BIOTECNOLOGA ANIMAL

ANIMALES MODIFICADOS GENETICAMENTE TECNICAS DE OBTENCIN

Blga. Maribel Huatuco Lozano

Microinyeccin pronuclear
Se extraen vulos de hembras en las que se ha inducido una superovulacin y han sido fertilizadas in vivo, o bien se fertilizan posteriormente in vitro. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el vulo fecundado y se inyecta en uno de sus proncleos una solucin que contiene muchas copias del transgn. Posteriormente, estos vulos fecundados y microinyectados se introducen en madres receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la tcnica de la transferencia de embriones. Finalmente, los recin nacidos son examinados para ver si en ellos se ha producido la incorporacin del transgn.

Microinyeccin de DNA en ovocito fertilizado.

Microinyeccin pronuclear
La microinyeccin es un mtodo para generar animales transgnicos muy ineficiente, debido a que conlleva la integracin aleatoria del gen forneo en el genoma receptor con las siguientes consecuencias: El transgn se introduce en el genoma receptor de forma aleatoria, por lo que slo en un pequeo porcentaje se sita en el lugar adecuado para conseguir una buena expresin en el animal transgnico. No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma el transgn (no son transgnicos, por tanto). El gen exgeno puede insertarse en un lugar errneo, por ejemplo en medio de un gen del genoma receptor, interrumpindolo y causando su mutacin y, con ello, la muerte del embrin o alteraciones en el animal transgnico nacido.

Etapas en la produccin de un ratn transgnico

Vectores virales
Un mtodo alternativo es la transgnesis viral: el uso de virus recombinantes para introducir genes en el embrin. Sin embargo, los retrovirus estn sometidos a modificacin epigentica y la expresin retroviral se corta durante la embriognesis o es breve despus del nacimiento.

Estos vectores tienen la capacidad de atravesar la membrana nuclear y alcanzar el genoma de las clulas, cualquiera que sea la fase del ciclo celular en la que se encuentren.

Vectores virales

Embriones pre-implantacin son expuestos in vitro a soluciones concentradas de virus recombinantes (virus a los que previamente se les ha introducido el gen de inters), o son incubados sobre una monocapa de clulas infectadas con estos virus. A continuacinde la exposicin a los virus, los embriones infectados in vitro son transferidos a hembras receptoras para completar la gestacin.

Transferencia de genes mediada por esperma

Transferencia de genes mediada por esperma

Obtencin del eyaculado a partir de animales previamente

seleccionados.

Conversin

de los espermatozoides del eyaculado en clulas transgnicas mediante la incubacin conjunta del esperma con el plsmido que contiene el DNA de inters.

Transferencia de genes mediada por esperma

En este proceso se suceden las siguientes etapas: a) la unin del DNA exgeno a la superficie del espermatozoide; b)seguida de la internalizacin espermatozoide; de este DNA en el

c) y, posteriormente, la integracin del transgn en el genoma del espermatozoide (hecho que se ha demostrado que no ocurre al azar, sino en lugares concretos del genoma).

Transferencia de genes mediada por esperma

d) Inseminacin artificial, con el esperma transgnico, de hembras previamente sincronizadas (en cerdos) o inyeccin intracitoplasmtica de esperma (ICSI, intracytoplasmic sperm injection) transgnico en ovocitos para generar embriones que posteriormente sean transferidos a hembras sincronizadas para gestarlos(en ratones).

Gene Targing
La tcnica de gene targeting genera una modificacin gentica dirigida, especfica y controlada, basada en la introduccin o en la eliminacin de DNA en lugares precisos del genoma, utilizando la recombinacin homloga de esas secuencias de DNA forneas con los genes autctonos. Esta tcnica requiere la utilizacin de clulas madre embrionarias (ES cells, embrionic stem cells), que son pluripotentes y que, una vez modificadas genticamente, son inyectadas en blastocistos para generar embriones quimera.

Gene Targing
a) b) c) d)

Obtencin de embriones de ratn en fase de blastocistos. Aislamiento de clulas madre embrionarias (ES) de los blastocistos. Cultivo in vitro de las clulas ES.

Introduccin de la modificacin gentica, mediante

gene targeting, en las clulas ES en cultivo.

