ALUMNOS: Buenda Ros Alma Rosa Cervantes Mrquez Sandra Gmez Bravo Claudia Patricia Hernndez Prez Mario

Hernndez Ros Tlakaelel Jurez Gmez Luz Nallely

Melgoza Rangel Ivonne Moro Castaeda Anglica Pardnez Martnez Nayeli Reyes Santos Mnica Prez Vzquez Enrique

Laboratorio de Microbiologa Industrial Grupo:2901 Semestre: 2013-2

Objetivo
Comparar diferentes fuentes de nitrgeno necesarias para el crecimiento microbiano utilizando mtodos analticos para evaluar dicho crecimiento.

Medio de cultivo
Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la sntesis de material celular y la produccin de metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos qumicos, de composicin conocida, para la obtencin de medios de cultivo, que son medios sintticos, pero en las fermentaciones industriales los medios han de ser lo ms baratos posibles.

Crecimiento microbiano
Se entiende por crecimiento la sntesis de nuevos materiales celulares, cuya consecuencia aparente es un aumento en el tamao o volumen celular. En el caso de microorganismos, se refiere a la multiplicacin celular. En este sentido es como se ha tomado para analizar las fases diferentes que comprende el fenmeno de la multiplicacin microbiana.

Medios de cultivo para fermentacin a nivel industrial

Agua

Oxigeno (si es aerbico)

Energa

Los m.o. requieren

Vitaminas Carbn

Elementos minerales

Nitrgeno

Un medio de cultivo a grande escala, debe utilizar fuentes de nutrientes baratos y presentar los siguientes criterios:

Producir el mximo rendimiento de producto o biomasa por gramo de sustrato usado. Producir la mxima concentracin de producto o biomasa. Permitir el mayor ndice de producto formado Habr un mnimo rendimiento de productos no deseados. Ser barato, de calidad consistente y disponible a lo largo del ao.

Causar la menor cantidad de problemas en la aeracin, agitacin, extraccin, purificacin.

Se debe recordar que

El medio seleccionado afectar el diseo del fermentador usado. El fermentador afecta la composicin del medio. Un medio con una alta viscosidad requerir de una agitacin efectiva. El medio puede ocasionar variacin de pH, formacin de espuma, potencial redox y en la morfologa del organismo.

Medios de crecimiento

Deben cumplir con los requerimientos: Crecimiento Formacin de productos Suministrar energa para la sntesis de metabolitos Mantenimiento celular.

Macronutrientes, (g/L) C, N, S, P, K y Mg

Micronutrientes o elementos trazas (mg/L o g/L)) Sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co

Factores de crecimiento
vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc.

Formulacin del Medio

Fuente de Carbono y energa

Fuente de Nitrgeno

Otros requerimientos

Clula biomasa

Productos

CO

H2O

Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989

C, H, O, N, S, P, Mg, K

Factores de crecimiento
ELEMENTOS NECESARIOS

Elementos traza: Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Mo, B

Agua

Oxigeno

Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989

Componentes elementales en BACTERIAS, LEVADURAS, HONGOS

Elemento Bacterias Levaduras Hongos

Carbono Hidrogeno Nitrgeno Fosforo Sulfuro Potasio Sodio Calcio Magnesio Cloruro Hierro

50-55 7 12-15 2.0-3.0 0.2-1.0 1.0-4.5 0.5-1.0 0.01-1.1 0.1-0.5 0.5 0.02-0.2

45-50 7 7.5-11 0.8-2.6 0.01-0.24 1.0-4.0 0.01-0.1 0.1-0.3 0.1-0.5 --0.01-0.5

40-63

7-10 0.1-1.5 0.1-0.5 0.2-2.5 0.02-0.5 0.1-1.4 0.1-0.5 --0.1-0.2

Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989

Funcin de los componentes de algunos medios de cultivo

Agua
Es el mayor componente en los medios de fermentacin Actividad de agua (Aw) cantidad de agua disponible en el medio. Aw 0.75 Halobacterium sp. y E. coli 0.96 pH y la cantidad de sales disueltas

La presencia de sulfato de calcio CaSO4 en el agua favorece el sabor amargo de la cerveza Pilsen

Fuentes de energa
La energa de crecimiento proviene de la oxidacin de los componentes del medio o de la luz La mayor parte de las bacterias que se emplean en la industria son quimiototrofas Las fuentes ms comunes de energa sern las fuentes de carbono, tales como carbohidratos, lpidos y protenas.

