necesidad de ms de un detector - Sensibilidad

Seal UV

248/411 WL

El PAH se extrae de la tierra; Sup. LC-PAH 159 x 4,6 mm; Disolv.: H2O/CH3OH = 10:90

241/394 WL

270/388 WL

Fluorescencia

247/504 WL

302/420 WL

Tiempo (min.)

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Necesidad de ms de un detector - Selectividad

Flecainida en suero

Seal UV

Seal FL

Tiempo (min.)

Concentracin teraputica: 1,8 mg/l, 20 ul inyectado Seal de fluorescencia y UV

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Necesidad de ms de un detector Informacin cualitativa

Informacin cualitativa Clorotoruln ? Atrazina ?

Tomar un espectro de pico (UV)

Tomar un espectro de pico (MS)

200 58 215 44 68 96 104
60 80 100 120

172 158 132 138

140 160 180 200 220

Longitud de onda (nm)

Masa/Carga

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Caractersticas de los detectores de HPLC

Caractersticas de rendimiento del detector: Sensibilidad (LoD, LoQ) Selectividad Linealidad Informacin cualitativa Fiabilidad Facilidad de uso Universalidad

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LOD (Lmite de deteccin)

El lmite de deteccin de un detector se puede caracterizar por su relacin seal-ruido (S/N) para un analito en una serie de condiciones determinadas.
Pico

Ruido

21

Ruido del detector - Deriva

El ruido es la amplitud de todas las variaciones aleatorias de la seal del detector. La deriva es la pendiente media de la envolvente del ruido expresada en AU/h.
Ruido
Absorbancia

60 minutos

Tiempo

Deriva

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Lmite de deteccin - Lmite de cuantificacin

Respuesta Rango lineal

Pendiente = sensibilidad

MQL MDL Interseccin

por ejemplo, RSD <10%, S/N >20

Por ejemplo, S/N >3

Cantidad

El lmite de deteccin (LOD) es un resultado de todo el sistema de cromatografa, no slo del rendimiento del detector. El lmite de cuantificacin (LOQ) es un lmite definido de un mtodo utilizado para un fin especfico.
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Detectores de UV-VIS
Principios: La fraccin de luz transmitida a travs de la celda del detector est relacionada con la concentracin del soluto, segn la ley de Beer.
Celda de flujo del detector

I0

c b

Log I0 = A = abc
I

Caractersticas: Especfico, sensible a la concentracin, buena estabilidad, capacidad de gradiente. Especial: Capacidad espectral UV-VIS (tecnologa de matriz de diodos).

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Longitudes de onda de cromoforos

Estructura - NH2 -C=CC=O - COOR - CHO - COOH - NO2

Cromoforo Amina Etileno Cetona ster Aldehdo Carboxilo Nitro Fenilo Naftilo

mx(nm) 195 190 195 205 210 200-210 310 202, 255 220, 275

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Detectores UV-VIS - Principios de diseo

Detector de longitud de onda variable

Lmpara de UV

Filtro de corte Filtro de xido de holmio Rendija Espejo 1

Diodo de muestra

Es posible la deteccin de longitud de onda simple o la deteccin de Celda de longitud de onda mltiple. flujo La calibracin de la longitud de onda se realiza automticamente utilizando un filtro de holmio.

Red de difraccin

Espejo 2 Diodo de referencia

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Detector de UV-VIS con capacidad de espectros

Lmpara de VIS Lentes acromticas Celda de flujo Matriz de diodos del detector

Lmpara de UV

Filtro de holmio Rejilla ptica Red de difraccin

Gracias al detector UV-VIS de matriz de diodos, es posible realizar medidas de espectros en lnea. Rango de longitud de onda de 190 - 900 nm. Resolucin de longitud de onda: hasta 1 nm. Calibracin de longitud de onda con filtro de xido de holmio.

