TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Administracin

Laboratorio

Usuario /Consumidor

Fabricante

Cliente/Empresas

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Normalizacin de procedimientos Norma Elaboracin Difusin Aplicacin

International Standardization Organization (ISO) International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)

Association of Official Analytical Chemists (AOAC) American Section of the International Association for Testing Materials (ASTM)
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Anlisis Procedimientos normalizados de trabajo (PNT) Gestin de calidad Implantacin y mantenimiento de sistemas de gestin de calidad ISO 9001

Reconocimiento de competencia tcnica Requisitos de aseguramiento de calidad analtica especficos para laboratorios de ensayo y calibracin ISO 17025
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Entidades privadas Sin nimo de lucro Reconocidas por entidades competentes

Certificacin Garantizar el cumplimiento y aplicacin del sistema de calidad en la gestin segn ISO 9001

Acreditacin Reconocimiento de competencias tcnicas para la realizacin de ensayos y calibracin segn los requisitos de calidad marcados por ISO 17025
Reconocimiento externo de alta confianza Trabajos con administracin Anlisis que requieren requisitos de calidad altos (contaminacin, salud pblica, etc.) Servicio de calibracin externo de equipos y dispositivos
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Qu es? Parte esencial del aseguramiento de calidad (expresamente tratada en la ISO 17025) Documentacin de calidad para verificar que el mtodo analtico cumple criterios de calidad establecidos por: Cliente PNT de referencia Certificacin ISO 9001 Acreditacin ISO 17025 Homologacin, ley correspondiente Acreditacin ISO 17025

Organismo pblico

Qu asegura con respecto a las medidas de ensayos y calibracin (ISO 17025)?

Trazabilidad de anlisis
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Qu es la trazabilidad? Cadena ininterrumpida de comparaciones que aseguran la exactitud de la medida y/o instrumentos implicados en el desarrollo del mtodo con respecto al resto de los elementos de la cadena

Aseguramiento de que todas las pesas (con nivel de incertidumbre creciente hacia la base) ofrecen una misma medida de masa

Patrones certificados Instrumentos calibrados unos con otros Procedimientos validados (normalizados)
Trazabilidad de pesas laboratorio con respecto al cilindro Pt/Ir Svres (1 kg)
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Trazabilidad en anlisis qumico

Estndares primarios (A, kg, m, s) Estndares fsicos (pesas, voltmetro patrn) Masas atmicas

Estndares qumicos primarios Estndares qumicos secundarios Disoluciones valoradas Estndares certificados Masa y concentracin en la muestra

Errores sistemticos Pre tratamiento de muestra Interferencias Efecto matriz

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Determinacin de parmetros Exactitud (sesgo) Precisin

Repetibilidad Reproducibilidad

Selectividad/especificidad Intervalo/Rango de trabajo Linealidad /Sensibilidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Incertidumbre

Robustez
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Grado de concordancia entre el resultado de una medicin y el valor de referencia aceptado Materiales de referencia certificados

National Institute of Standards and Technologies

Bureau of Analyzed Samples

Institute for Reference Materials and Measurements (Unin Europea)

American Society of Testing and Materials

Reproducen matrices de muestras problema habituales en anlisis con valores certificados de composicin (mediante ejercicios interlaboratorios entre laboratorios competentes)

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Ejemplo

0.85

0.95

1.06

0.95

1.25

1.62

Material de referencia MA-M-2-TM (IAEA) Determinacin en organismos marinos

1.53

1.92

2.50

Establecer contrastes de hiptesis correspondiente a una distribucin muestral con respecto a un valor lmite o certificado (tema 2)

t n 1 x 0
t calculada

n s
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Muestra / Patrn analizado programa interlaboratorio

trazas componentes mayoritarios componentes minoritarios

s % RSD .100 x
Similar a la reproducibilidad pero ahora utilizado para validar exactitud a travs de un interlaboratorio

Relacin entre coeficientes de variacin y concentracin de analito en interlaboratorios (Ecuacin de Horwitz)