Algunos microorganismos tambin emplean metano o metanol como fuentes de carbono y energa

Methanobacterium sp

Fuentes de carbono
Es comn en la prctica el uso de carbohidratos como la fuente de carbono en los procesos de fermentacin. El hidrato de carbono ms ampliamente disponible es el almidn de maz, tambin es obtenido de cereales, papa y tapioca. Algunas fuentes de almidn pueden ser hidrolizadas para obtener glucosa.

Aceites vegetales comerciales (maz, soya, olivo) se pueden incluir en el medio por dos posibles razones Pueden utilizarse como una fuente de carbono principalmente como oleico, linolico y cido oleico Antiespumante en asociacin con un tensoactivo

Existe un inters creciente en carbono que contiene otros materiales.

Alcoholes, cidos orgnicos simples y alcanos.

stos compuestos se pueden obtener en una forma pura, lo que simplificar la subsiguiente recuperacin y de purificacin. El metano, metanol y n-alcanos han sido utilizados como sustratos para la produccin de biomasa. El metanol es empleado como sustrato por Methylofilus methylotrophus Alcanos han sido utilizados en la produccin de cidos orgnicos, aminocidos, vitaminas, cofactores, enzimas, antibiticos y protenas

Factores que influyen en la eleccin de fuentes de carbono

El principal producto de un proceso de fermentacin es el que determina la eleccin de la fuente de carbono. Por ejemplo en la obtencin de cidos ctricos se deben eliminar iones metlicos que vienen como impurezas en algunos hidratos de carbono. La eleccin de la fuente tambin puede ser influenciado por la legislacin gubernamental, en Escocia la produccin de whisky slo se realiza con cebada de malta, agua y levadura.

Reacciones de pardeamiento y formacin de melanoidinas en la preparacin de medios de cultivo afecta el crecimiento de las bacterias.
Proceso de esterilizacin, el almidn se gelatiniza al calentar, por lo que se utiliza slo al 2%

La influencia de la fuente de carbono en los productos de formacin

El crecimiento rpido es debido al metabolizar rpidamente altas concentraciones de azcar, esto se asocia a menudo con la baja productividad de metabolitos secundarios como antibiticos
El problema se resolvi con la adicin de un azcar ligeramente difcil de metabolizar como lactosa

El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.

Fuentes inorgnicas
Sales de amonio Nitratos Amoniaco

Fuentes orgnicas
Aminocidos

Protena

Urea

Factores que influyen en la eleccin de las fuentes de Nitrgeno

Existen mecanismos de control para la nitrato reductasa, la cual se involucra en la conversin de nitrato a ion amonio En mezclas de fuentes de nitrgeno, los componentes individuales de nitrgeno pueden influir en la regulacin del metabolismo

Fermentacin
Mejores Fuentes de Nitrgeno para algunos Metabolitos Secundarios Penicilina Bacitracina Riboflavina Rifamicina Butirosina Liquido de Maceracin de Maz Granos de Maz Digerido Pancretico de Gelatina Harina de Soya, (NH4)2SO4 Sangre de Carne Seca, Hemoglobina con (NH4)2SO4 Harina de Soya

Polienos

Minerales
Adicionados Fosforo Potasio Azufre Calcio Cloro Impurezas Cobalto Cobre Hierro Manganeso Molibdeno Zinc