27

Espectros en lnea - Detector UV-VIS

Espectros

Absorbancia

Longitud de onda

Tiempo

28

Representacin grfica de la isoabsorbancia

L o n g i t u d d e o n d a

La longitud de onda de adquisicin se puede optimizar en funcin de los espectros almacenados.

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HPLC prctica

En esta seccin aprender lo siguiente:

Cmo instalar un sistema de HPLC para realizar una inyeccin de muestra, incluidos los siguientes aspectos: Manipulacin del disolvente Preparacin de la fase mvil Cebado del HPLC Manipulacin de la columna - Equilibrio

Comprobacin del rendimiento del sistema

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Manipulacin del disolvente

Caractersticas del disolvente (especificaciones): Pureza Viscosidad ndice de refraccin Punto de ebullicin Toxicidad Transparencia de UV/lmite de UV Solubilidad

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Miscibilidad del disolvente

Nombre cido actico Acetona Acetonitrilo Benceno Alcohol butlico Tetracloruro de carbono Cloroformo Ciclohexano Ciclopentano Dicloroetano Diclorometano Dimetilformamida Dimetil sulfxido Dioxina Etilacetato Alcohol etlico Dietileter Heptano Hexano Alcohol de metilo Metiletilcetona I-Octano Pentano I-Alcohol proplico Dipropileter Tetracloroetano Tetrahidrofurano Tolueno Tricloroeteno Agua Xileno

Inmiscible Miscible

2-Propanol es un excelente disolvente intermedio

33

Lmite de UV del disolvente/Transparencia

Disolvente Acetonitrilo Agua Ciclohexano Hexano Metanol Etanol ter dietlico Diclorometano Cloroformo Tetracloruro de carbono Tetrahidrofurano Tolueno Lmite de UV (nm) 190 190 195 200 210 210 220 220 240 265 280 (220) 285

El lmite de UV es la longitud de onda en la que la absorbancia es igual a 1, medida en una celda de 1 cm con aire como referencia.

34

Preparacin de la fase mvil

Pasos principales: Medir el volumen apropiado de cada disolvente Mezclar los disolventes Aadir los tampones y los aditivos* Filtrar la fase mvil Desgasificar la fase mvil

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Cebado del sistema de HPLC

Muestreador Mezclador

Bombas

Detector

Disolventes

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Almacenamiento de la columna
Evitar causar cualquier dao fsico a la columna

Cerrar ambos extremos para evitar que se seque Guardar la columna bien enjuagada con el disolvente adecuado Registrar el historial de la columna
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Instalacin de la columna

Cada columna tiene una direccin de flujo definida. La direccin del flujo es la que indica la flecha, o la direccin del texto escrito en la columna. No cambiar la direccin del flujo, ya que disminuir el rendimiento de la columna.
Muestreador Mezclador

Bombas

Detector

Disolventes

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Equilibrado de la columna

Equilibrar con fase mvil No presionar en exceso la columna. De 5 a 10 volmenes de columna para equilibrado de fase inversa. Garantiza resultados reproducibles.

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Comprobacin de la columna
Las columnas nuevas deben incluir un certificado de rendimiento. Cada uso adicional deber documentarse, incluyendo:
Retropresin Fase mvil Temperatura Tipo de muestra Condicin de almacenamiento (disolvente)

En base a ese historial, la columna se puede comprobar con una mezcla de compuesto definida.

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Cuidado y manipulacin de la columna

Lavar la columna despus de usarla con disolventes seleccionados; eliminar de la columna los componentes de la muestra fuertemente retenidos. No guardar la columna en 100% de agua. Podrn desarrollarse microbios y obstruir la columna. No abrir la columna y volver a empaquetar el material si se desea mantener el rendimiento. Utilizar la columna a su velocidad de flujo ptima - evitar velocidades de flujo elevadas. No utilizar slice o fases enlazadas durante largos perodos a una temperatura elevada. Mantener el pH de la fase mvil en un rango apropiado para la columna.
41

Repaso

1. Est realizando un anlisis rutinario cuando se da cuenta de que se produce una perturbacin peridica en la lnea de base. La lectura de la presin flucta hacia arriba y hacia abajo. Qu ocurre? Cmo lo corregira?