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Mtodo de adiciones y estudio de recuperacin

Se adiciona analito puro de concentracin conocida a muestra real sin analito (disolucin matriz blanco) o con concentracin previamente determinada

Mismo proceso de pretratamiento de muestra

Anlisis y clculo de recuperacin de analito sobre el adicionado

Relacin entre concentracin de analito y % recuperacin (AOAC)

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Comparacin con un mtodo de referencia

Mtodo de referencia reconocido

x1, s1

Establecer contrastes de hiptesis con valores de anlisis H0 Exactitud validada

Mtodo a validar

x2, s2

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Calcular la funcin que relaciona concentracin analito y respuesta de mtodo

Criterios de alinealidad
Coeficiente de correlacin r > 0,998 (r2 > 0,996) % RSD factores de respuesta de concentraciones calibracin < 5%

S FR *100 b Homocedasticidad de residuos % RSD

Incluir valores de confianza para b (pendiente) y a (ordenada en el origen) (tema 4)

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Criterios de linealidad
Coeficiente de correlacin r > 0,998 (r2 > 0,996) % RSD factores de respuesta de concentraciones patrones calibracin < 5%

Seali FRi Conci

S FR % RSD *100 b

Demostrar homocedasticidad de residuos (tema 4)

Test Fischer S alta conc. y baja conc.

Incluir intervalos de confianza para b (pendiente) y a (ordenada en el origen) (tema 4)

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Comparacin estadstica de las dispersiones (s) en condiciones de repetitividad y/o reproducibilidad Condiciones de repetibilidad Precisin obtenida en la que los resultados de una medicin se obtienen Mismo mtodo Mismo operador Mismo instrumento/equipo de medida En un corto intervalo de tiempo (mismo da) Condiciones de reproducibilidad Precisin obtenida en la que los resultados de una medicin se obtienen Mismo mtodo Misma muestra Diferentes operadores Diferentes equipos de medida Intervalo de tiempo > 24 horas Si es posible, diferentes laboratorios
Instrumento Accesorios Operadores Matriz muestras Concentracin Lote de reactivos Condiciones ambientales Repetibilidad No cambiar No cambiar No cambiar Cambiar Cambiar No cambiar No cambiar
Reproducibilidad

Cambiar Cambiar Cambiar Cambiar Cambiar Cambiar Cambiar

Laboratorios

No cambiar

Cambiar/ No cambiar*

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM *Precisin intermedia (reproducibilidad intralab) Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Al menos 5 medidas a 2 o 3 concentraciones diferentes del rango de trabajo Calcular el % RSD Valores aceptables de precisin en funcin de la concentracin para reproducibilidad (aceptados por AOAC)

%RSD 2

10.5 log C

Ecuacin de Horwitz

Para condiciones de repetibilidad se acepta

% RSD 0.5 x 210.5 log C

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

*C como concentracin g/ml

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Ejemplo

Determinacin de plaguicidas organofosforados en microalgas mediante GC-MSD

Reproducibilidad aceptable para este mtodo

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

El grado por el cual un mtodo puede determinar un analito en particular dentro de una mezcla compleja sin ser interferido por otros componentes de la mezcla Las pruebas para asegurar la selectividad dependen de Matriz muestra Tcnica utilizada Informacin bibliogrficamente Incluir toda la informacin relevante que verifique la selectividad del mtodo

Ejemplo En un mtodo cromatogrfico puede expresarse en trminos de resolucin de picos de analitos

Picos analitos resueltos Pico analito interferido

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Anlisis de muestra y MRC por el mtodo a validar y otros mtodos independientes

Anlisis de muestras conteniendo varias interferencias sospechadas en la presencia del analito de inters

Se identifica irrefutablemente la seal de analito? Se ve interferido por otros componentes?

Las interferencias inhiben o incrementan la deteccin o cuantificacin?