Intervalo tpico de concentracin de componentes minerales

Componente KH2PO4 MgSO47H2O KCl CaCO3 FeSO44H2O Intervalo 1.0-4.0 0.25-3.0 0.5-12.0 5.0-17.0 0.01-0.1

ZnSO48H2O
MnSO4H2O CuSO45H2O Na2MoO42H2O

0.1-1.0
0.01-0.1 0.003-0.01 0.01-0.1

VITAMINAS
Fuentes de carbono y nitrgeno Vitamina pura

Reciclaje de nutrientes

Soluciones Amortiguadoras
Compuesto especifico para actuar como buffer pH 7.0 Controlado por hidrxido de sodio o amonio

Precursores

Ayuda a regular la produccin de los microorganismos.

Mejoramiento en el rendimiento de la penicilina.

Licor de maz.

El precursor formara parte de la estructura de producto obtenido.

Inhibidores

Es eficaz para aumentar el rendimiento del producto deseado.

Aumenta la permeabilidad de la pared celular.

Produccin de glicerol.

Producto

Inhibidor

Principal efecto

Microorganismo

Glicerol

Bisulfito de sodio

Disminucin en la produccin de acetaldehdo

Saccharomyces cerevisiaea

Tetraciclina

Bromuro

Baja formacin de Clortetraciclina

Streptomyces aureofaciens

cido glutmico

Penicilina

Permeabilidad de la pared celular

Micrococcus glutamicus

Inductores
Enzimas inducidas son sintetizadas en respuesta a la presencia del ambiente del inductor.

Normalmente es el sustrato o un compuesto estructuralmente relacionado.

Los carbohidratos disminuyen el proceso catablico.

REQUERIMIENTOS DE OXIGENO

El oxgeno es un requerimiento esencial en la produccin de metabolitos y su control influye mucho en la tasa de crecimiento de microorganismos.

El medio puede influir en la disponibilidad de oxgeno de las siguientes maneras: Metabolismo rpido Reologa Antiespumantes

Metabolismo Rpido Diversos factores nutricionales alteran la tenencia de oxgeno Si la fuente de carbono es el azcar se requerir una mayor cantidad de oxgeno. Se puede mejorar realizando cambios en la formulacin del medio

Reologa

Se puede modificar la viscosidad en un medio de cultivo aadiendo carbohidratos como almidn lo cual produce un cambio reolgico en el medio

Antiespumantes La formacin de espuma es un problema en la mayora de los procesos metablicos El uso de antiespumantes es lo mas ideal para eliminar este problema. Algunos espumantes son steres, cidos grasos, siliconas y algunos alcoholes

Mtodos para evaluar el crecimiento microbiano

Mtodos para evaluar el crecimiento microbiano

Masa celular o biomasa

Nmero de microorganismos

Determinacin de la masa celular o biomasa

Peso seco

Directos

Peso hmedo Volumen hmedo Determinacin de nitrgeno total

Indirectos

Espectrofotometra

Radiacin IR
Toledo R. Daniel. Determinacin del valor nutritivo y funcional de tres clones de Araz y seis de Boroj y evaluacin para el proceso de obtencin de pulpas pasteurizadas y congeladas. [tesis Ingeniero Agroindustrial]. Ecuador, Escuela Politcnica Nacional, 2010.

Determinacin del nmero de microorganismos

Cmara de Neubauer

Cuenta total microscpica

Cmara de Petroff

Directos

Vaciado en placa Cuenta viable

Medicin lineal o radial Nmero ms probable

Extensin en placa
Tincin con azul de tripano

Indirectos

Turbidimetra Nefelometra

Determinacin de azcares reductores

Se basa en la reduccin de 3,5-dinitrosaliclico a cido 3-amino-5-nitrosaliclico por el grupo carbonilo libre de los azcares reductores.

Lectura 540 nm

Densidad ptica (dispersin de la luz)

Utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos Pueden llevar a resultados errneos. Dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue: 2007.