42

Repaso

2. Ha decidido realizar un anlisis de fase inversa en un instrumento del laboratorio. El operador anterior no indica los disolventes utilizados por ltima vez en el instrumento. Pone agua en el canal A y enciende la bomba. No puede conseguir una lnea de base estable. Plantee cul es la causa posible de este problema.

43

Resolucin cromatogrfica y separacin

En esta seccin aprender lo siguiente:

Qu factores influyen en la resolucin entre los componentes de las muestras. Cmo influyen en la resolucin el factor de capacidad (factor de retencin), la selectividad y la eficacia. Cmo mejorar las separaciones.

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La principal preocupacin del cromatgrafo: la resolucin entre los picos cromatogrficos

R = Resolucin tRB - tRA R=2 wA + wB R = 1,176 tRB
mAU

tRA = Tiempo de retencin, componente A

tRB - tRA w1/2A + w1/2B tRB = Tiempo de retencin, componente B w = Ancho en la base

tRA
to

w1/2=Ancho a mitad de altura

tiempo

46

Valores de resolucin
0,4 0,5

0,6

0,7

Para reas de picos iguales, un valor R de 1,5 ofrece separacin de la lnea de base.
0,8 1,00 1,25

47

Calcular la resolucin entre el primer y el segundo pico cromatogrfico

DAD1 B, Sig=230,4 Ref =550,100 (DEMO\005-0102.D) mAU 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 min

0.747 1.022

2.569

5.849

Respuesta_________

48

Ecuacin de resolucin fundamental para la elucin isocrtica

R = 1/4

-1
Selectividad

k' 1 + k'
Capacidad

Eficacia

N: Nmero total de platos tericos disponibles; eficacia de la columna k: Factor de capacidad (factor de retencin), la funcin de retencin del pico La separacin relativa de los picos; la funcin de selectividad

49

Factores de la resolucin

Capacidad Selectividad

Eficacia

50
Americas' Technical Center (Centro tcnico de Amrica)

Capacidad-Retencin
R = 1/4 N x -1
Selectividad

k' 1 + k'
Capacidad

Eficacia
tR2 t R1 tO

Inyectar

El factor de capacidad (factor de retencin) es caracterstico de un compuesto especfico en una composicin de fase mvil, a una temperatura y en un tipo de columna determinados. El factor de capacidad compensa los efectos de las dimensiones de la columna y la velocidad de flujo. El factor de capacidad es igual al nmero de moles en la fase estacionaria dividido por el nmero de moles en la fase mvil.

k' = t R - t O tO
51

Efecto de la capacidad en la resolucin

Los cambios en k' tienen el mayor efecto

R
Rango ideal de k

Los cambios en k' tienen poco efecto en la resolucin

k' 1 + k'
Capacidad

10

12

14

16

k
La utilizacin de la retencin para aumentar la resolucin es ms eficaz cuando k se encuentra entre 0 y 5.
52

Capacidad - Composicin de la fase mvil

Composicin del disolvente ms dbil

mAU

60% acetonitrilo 40% agua

10

Tiempo (min.) Composicin del disolvente ms fuerte

La manera ms importante de cambiar la capacidad de un pico cromatogrfico es cambiar la composicin de la fase mvil: Cuando aumenta la fuerza de la fase mvil, disminuye el factor de capacidad de los eluyentes. En lo que respecta a la fase inversa, un aumento del 10% orgnico hizo disminuir el valor de k' en cada pico cromatogrfico en un factor de 2 o 3.

mAU

80% acetonitrilo 20% agua

10

Tiempo (min.)

