VIABILIDAD Y CULTIVABILIDAD

Dra. Carmen Wacher Depto de Alimentos y Biotecnologa Facultad de Qumica UNAM

NO TODOS LOS MICROORGANISMOS SE PUEDEN CULTIVAR

Falta de medios de cultivo adecuados:
Nutrientes Concentracin de nutrientes Impurezas en ingredientes

Tiempos de crecimiento prolongados Asociacin con otros microorganismos

ESTADO VIABLE PERO NO CULTIVABLE

Bacterias viables, pero no forman colonias. Vibrio cholerae, E. coli Estado de latencia Condiciones: Escasez de nutrientes, cambios en el pH Temperatura baja, cambios en la salinidad Presin alta

CLULAS VNC
(Kell et al., 1998)

FENMENOS ECOFISIOLGICOS RELACIONADOS CON EL CULTIVO DE MOO (Giraffa y Neviani, 2001)

CLULAS VIABLES Condiciones ambientales estresantes (pH, T, etc) Sanas, cultivables En todos los medios Sanas no cultivables en Todos los medios Con dao subletal Cult en medios no selectivos No cult en medios Selectivos Estresadas Cult en medios no selectivos No cult en medios select CLULAS NO VIABLES

Estado de crecimiento Activo Estado latente Vivas, no crecen

Estado VNC Estado atenuado Tcnicas de reactivacin Reparacin y Resucitacin a edo sano CLULAS VIABLES

Autlisis celular

Autlisis celular

ESTADOS FISIOLGICOS DE LAS CLULAS (Kell et al., 1998)

DIAGRAMA PARA DISCRIMINAR ESTADOS FISIOLGICOS DE LAS CLULAS (Kell et al., 1998)

 No cultivable An no cultivadas quietas, miniclulas, de crecimiento lento somniclulas Estrategia para sobrevivir en condiciones hostiles. Se conoce menos del 1% de los microorganismos que existen

Clulas vivas o muertas?

 No son clulas daadas

Capaces de regresar al estado cultivable Recuperan edo cultivable cuando pasan por animales. Patgenos: capaces de causar enfermedad

MTODOS PARA LA DETECCIN DE VNC

Anaranjado de acridina:
Filtrar muestra a travs de membrana 0.45 micras Teir con anaranjado de acridina Microscopio de fluorescencia: Rojas (DNA) muertas Verdes (RNA) vivas

Bacterias, anaranjado de acridina

Clulas espaguetti
Tincin con acido nalidxico: Clulas vivas alargadas: Crecen pero no se separan
Clulas muertas mismo tamao

Membrana energizada
Rodamina 123 Membrana citoplsmica energizada

Exclusin pasiva de colorante

Barrera de permeabilizacin intacta Yoduro de propidio, bromuro de etidio, etc.

Viabilidad, yoduro de propidio, citometra de flujo (Beckman)

MTODOS PARA CULTIVAR MOO AN NO CULTIVABLES

(Stevenson et al., 2004)

Medios slidos con pocos nutrientes Perodos de incubacin largos (>30 das) Proteccin de perxidos exgenos Inclusin de cidos hmicos y de compuestos de quorum sensing Incubar en presencia o ausencia de aire, o en atmsfera de CO2

VIDA Y MUERTE DE BACTERIAS

Viabilidad = cultivabilidad Bacterias cultivables Inanicin u otro estrs Edo prolongado de sobrevivencia: No se detectan por cultivo Mtodos diferentes

La hiptesis del estado viable pero no cultivable (VBNC)

Bacterias en hambruna prolongada:
disminuye cuenta de clulas viables Cuenta microscpica directa permanece constante Entonces clulas en edo VBNC: Vivas, pero no se pueden cultivar

Resucitacin
Para confirmar hiptesis de VBNC, necesario resucitar Conversin clulas no cultivables en clulas cultivables Sin cambios en nmeros

Adicin de nutrientes: Presencia de una pequea cantidad de clulas viables y stas son las que se desarrollan cuando se aaden nutrientes.

La prueba de recuperacin de cultivos mixtos (MCR)

Mtodo de recuperacin de cultivos mixtos: Clulas NC en medio que soportara crecimiento Introducir nm pequeo de clulas cultivables Permitir que crezcan Si las C resucitan a las NC, ambas crecen Se pueden diferenciar NC de C Forman cols diferentes en medios con agar Adicin de nutrientes no tiene efecto en clulas no cultivables

Clulas VBNC en ambientes naturales

Eliminadas por microbiota indgena Entonces poco probable que persistan Patgenos En ambiente, edo VBNC, no se detecta Causa enfermedad a quien lo consuma No se ha demostrado fehacientemente la infectividad de clulas en edo VBNC

Entonces qu pasa?
Otro modelo: Clulas se convierten en no cultivables por deterioro celular, estas clulas son moribundas Necesario contar con mtodos para estudiar cada clula o subpoblacin de clulas por separado Deteccin in situ de carbonilacin de protenas (ensayo inmunolgico, deteccin a nivel celular) Centrifugacin con gradiente de densidades

Deteccin de carbonilacin in situ

A,D,G: Sin tratar con H2O2 BEH: tratadas con H2O2 C,F,I: clulas estresadas con H2O2, tratadas con proteinasa K A,B,C: Imgenes de transmisin D,E,F: Emisin de fluorescencia de Ac marcados con fluorescencia. G, H,I: slot blot de niveles de carbonilo en extractos proteicos Grfica: Anlisis estadstico de seal de carbonilos en 200 cls no tratadas (verde) y 200 tratadas (rosa) LA SEAL REFLEJA DAO OXIDATIVO

Efecto de clulas en crecimiento vs inanicin en carbonilacin

A,C: clulas en crecimiento B,D: clulas en hambruna A,B: imgenes transmisin C,D: anticuerpos fluorescentes E: Anlisis de intensidad de carbonilos de cls tratadas y no tratadas F: Cls crecimiento y G: cls hambruna Viabilidad con sistema LIVE/DEAD EDO ESTACIONARIO INDUCE MODIFICACIN OXIDATIVA

Separacin y anlisis de clulas c y nc

Carbonil cultivab.
LD=C, HD=NC HD ms carbonil

Algunas prot se oxidan slo en NC

Dao oxidativo en NC: ribosoma y prot periplasm

Regulones de estrs
Mayores en clulas NC: Sigma S Promotores dependientes de Sigma S: sodCp, katEP, uspBP Promotor soxS Entonces activacin de reguln SoxRS PdnaK, regulado por reguln choque trmico P3rpoH y PcpxP, regulados por sigma E, respuesta a estrs extracitoplsmico Entonces, defectos en el manejo de protenas en compartimientos extracitoplsmicos

 Clulas en inanicin pierden la capacidad reproductiva debido a deterioro, ms que a entrada adaptativa y programada a VBNC Esterilidad asociada a dao oxidativo, sta podra ser reversible. Sin O2, clulas en inanicin tardan en empezar a ser no cultivables

Modelos para explicar la prdida de cultivabilidad