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Teora ondulatoria
Fotn: Tiene propiedades corpusculares y ondulatorias Partcula que porta las distintas formas de radiacin electromagntica; tiene masa cero y en el vaco tiene velocidad constante.
- En fenmenos de reflexin y refraccin, el fotn se comporta como una onda. - En fenmenos de transferencia de energa, el fotn se comporta como un corpsculo, donde la energa esta dada por:
Espectro electromagntico
hc E= l
h: constante de Plank C: velocidad de la luz en el vacio. l: longitud de onda
Longitud de onda, l: Distancia entre 2 mximos de una onda. Este parmetro determina el color de las cosas.
V= x f
Fenmenos de la luz
Refraccin: cambio de direccin de la luz cuando incide por un cuerpo con densidad distinta, sufriendo un retraso en su velocidad.
Fenmenos de la luz
Reflexin: cuando la luz incide en superficies como un espejo, el rayo se refleja (no penetra)
Fenmenos de la luz
Dispersin: cambio en la velocidad de un rayo incidente sobre un medio en particular. Todas las radiaciones tienen la misma velocidad en el vaco. Al incidir en un medio diferente, sus velocidades cambian y esta velocidad (en el nuevo medio) depende de la longitud de onda.
Donde se expresa la protena? Cuando se expresa la protena? Donde y cuando mi protena interactua con otra protena? Cuanto de mi molcula hay disponible? Que cantidad de mi molcula se encuentra en un lugar determinado y en que momento?
Herramientas bioqumicas y de biologa molecular (entre otras) pueden ayudarnos a contestar estas preguntas pero existen algunos detalles...
Cambios en la expresin de la protena X al tratar clulas con el compuesto Y a diferentes concentraciones. Compuesto Y ng/ml
Proteina X
Actina
Esquema de la expresin de protena X (azul) analizada por el inmunoblot anterior: se puede hablar de expresin heterognea mediante este mtodo?
Bioqumica vs imagen
Las clulas se pueden ver mediante instrumentos que manipulen la luz: microscopios
Jugando con las propiedades antes mencionadas se puede: 1.- modificar el recurso/enfoque de luz 2.- iluminar las clulas 3.- seleccionar la luz que se emita o transmita de la clula 4.- detectar la luz necesaria
d: espacio entre dos partculas adyacentes, l: longitud de onda de iluminacin, NA: apertura numrica del objetivo
Light cone
NA=n(sin )
n= el ndice de refraccin ms bajo entre el objeto y el objetivo, generalmente 1. es 1/2 de la apertura angular del objetivo
Magnificacin = resolucin /
Clulas de cebolla
Rotfero
Ventaja: se visualizan objetos pequeos como bacterias que refractan la luz. Desventajas: la resolucin no es muy alta.
Uso: Muestras vivas sin teir. Deteccin de bacterias y algunos organelos grandes, pero no para distinguir la estructura interna de bacterias por ejemplo.
Se utiliza luz polarizada; para esto la luz pasa por un polarizador y luego por un prisma de Wollaston.
La luz forma 2 haces separados que atraviesan la muestra (rotando la polarizacin) y luego se juntan con el segundo prisma de Wollaston.
Las diferencias en el ndice de refraccin o de grosor en la muestra genera imgenes brillantes (rayos en fase) u oscuras (rayos fuera de fase)
La polarizacin de la luz ocurre cuando la luz atravieza ciertos filtros que permiten que pase slo la parte de la luz .
Contraste de fases
DIC
Diferencia principal entre CF y DIC: bases pticas por las que las imgenes son formadas (contraste)
Microscopa de fluorescencia
Concepto de fluorescencia
Un cromforo absorbe luz pero no emite luz. Esto implica que el objeto tiene color Un fluorforo absorbe luz a longitudes de onda cortas y EMITE luz a longitudes de onda mayores.
Fluorforos
Ventajas: uso de fluorforos ha permitido la identificacin de compuestos sub-celulares con alta especificidad y sensibilidad (50 molculas/ micrmetro cbico). Disponibilidad de muchos fluorocromos. Usos: en material orgnico e inorgnico, material vivo, como sensor de cambios fisiolgicos (cambios en concentracin de iones), etc.
-Tubulin Antibody (green). Actin filaments have been labeled with Alexa Fluor 555 phalloidin (red). Blue pseudocolor = DRAQ5 (fluorescent DNA dye).
mouse anti-NPCP (nuclear pore complex protein) and rabbit anti-giantin (Golgi complex) primary antibodies. The antibody targets were visualized with goat secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488, respectively
Microscopa confocal
Se utiliza un lser que ilumina la muestra en un solo plano. Elimina la luz que viene de planos fuera de focos (toma solo un plano focal y se eliminan los restantes)
(A). Imagen de microscopa ptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira). (B) Imagen del mismo tipo de muestra (Spyrogyra) obtenida con el microscopio confocal.
ngel Martnez Nistal, Microscopia confocal, U. de Oviedo
Reduccin de imgenes borrosas producto de la dispersin de la luz Incremento en la resolucin efectiva Mejora la relacin seal / ruido Examina de forma clara muestras gruesas Escaneo en eje Z Percepcin de profundidad en las imgenes seccionadas en Z Magnificacin se puede ajustar electrnicamente
Reconstruccin 3D
Reconstruccin 3D
Microscopia electrnica
Fuente de iluminacin: electrones, los que inciden en la muestra enfocados por campos electrostticos. Permite la observacin en una escala de nanmetros a micrmetros.
Electrones sobre una muestra: Dispersin elstica; solo cambios en trayectoria (energa cintica y velocidad permanecen constantes) e inelstica; algunos electrones pueden chocar y sacar a electrones de sus rbitas en la muestra (estado excitado)
SEM
TEM
TEM Las muestras se cortan en secciones delgadas (<100 nm) para permitir que los electrones pasen a travs de ella. Se usan metales pesados para dar contraste adicional los que se unen a ciertas estructuras. Los electrones solo pasan por las zonas donde no hay metales asociados Uso: para ver estructuras internas como organelos, para ver contornos intactos, pequeas estructuras como virus, etc. SEM
La formacin de la imagen se logra a partir de los electrones que han sido desplazados al incidir en la muestra. Estos electrones emitidos se capturan con un detector y la informacin se convierte en una seal elctrica, amplificada y digitalizada, el resultado es una imagen topogrfica de la superficie de la muestra. Tambin otras seales son emitidas que se pueden utilizar usando detectores especficos. Uso: Medicina Forense (Anlisis morfolgico de pruebas), Botnica, Biomedicina y Medicina (Estudio morfolgico), geologa, estudio materiales, etc.
Organelos en polen de tabaco, AF: filamentos de actina; G: aparato de Golgi; Mi: Mitocondria; Mt: Microtbulos
Sangre humana
Milmetro: 1 mm = 1 000 000 nm Micrmetro: 1 m = 1000 nm Angstrom: 1 = 1/10 nm Picmetro: 1 pm = 1/1000 nm Metro: 1 m = 1.000.000.000 nm
kilmetro: 1 km = 1.000.000.000.000 nm