53

Selectividad
R = 1/4
N

-1
Selectividad

k' 1 + k'
Capacidad

Eficacia

= 1,1

=1,4

=1,8

= kB kA

Composicin de la fase mvil Fase mvil pH de la fase mvil

Temperatura de la columna Efectos qumicos - Aditivos Fase estacionaria

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Parmetros que afectan a la selectividad

Cambio de composicin de la fase mvil

Disolventes ms fuertes IPA/Agua ACN/Agua

Disolventes ms dbiles MeOH/Agua

DISMINUCIN

AUMENTO No se sobrecarga fcilmente C-18 C-2

Cambio de la fase estacionaria

Se sobrecarga fcilmente

Fase estacionaria orgnica baja

Fase estacionaria orgnica alta

55

Cambio de fase estacionaria

1. Met Encefalina 2. Leu Encefalina 3. Angiotensina II 4. Neurotensina 5. Insulina (BOV) 6. Cadena de insulina B 7. Citocromo C 8. Mioglobina 9. Calmodulina 10. Anihidrasa carbnica

Tiempo (min) ZORBAX 300 SB-CN, SB-C3, SB-C8, SB-C18 (4,6 x 150 mm, P/N:883995.905, 883995.909, 883995.906, 883995.902) Fase mvil: 15-53% en 20 min. A: 5:95 ACN:Agua con 0,10% de TFA (v/v%). B: 95:5 ACN:Agua con 0,085% de TFA (v/v%) Inyeccin 10 l, 2-6 g proteina (en 6M guanidina HCI, pH 7.0), 1,0 ml/min., 35 C, detect. UV (215 nm)
Proporcionado de Loretta A. Sandoval

56

Efecto del termostato de la columna en la separacin

40 C

AB

10

65 C B A

5 Tiempo en minutos

10

57

Ajuste de la temperatura de la columna

Citocromo C Insulina (BOV) RNase

1/T (K)
58

Uso de la temperatura para mejorar la resolucin

Mejora de la resolucin
8 10

35 C
8

10

60 C

300 SB-CN

10 9

8 10

300 SB-C3

59

Eficacia
R = 1/4 N x -1 x k' 1 + k'
Capacidad

Eficacia

Selectividad

Respuesta del detector

Baja eficacia

Inyectar

Alta eficacia

Tiempo

60

Clculo de la eficacia
tR tR 2 N = 16 w = 5,54 W 1/2 B
tR

ht =2 p R A

HETP = L N N = Eficacia; Nmero de platos HETP = Altura equivalente a una placa terica L = Longitud de columna hp = Altura de pico A = rea de pico

Inyectar

Wi/2

WB Tiempo

61

Calcular la eficacia
DAD1 B, Sig=230,4 Ref =550,100 (DEMO\005-0102.D) mAU 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 min

0.747 1.022

2.569

Respuesta____________
62

5.849

Velocidades de flujo tpicas

d.i. mm (partculas de 5 um)

ml/min

4,6 3,0 2,1 1,0

2

1-2 0,4-0,8 0,2-0,4 0,05-0,09

d.i.2 d.i.1 velocidad de flujo1

velocidad de flujo2 =

63

Rendimiento mejorado con columnas tradicionales utilizando velocidades de flujo aumentadas

Zorbax SB-CN
mAU 30 20 10 0
LC: HP1090 Columnas: 4,6 x 150, 5 M Flujo: 1,0 ml / min. A: 0,1% TFA B: 97,5% MeOH: 2,5% H2O (0,1% TFA) Temp.: 30 C Detec.: 254 nm

G C

T A

F = 1,0 6 min

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=3

mAU 30 20 10 0 mAU 20 10 0 0 1 2 3 4 5

F = 1,5 4 min F = 2,0 3 min

6 7 8 min

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=3

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=3

01576S1.PPT

64

Aumento de la resolucin

Aumentar k'

Aumentar la eficacia

Aumentar la selectividad

65

Ejercicio

Describir qu componente de la ecuacin de la resolucin se ha cambiado en cada caso: N, k o ?. En cada uno de los casos, qu parmetro cambiara (es decir, composicin de fase mvil) para mejorar la separacin inicial?