Gene Targing

e) Seleccin de clones individuales de las clulas ES en cultivo y realizacin de rplicas para mantener stock congelado a 80C y para screening de DNA genmico. f) Screening de DNA genmico de los clones de clulas ES, para comprobar cul ha conseguido introducir la modificacin gentica en el sitio deseado, as como anlisis del cariotipo y de la presencia de micoplasmas.

Gene Targing

Generacin de los embriones quimera: se inyectan las clulas ES, que portan la modificacin gentica deseada, en la cavidad de un blastocisto (figura 6). h) Transferencia de estos blastocistos resultantes, con ES modificadas y ES originales, a hembras sincronizadas para gestarlos.

i) Realizacin de cruces entre machos y hembras heterocigotos para el gen modificado, con el fin de obtener homocigosis en dicho gen.

Inyeccin de clulas ES en blastocistos.

Transferencia nuclear
En la transferencia nuclear (NT)se utiliza el ncleo de una
clula procedente del animal que queremos clonar para introducirlo en un ovocito receptor previamente enucleado.

Enucleacin de un ovocito

Transferencia nuclear

Este ovocito se activa elctricamente, o por otros mtodos, para que reprograme al ncleo y ste comience la generacin de un embrin que tendr un 98-99% de la informacin gentica procedente del ncleo del animal a clonar y un 1-2% procedente del DNA contenido en las mitocondrias y otras organelas presentes en el citoplasma del vulo receptor.

Aplicaciones de la transgnesis
Modelos de enfermedad Es posible introducir genes mutantes de humanos en ratones, provocando as que padezcan las enfermedades humanas, con el fin de encontrar tratamientos sin tener que experimentar con seres humanos. Mejora el ganado Los animales de cra se pueden modificar de forma que tengan un crecimiento mas rpido, desarrollen menos grasas, transformen mas eficazmente los alimentos y resistan a las enfermedades.

 Produccin de medicamentos moleculares

Los animales de cra se utilizan para producir medicamentos y nutraceuticos. Las ovejas, cabras y vacas transgnicas funcionan como biorreactores para producir protenas humanas importantes en la leche.

Injertos de clulas, tejidos u rganos: Los injertos de tejidos de animales transgnicos en humanos siguen evolucionando y algunos cientficos quieren comenzar a implantar rganos enteros.

 EJEMPLOS:
En la Universidad de Pensilvania se obtuvieron cerdos transgnicos que portan el gen bovino que codifica la hormona del crecimiento. Estos animales, en efecto, ganaron peso ms rpido que los cerdos normales con la misma alimentacin. Sin embargo, sufrieron graves trastornos fsicos (artritis, lceras, baja fertilidad) debido al exceso de hormona en sangre. Este experimento no tuvo aplicacin en la prctica.

 Ya en 1994 se obtuvo por un grupo de cientficos

un salmn transgnico en cuyos huevos fertilizados se haba inyectado un transgen de hormona del crecimiento. Al cabo del ao su peso era 10 veces superior al normal. En algn caso el ndice de crecimiento era 37 veces mayor que el normal. Es el famoso Sumosalmon, sin aplicacin a la prctica por el momento.

La modificacin gentica ms interesante en animales busca conseguir vacas que incluyeran en la leche protenas de la leche humana con efecto protector, como la lactoferrina. Sin aplicacin prctica por el momento.

VENTAJAS
La caracterstica requerida puede elegirse con mucha mas precisin y as los rasgos adicionales no deseados pueden reducirse a un mnimo Se puede establecer una caracterstica deseada en una generacin, mientras que en el caso de la reproduccin selectiva suelen ser necesarias muchas generaciones. Existe la posibilidad de crear nuevas caractersticas (cruces de especies) Se pueden introducir nuevas caractersticas en animales para reducir sus necesidades de suplementos alimenticios y tratamientos mdicos.

RIESGOS
Salud del animal La insercin de un transgn puede alterar la expresin del genoma (y por tanto las funciones del animal) Transmisin de virus Esto es un tema particularmente preocupante en el caso de la reproduccin de animales como donantes de tejidos para los xenotrasplantes. Diseminacin Los transgenes podran transmitirse a la poblacin silvestre a travs de la reproduccin normal.