Seal de analito identificada y comprobada libre de interferencias

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Intervalo de concentracin en el que puede obtenerse una exactitud y precisin adecuadas al objetivo del mtodo

Determinacin a partir de datos Estudio rango lineal (Linealidad)

Estudio homocedasticidad (Linealidad)

Estudios precisin y exactitud LDO y LQO (Tema 4)

Con todos estos datos se define el rango de aplicacin del mtodo Concentracin mnima suele coincidir con LDO y LQO Concentracin mxima en funcin de linealidad, homocedasticidad y datos de precisin y exactitud

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Hemos definido LOD YLOD = YB + 3 SBlanco

Y LOQ YLOQ = YB + 10 SBlanco

Interpolar en recta calibrado para averiguar concentraciones LOD o LOQ

Obtencin del valor de YBlanco Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibracin Podemos pasar 10 veces un disolucin blanco y realizar promedio de seal Obtencin del valor de SBlanco Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos S es igual en todo el rango de concentracin calibrado

Podemos tomar S Blanco = S y/x de los puntos de calibracin Podemos realizar la S de las 10 medidas de seal de blanco
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Estimacin que caracteriza un intervalo de valores en el que se sita con una alta probabilidad el valor verdadero de la magnitud medida Se deben evaluar todas las fuentes de incertidumbre posibles de etapas que influyen en la medida ltima
Curva calibracin Sb Sa Sx0 Preparacin patrones Patrn Dilucin Pipeta Matraz Temperatura lab Balanza Calibracin balanza Pesas Pesada balanza Reactivos Precisin (repetibilidad)

Incertidumbre

Calibracin equipo

Pretratamiento de muestra

Toma de muestra Extraccin Preparacin Ataque /Disgregacin Dilucin Balanza Pipetas Matraces
DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

*Desarrollado en tema 6

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Todo contribuye a aumentar el error de la medida Propagacin de errores

ui
i

Ejemplo

Contribucin a la incertidumbre en la pesada Incertidumbre pesas de calibracin Incertidumbre de la calibracin de la balanza realizada con ellas Incertidumbre de la propia pesada (repetibilidad del equipo) Incertidumbre de deriva (descalibracin con el tiempo e influencia de la T)

u Balanza u p uc ur ud
2 2 2

*Desarrollado en tema 6

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

A su vez Ubalanza se compone con otras incertidumbres Ejemplo Preparacin de patrones de calibracin

u prep. patrones ubalanza umatraz u pipeta u patrn ...

2 2 2 2

Y as continuamente hasta componer todas las posibles fuentes de error en una U de la medida

umedida ucalibracin urepet u pretratam ...

2 2 2

La U de la medida se expresa en trminos de Incertidumbre expandida

U k .u

Siendo k=2 para un 95% de probabilidad

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

*Desarrollado en tema 6

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Medida de la capacidad del mtodo de permanecer inalterado debido a pequeas (pero deliberadas) variaciones en los parmetros indicando su fiabilidad durante su uso normal Identificar las condiciones y variables del mtodo que puedan tener un efecto significativo en la medida

Test de robustez de Youden-Steiner

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Test de robustez de Youden-Steiner

Resultados de los 8 anlisis con diferente combinacin de factores

Factores que cambian X variable del mtodo x variable modificada

Ejemplo A 45 ml HCl utilizado en digestin a 20 ml HCl utilizado en digestin B Temperatura de estufa a 120 C b Temperatura de estufa a 100 C .

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 5 Validacin de mtodos analticos

Se establecen las medias de los resultados en los que participa cada factor y se representa en una grfica de columnas la diferencia de concentracin por factor (a-A, b-B, c-C,)

4.1 3.4 2.8 1.1

Ejemplo El factor que ms influye (ms sensible) es el cambio de volumen de HCl de digestin de 40 a 20 ml.

Variacin de medida (concentracin)

4 3 2 1 0

1.0

-1
-2 -3 -4

F -1.8

-3.2 Factor

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM Prof. J.C. Vilchez Martn