Departamento de Qumica e Bioqumica Biologia Molecular 2013/2014

Enzimas que modificam o DNA

Ana Carolina Cordeiro Rebeca Crespo Fiadeiro Docente: Margarida Amaral

Enzimas que modificam o DNA

Nucleases Polimerases Ligases Nucletido Transferases Enzimas que adicionam/removem grupos qumicos
Metilases Cinases Fosfatases

Nucleases
Clivagem de ligaes fosfodister entre nucletidos Exonucleases Endonucleases

Nucleases
Clivagem de ligaes fosfodister entre nucletidos Exonucleases
Exonuclease III (E.Coli) Bal31 (Alteromonas espejiana)

Nucleases
Clivagem de ligaes fosfodister entre nucletidos
DNase I (pancrease da vaca)

Endonucleases

S1 Nuclease (Aspergillus oryzae)

Endonuclease de restrio

Nucleases Engenharia Gentica Zinc Finger Nuclease

Cys2His2 zinc finger

Protena Zif268 constitudo por 3 zinc fingers ligado ao DNA

Nucleases Engenharia Gentica Zinc Finger Nuclease

Correco gentica por Recombinao homloga mediada terapia para doenas monognicas

3 zinc fingers reconhecimento

Fok1 (enzima de restrio) - clivagem

Polimerases
Sntese de nova cadeia complementar a uma cadeia de DNA molde

Polimerases
Polimerase I (E.Coli) Completa
5 3 polimerase 3 5 exonuclease (correco de erros) 5 3 exonuclease (nick translation)
Cadeia lder

Cadeia atrasada

Polimerases
Polimerase I (E.Coli) Completa
5 3 polimerase 3 5 exonuclease (correco de erros) 5 3 exonuclease (nick translation)

Polimerases
Polimerase I (E.Coli) Completa
5 3 polimerase 3 5 exonuclease (correco de erros) 5 3 exonuclease (nick translation)
Remoo do RNA primer Preenchimento de nicks

Polimerases Engenharia Gentica Sequenciao do DNA

Fragmento Klenow
5 3 polimerase 3 5 exonuclease (correco de erros) 5 3 exonuclease (nick translation)

Polimerases Engenharia Gentica Sequenciao do DNA

1. Clonagem do ssDNA a sequenciar no vector M13 2. Insero do primer para permitir a ligao do DNA polimerase 3. Mistura reaccional: vector M13 + polimerase + 4 desoxinucletidos + 1 didesoxinucletido 4. Sntese de cadeias complementares

Polimerases Engenharia Gentica Sequenciao do DNA

5. Electroforese 6. Leitura

Polimerases Engenharia Gentica Sequenciao do DNA

Escolha do Polimerase: Polimerase I : Actividade exonuclease 5 3 Actividade exonuclease 3 5 Fragmento Klenow : Actividade exonuclease 3 5 Baixa eficincia (250bp) Sequenase : no contem actividade nuclease (Bacterifago T7)

Polimerases Engenharia Gentica PCR e Thermal Cycle Sequencing

Taq polimerase (Thermus Aquaticus): Enzima termostvel no sofre desnaturao a elevadas temperaturas PCR: Requer elevadas temperaturas para desnaturar o DNA 94C Thermal Cycle Sequencing: Necessidade de amplificao de um gene mtodo que une PCR com sequenciao do DNA

Polimerases Engenharia Gentica Clonagem de cDNA

Transcriptase Reversa (replicao dos virus de RNA): Problema: mRNA no pode ser inserido num vector Soluo: Converso de mRNA a DNA por sntese de cDNA 1. Insero do primer para permitir a ligao do Transcriptase Reversa 2. Sntese da cadeia de cDNA (molcula hbrida) 3. Degradao do RNA por um RNase H fragmentos de RNA servem de primers para o DNA polimerase I

Polimerases Engenharia Gentica Clonagem de cDNA 4. Sntese da cadeia complementar do cDNA resultando num dsDNA 5. Insero da molecula dsDNA no vector 6. Clonagem

Ligases
Formao de ligaes fosfodister entre nucletidos Reparao de descontinuidades Juno de duas molculas DNA

