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FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

En el diagnstico de Cancer de mama

INTRODUCCION
Qu es el cncer de mama? Cncer es un trmino general que se refiere a clulas que crecen y se multiplican fuera de control y pueden propagarse a otras partes del cuerpo. Hay muchos tipos diferentes de cncer de mama. Cada uno tiene sus propias caractersticas, y cada uno puede requerir un tratamiento diferente. El cncer puede provocar dao de diferentes maneras. Las clulas cancerosas restan nutricin y espacio a las clulas normales. Un bulto de clulas cancerosas, llamado tumor, puede invadir o destruir tejidos normales. Las clulas cancerosas tambin pueden propagarse a otras partes del organismo. Esto se llama metstasis. En general, el cncer de mama se genera en los conductos lcteos. Estos conductos conectan las glndulas productoras de leche (llamadas lbulos) con el pezn. En algunos casos, el cncer de mama comienza en los lbulos mismos, y en los dems casos comienza en otros tejidos.

Diagnostico

Mamografa Tomografa CT o CAT (CT o CAT scan Tomografa Axial Computarizada) MRI (Imagen de Resonancia Magntica - IRM) Tomografa sea Nuclear Tomografa PET (Tomografa por Emisin de Positrn) Ultrasonido Pruebas de laboratorio (CEA, CA 15-3, LASA) Biopsia (extracion por jeringuilla o incision)

Que es el HER2?

HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2). El gen HER2 ayuda a controlar la manera en que las clulas crecen, se dividen y se reparan. Casi uno de cada cuatro cnceres del seno tiene demasiadas copias del gen HER2. El gen HER2 dirige la produccin de protenas especiales, llamadas receptores HER2, en las clulas cancerosas. Los tipos de cncer con demasiadas copias del gen HER2 demasiados receptores HER2 tienden a crecer rpidamente. Tambin se asocian con un aumento en el riesgo de diseminacin. La prueba de HER2 se realiza con la muestra del tumor extrada durante la intervencin quirrgica o por medio de una aguja.Existen dos tipos de pruebas para determinar el estado de HER2: la hibridacin in situ por fluorescencia (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) y la Immuno Histo Chemistry, IHC.

En clulas normales, expresan dos copias del gen Her2/neu, mientras que en las clulas tumorales se produce una amplificacin del gen.

Mtodo FISH

FISH mide la amplificacin del gene HER2 (el nmero de copias del gene HER2 presentes en la clula cancerosa). Los resultados de esta prueba se reportan como positivo o negativo. FISH (Fluorescence in situ Hybridization) es una nueva tecnologa que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluorforo para detectar o confirmar anomalas gnicas o cromosmicas que generalmente estn ms all de la capacidad de resolucin de la citogentica de rutina.

En primer lugar, la muestra de DNA (cromosomas metaffase o ncleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias de la estructura en doble hlice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le aade entonces la sonda de inters, marcada con un fluorforo, que se asociar al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso denominado hibridacin, donde se vuelve a formar una doble hlice. La seal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y as la muestra de DNA se puede clasificar segn la presencia o ausencia de la seal.

Las sondas son de poligonucleotidos marcados con fluorecemsia: Verde: FITC, estos permiten la deteccion de la secuencia satelite alfa del centromero del cromosoma 17. Anaranjado: Rodamina, permite la deteccion de la secuencia del gen HER2.

Durante la fase de hibridacion y lavado el objeto estudiado no deve secarse y la sondas de DNA no debe exponerse a un luz relativamente fuerte. Despues de la desnaturalizacion a una temp. de 75C, se incuban las placas a 37C, luego esta la fase de lavado y la contratincion, para luego colocarlo al microscopio de fluorecencia.

Figura 1.5 Desnaturalizacin y renaturalizacin por calentamiento/enfriamiento de una molcula de DNA Mezcla de dos soluciones conteniendo DNA desnaturalizado para dar lugar a molculas hbridas de DNA

Factores que influyen en el proceso de hibridacin

Los factores que ms influyen en el proceso de hibridacin son la temperatura, el pH y la concentracin de cationes. La modificacin de estos parmetros condiciona la fidelidad con la que se produce la hibridacin (en ingls se denomina stringency), es decir, el nmero de pares de bases errneos que puede tolerar un hbrido. Si se emplean soluciones con baja concentracin salina o la reaccin se lleva a cabo a temperatura elevada, es poco probable que se forme un hbrido estable. Por el contrario, las soluciones con alta concentracin salina o las bajas temperaturas permiten la formacin de hbridos imperfectos, no estn correctamente emparejados.