Inicial

Variacin ?

Aumento ?

Aumento ?

t0

t
66

Ejercicio

mAU

tiempo

El anlisis se realiz en una columna C-8 de 100 x 4,6 mm con un d.i. de 10 um. La velocidad de flujo fue de 2 ml/min con 70/30 de alcohol IPA/agua. Enumerar las maneras de mejorar la separacin.
67

Ejercicio

1. Enumerar tres maneras de aumentar la retencin del componente de una muestra.

2. Enumerar cuatro maneras de disminuir el ancho de banda de los picos cromatogrficos. 3. Cules de estos parmetros afectan a la eficacia de una columna?
Fuerza de elucin Viscosidad de la fase mvil Tamao de partculas de la fase estacionaria Longitud de la columna Temperatura de la columna Volumen externo a la columna

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Elucin de gradientes

En esta seccin aprender lo siguiente:

En qu consiste el proceso de elucin de gradientes y cules son sus ventajas. Cmo optimizar una separacin de gradiente.

Consideraciones prcticas para establecer separaciones de gradientes.

70

El problema general de la elucin

Resolucin defectuosa de los picos que antes eluyen. Aumento del ancho de pico y descenso de la altura de pico en los picos que eluyen ms tarde. Tiempos largos de anlisis debido a un rango amplio de valores k'. Contaminacin de columnas con componentes de fuerte retencin.

Elucin isocrtica - La composicin de la fase mvil permanece constante durante el tiempo que tarda la muestra en eluir.

71

Elucin de gradientes - Solucin A

Elucin de gradientes - La composicin de la fase mvil cambia durante la separacin. Ventajas

Otros usos

Resolucin mejorada Mayor deteccin Capacidad para separar muestras complejas Tiempos de anlisis ms cortos Disminucin del deterioro de la columna debido a los componentes retenidos con fuerza Limpieza de la columna Anlisis de exploracin en el desarrollo de mtodos

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Separacin de gradiente de polipptidos

Caractersticas de gradientes Se utilizan dos disolventes para desarrollar el gradiente La fuerza de elucin aumenta con el tiempo Tener en cuenta la forma del gradiente Tener en cuenta la inclinacin del gradiente

Columna: Gradiente: Fase mvil:

ZORBAX 300SB-C3 5 m, 4,6 x 150 mm 15-35% B en 19 min. A: 95:5 H2O:ACN con 0,1% de TFA B: 5:95 H2O:ACN con 0,085% de TFA

12

6
3 5 7 8
1. Leucina Encefalina 2. Angiotensina 3. RNasa A 4. Insulina 5. Citocromo C 6. Lisozima 7. Mioglobina 8. Anihidrasa carbnica

10 12 Tiempo (min.)

14

16

18

20
73

Qu ocurre durante el anlisis de un gradiente?

% Org

Aumento del % de modificador orgnico

100

75
50 25 0 0 10 Tiempo (min) 20 30

Cambio de particin a fase mvil

k'

Aumento de la velocidad del compuesto

74

Anlisis cuantitativo

En esta seccin aprender lo siguiente:

Los principios del anlisis cuantitativo.

76

Anlisis cuantitativo

En la cuantificacin se utilizan tres principios diferentes:

Calibracin de patrn externo Calibracin de patrn interno Adicin de patrn %rea %Norm
R e s p u e s t a

3 4 6

Tiempo

Cantidad de compuesto 5?

77

Calibracin de patrn externo

La calibracin de tres niveles es un requisito mnimo para demostrar la linealidad de la curva de calibracin
Respuesta

Calibracin de 3 niveles

3 concentraciones

Cantidad

Cantidad ( Muestra ) = Respuesta x RFx M D

78