Turbidimetra
Mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. El cambio de luz se mide en %T Tambin se determina como Absorbancia (densidad ptica), utilizada para graficar el crecimiento bacteriano.
Tortora GJ, Funke GR, Case Cl. Introduccin a la Microbiologa. 9 ed. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2007.

 Soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. En soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo.
Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue: 2007.

Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue: 2007.

 Ventajas: Se puede conocer el nmero de MO dividiendo el peso del cultivo/ peso seco de la clula individual. Desventajas: Se necesita un mnimo de 25 mL de cultivo relativamente denso. Los componentes voltiles de la muestra pueden perderse. La muestra puede recuperar humedad. Dao a la muestra.

MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO SEMILLA Glucosa Fosfato dibsico de potasio Fosfato monobsico de potasio Peptona de casena Sulfato de amonio Agua de la llave Ajuste el pH a 5.5 MEDIO DE PRODUCCIN 40g Glucosa 10 g Fosfato dibsico de potasio Fosfato monobsico de 10 g potasio 10 g Fuente de nitrgeno* 15g Agua de la llave 1 L Ajuste el pH a 5.5 *Fuente de Nitrgeno
1. 2. 3. 4. 5. 6. Sulfato de amonio Extracto de malta Extracto de levadura Peptona de casena Urea Nitrato de sodio

40 g 10 g
10 g 10 g 1L

PROPAGACIN
Tomar asadas de Candida utilis Inocular matraz con medio semilla Incubar en agitacin de 200 r.p.m a 28C por 24 hs.

Incubar con agitacin de 200 r.p.m. y 28C durante 96 hs.

Inocular con 1 mL de cultivo con medio semilla

Preparar 100 mL de medio de produccin para cada fuente de nitrgeno

Agitar el matraz

Tomar muestra de 10 mL con pipetas esteriles a las 0, 24, 48, 72, 96 hs de incubacin

Colocar en tubos con tapa de rosca y guardarlas en congelacin

DETERMINACIN DE DENSIDAD PTICA Y PESO SECO

Tomar 5 mL de cultivo de cada muestra Colocar en tubo de ensayo Centrifugar 5 min a 3000 r.p.m. Separar sobrenadante y guardar para DNS

Centrifugar mismas condiciones

Transferir la suspensin a tubo de ensaye llevado a peso cte

Determinar densidad ptica a 540 nm con blanco de agua destilada

Agregar 5 mL de solucin salina para resuspender

Desechar sobrenadante

Llevar paquete celular a peso cte. a 70C

DETERMINACIN DE PESO HMEDO

Tomar 1 mL de cultivo de cada muestra Colocar en tubo de ensaye previamente pesado Centrifugar 5 min a 3000 r.p.m. Retirar sobrenadante Pesar tubo con sedimento Registrar peso de masa celular

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO DNS

Preparar el DNS por lo menos 24 horas antes de utilizarse Colocar en tubo de ensayo 1 mL de sobrenadante Agregar 1 mL de DNS y homogeneizar

Agregar 8 mL de agua destilada

Inmediatamente poner en agua fra

Llevar mezcla a bao de agua a ebullicin durante 5 min.

Determinar densidad ptica a 575 nm con agua destilada como blanco

Realizar lo mismo para cada solucin de la curva de glucosa

Curva estndar de DNS

Solucin estndar de glucosa 1 g/L No tubo 1 2 3 4 5 6 mL de solucin estndar 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1,.0 mL de agua destilada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Concentracin mg/mL 0 200 400 600 800 1000

Referencias
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989 Toledo R. Daniel. Determinacin del valor nutritivo y funcional de tres clones de Araz y seis de Boroj y evaluacin para el proceso de obtencin de pulpas pasteurizadas y congeladas. [tesis Ingeniero Agroindustrial]. Ecuador, Escuela Politcnica Nacional, 2010. Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue: 2007. Tortora GJ, Funke GR, Case Cl. Introduccin a la Microbiologa. 9 ed. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2007.