La cartometra de flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparametrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin

de partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. La citometra de flujo es una tecnologa (proceso) que permite la medida simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sola clula. Estas medidas son realizadas mientras las clulas (partculas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo, a travs del aparato de medida en una corriente de fluido

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE : Fluidos: para introducir y restringir las clulas para anlisis ptica : una fuente de excitacin y un sistema coleccin para generar y recoger las seales luminosas. El sistema de excitacin consiste en un lser, lentes y prismas para dirigir el rayo. El sistema de coleccin consiste en espejos pticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda hacia detectores pticos determinados. Electrnica: para convertir las seales pticas en seales electrnicas proporcionales y digitalizarlas para anlisis computacional. SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumtico y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensin celular atravesar la cmara de flujo. SISTEMA OPTICO: Lser (Argn con luz monocromtica de 488nm , filtros , lentes y detectores. SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en seales elctricas y las procesa para su anlisis.

PARAMETROS Caractersticas Morfolgicas de la clula : tamao y complejidad del citoplasma Caractersticas antigenicas de la clula : Inmunofenotipo. PARAMETROS FISICOS Su tamao relativo (forward scatter-FSC) Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC). FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3) Determinacin cuantitativa de caractersticas antignicas, bioqumicas y biofsicas de clulas individuales

SEALES DE DISPERSION Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ngulo cnico pequeo (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamao de la partcula que produce la dispersin. La luz es desviada a bajos ngulos entre 1 y 10 grados Generalmente proporcional al tamao celular Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en direccin delantera Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular. Luz es desviada a altos ngulos Proporcional a la granularidad de la clula y su complejidad Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.

Es el proceso para determinar marcadores expresados en la superficie celular. Esta deteccin se hace empleando anticuerpos monoclonales antgeno-especficos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar. Para esto, es necesario aislar previamente las clulas a analizar ( por ejemplo linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las clulas son luego estimuladas a producir los marcadores ponindolas en contacto con un antgeno capaz de estimular su sntesis. Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya funcin es impedir que las clulas expulsen las citoquinas que estn sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior. Despus las clulas son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos especficos. Una vez realizado este ltimo procedimiento, las clulas estn listas para ser ledas en el citmetro .

Los numerosos anticuerpos contra las molculas de las clulas leucmicas, la alta calidad y diversidad de fluorocromos y los avanzados equipos de cmputo que forman parte de los citmetros modernos, han hecho de la citometra de flujo un poderoso mtodo de inmunotipificacin.

La citometra de flujo provee datos de inmunofenotipificacin y/o ciclos de DNA, dependiendo de la informacin deseada y de la metodologa. Los estudios de inmunotipificacin son ms utilizados para la evaluacin de tejidos hematolgicos o linfoides. Adems junto con los datos de la inmunotipificacin, se obtiene informacin en relacin al tamao de la clula (por la luz emitida) y la complejidad interna (90 grados de luz emitida). Por la seleccin independiente de las poblaciones celulares para la evaluacin, los resultados de inmunotipificacin sobre las respectivas poblaciones pueden ser extrados sin procedimientos adicionales. La citometra de flujo no es favorable para la evaluacin de neoplasmas no hematopoyticos, sin embargo la carencia de expresin del CD-45 (antgeno leucocitario ms comn) sobre una poblacin debe ser tenida en cuenta como sospecha de otro proceso. Aproximadamente el 80% de los linfomas no Hodgkin son derivados de las clulas-B monoclonales. Caractersticamente los linfomas de clulas-T podran expresar menos de una variedad de antgenos de clulas-B y expresar inmunoglobulinas de cadenas livianas kappa o lambda, pero aproximadamente el 5% al 10% de los linfomas son negativos en su superficie para inmunoglobulinas.

Cuando se considera la posibilidad de un neoplasma por precursores granulociticos/monociticos se demuestra por la expresin de CD13, CD14 o CD33. Adems la expresin de CD45 es caractersticamente ms dbil que aquella observada tpicamente en los neoplasmas linfoides. La prdida de reactividad para otros marcadores de linaje de clulas T o B es tambin probable.

Es el ms comnmente utilizado para la evaluacin de linfomas y leucemias, donde CD es igual a CLUSTER-DESIGNATION 1. Antgenos asociados a Clulas-T: CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7,CD8, receptores de clulas-T (TCR) alfa- beta, TCR gama-delta, citoplasmtico CD3. 2.Antgenos asociados a Clulas-B: CD10 (CALLA), CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD79b, CD103, Ig. total, Kappa, Lambda, Ig.G, Ig.M, Ig.D, Ig.A, FMC-7, Kappa Citoplasmtica, Lambda Citoplasmtica.

3. Antgenos Mieloides/Monociticos: CD11b, CD13, CD14 (Mo2), CD14 (MY4), CD15, CD33, CD117(C-kit), Mieloperoxidasa. 4.Antgenos Micelneos: CD9, CD11c, CD16, CD25, CD30, CD34, CD38, CD41, CD42b, CD45, CD56, CD57, CD61, HLD-Dr, TdT, Glicoforina.

 Se realiza una suspensin de las clulas y se marcan con anticuerpos conjugados con flurocromo, se lavan y se analizan en el citmetro de flujo lser. Se utilizan paneles de anticuerpos para cuantificar el nmero de clulas B, clulas T y clulas mielomonociticas. La clonacin de las clulas-B es evaluada con las cadenas livianans de inmunoglobulinas mientras que la clonacin de las clulas-T es interferida por la expresin anormal de los antgenos de las clulas-T.