Ligases Engenharia Gentica DNA recombinante

Ligase: Responsvel pela juno do vector e o DNA a clonar

DNA ligase utilizado em engenharia gentica: E.coli infectado com fago T4

Mecanismo de aco do ligase

Ligases Engenharia Gentica DNA recombinante

Blunt ends vs. Sticky ends

Ligases Engenharia Gentica DNA recombinante

Sntese de Sticky ends 1. Linkers

Ligases Engenharia Gentica DNA recombinante

Sntese de Sticky ends 2. Adaptadores

soluo

Nucletido Transferases
Adio de desoxirribonucletidos ao terminal 3-OH (extremidade ou nick)

Nucletido Transferases Engenharia Gentica DNA recombinante

Sntese de Sticky ends 3. Cauda de homopolmeros

 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) : mtodo para detectar fragmentao de DNA por apoptose

Nucletido Transferases Engenharia Gentica TUNEL

Clula apopttica marcada com TUNEL

Adio/Remoo de Grupos
DNA Cinase DNA Fosfatase

PNKP (polynucleotide kinase/phophatase) essencial reparao de DNA danificificado por ROS. Proximidade do mtDNA cadeia respiratria e cadeia transportadora de e- mutaes no mtDNA Diabetes, Cancro, Doenas neurodegenerativas, envelhecimento

Adio/Remoo de Grupos Engenharia Gentica DNA recombinante

Tratamento de vectores para no reciclizar sem insero do gene a clonar

Adio/Remoo de Grupos
DNA Metiltransferases

Me

Metilao em local especfico

CG

Modificao epigentica essencial Alvos:

Promotores de genes : inactivao DNA satlite : estabilizao de centrmeros

eComo as regi es no metiladas so mantidas? DNA Metiltransferases Desmetilao

1
Se uma regio do DNA no foi metilada, uma protena especfica reconhecer as sequncias no metiladas protege-a contra a metilao.

Metilases de Grupos Adio/Remoo

ssim que um local metilado existem duas formas para o desmetilar:

Bloquear a metilase de manuteno, proibindo-a de actuar no local aquando da replicao; Desmetilar o local, removendo o grupo metil directamente da citosina ou extrando a citosina metilada;

Adio/Remoo de Grupos Engenharia Gentica Bisulfite sequencing + Footprinting

Estudo do posicionamento nucleossomal utilizando DNA metiltransferases 1. Amplificao do promotor p16 por PCR 2. Tratamento de naked DNA (sem nucleossomas) com metiltransferase SssI (M.SssI) Metilao de locais CpG 3. Tratamento de ncleos com M.SssI Metilao apenas em locais acessveis (sem nucleossomas) 4. Tratamento das duas linhas celulares com Bisulfite -bisulfite sequencing 5. Electroforese em gel - Footprinting

nucleossoma

Adio/Remoo de Grupos Engenharia Gentica Gene Silencing

Baixa [s-adenosilmetionina] Diminuio da metilao de promotores da expresso do gene da Amiloide Sobrexpresso do gene Acumulao de Amiloide Alzheimer Tratamento: Administrao de s-adenosylmetionina

Bibliografia
Klug Aaron, 2010, The Discovery of Zinc Fingers and Their Applications in Gene Regulation and Genome Manipulation, The Annual Review of Biochemistry, 79:21331 Jeltsch A.,2007, Application of DNA methyltransferases in targeted DNA methylation, Appl Microbiol Biotechnol, 75(6):1233-40 Tahbaz N.Subedi S., Weinfeld M., 2012, Role of polynucleotide kinase/phosphatase in mitochondrial DNA repair, Nucleic Acids Res., 40(8): 34843495 T.A.Brown (2006), Gene Cloning & DNA Analysis An Introduction, 5Edio, blackwell publishing, Lewin B (2013) Genes XI Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Massachussetts, USA Mehrnaz Fatemi et. al, 2005,Footprinting of mammalian promoters: use of a CpG DNA methyltransferase revealing nucleosome positions at a single molecule level, Oxford Journals, Volume 33, Issue 20:176 Scarpa S, Cavallaro RA, D'Anselmi F, Fuso A, 2006, Gene silencing through methylation: an epigenetic intervention on Alzheimer disease, Journal of Alzheimers Disease, 9(4):407-14. http://www.piercenet.com/method/methods-labeling-nucleic-acids#tdt http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Comenzymes.pdf