FISH de metafase

FISH puede usarse sobre clulas en metafase para detectar delecciones especficas ms all de la capacidad de resolucin de la citogentica de rutina, o para identificar material extra de origen desconocido. Puede tambin ser de ayuda en casos donde es difcil determinar mediante la citogentica de rutina si un cromosoma tiene una deleccin simple o si est implicado en una reorganizacin sutil o compleja. Adems, la FISH de metafase puede detectar algunos de los reordenamientos especficos que se observan en ciertos tipos de cncer.

FISH de interfase

La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que son caractersticas de ciertos tipos de cncer. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las clulas.

Esta imagen muestra tejido de cncer de mama, se observan mltiples copias de HER2. El color anaranjado representa la amplificacin del HER2 y el verde es el control interno indica el centrmero del cromosoma 17 (CEP 17).

Figure 1. Illustrative fluorescence in situ hybridization patterns of Her-2/neu geneassociated fluorescence signals found in interphase nuclei in samples from patients with breast cancer. Top left, Normal diploid nuclei. Top right, Nuclei with trisomy 17. Middle left, Nuclei with tetrasomy 17. Middle right, Nuclei with low Her-2/neu gene amplification. Bottom left, Nuclei with intermediate Her-2/neu gene amplification. Bottom right, Nuclei with high Her-2/neu gene amplification. www.medscape.com/viewarticle/465635_print

Valor clinico

El valor clnico de la oncoprotena HER-2/neu ha tomado relevancia en los ltimos aos desde la introduccin de terapias con anticuerpos monoclonales, como trastuzumab (Herceptin), que bloquea el efecto de la protena. Determinar los valores de partida de HER-2/neu y monitorizar su evolucin en el curso de la enfermedad metastsica puede ayudar al manejo del tratamiento y determinar si es apropiado aumentar la intensidad de la terapia o utilizar alguna otra alternativa. El mtodo inmunohistoqumico mide la sobre expresin de la protena utilizando anticuerpos especficos contra los receptores Her2/neu. El anlisis de los resultados se realiza de forma semicuantitativa, expresndolos en una escala de 0 a 3+. 0 y 1+ se consideran negativos a efectos de tratamiento clnico. 2+ y 3+ se consideran positivos, sin embargo en 2+ se considera apropiada la confirmacin por el mtodo FISH. La tcnica de IHQ es una tcnica precisa, de fcil realizacin en los laboratorios de anatoma patolgica y no es costosa.

El mtodo FISH mide la amplificacin del gen, indicando el numero de copias presentes. Si dicho nmero de copias es mayor de 2, el resultado se considera positivo. La tcnica FISH es ms difcil de realizar y ms costosa que la IHQ. Sin embargo la cuantificacin es ms precisa y relativamente sencilla de realizar.
Reportable Range: <1.80 Negative Borderline 1.81 2.20 HER2 not amplified Borderline; results equivocal* HER2 amplified

Positive

>2.20

Comparacin
Deteccion de HER2
IHQ ESTANDARIZADA CUANTITATIVA CUALITATIVO / SEMI-CUANTITATIVO SUSCEPTIBLE SENSITIVA NO NO SI SI BUENA FISH SI SI NO NO ALTA

ESPECIFICA
SEAL ESTABLE MICROSCOPIO

BUENA
ESTABLE LUZ

ALTA
DECAE CON EL TIEMPO FLUORECENCIA

Desventajas

Las dos tcnicas presentan limitaciones in situ debido sobre todo a su variabilidad. Por otra parte, al tratarse de mtodos que miden el Her2/neu en tejido tumoral, no seran vlidos para el seguimiento de la enfermedad una vez extirpado el tumor primario.

Conclusin

El cancer de mama se a convertido en el tumor ms frecuente en la mujer de los pases occidentales, oscilando su incidencia entre 50-80 casos cada 100.000 mujeres, y representando casi la tercera parte del cncer femenino. Una vez establecido el diagnstico de carncer y extirpado el tumor, es fundamental establecer el pronstico de la enfermedad, puesto que de ello va a depender la terapia sistmica a utilizar. El utilizar la tecnica FISH para la deteccion de cancer de mama es de suma importancia ya que provee un diagnostico preciso.

Referencias

www.abbottmolecular.com/FISH_11358.apx www.cancer.gov/espanol

biomed.uninet.edu/2006/n2/sanmiguel.html www.medscape.com/viewarticle/465635 www.hmds.org.uk/fish.html www.Herceptin.com Informacin sobre el cncer de mama.html http://science.jrank.org/pages/2775/Fluorescence-in-SituHybridization-FISH.html http://genedetect.com/insitu.com http://member.aol.com/chrominfo/index.htm www.cdc.gov/spanish/cancer/breast/diagnosis.htm www.radiologyinfo.org http://www.zytovision.com Diagnostico histopatologico y factores pronosticos en Cancer: Infiltrante de glandula mamaria.