TECNICAS ACTUALES DE TAXONOMA MOLECULAR

Gonzlez Amador Mara Fernanda Mendoza Soto Gabriel Vargas Cano Felipe

Esencialmente, todas las clasificaciones de organismos, tanto a nivel de especie como de grandes grupos taxonmicos, se han basado en el uso de anlisis anatmicos y/o morfolgicos, dada la evidente correlacin entre forma y evolucin. Igualmente, el registro fsil ha permitido ampliar y mejorar considerablemente estas clasificaciones, con la comparacin de organismos actuales con otros extinguidos.

INTRODUCCIN

Ms recientemente tcnicas ms sofisticadas han permitido elaborar taxonomas y filogenias mediante estudios, por ejemplo, de embriognesis y anlisis biomtricos

ASPECTOS BASICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

Los organismos vivos, sean bacterias, plantas o animales, comparten la mayora de rasgos y caractersticas respecto a su composicin qumica. Si bien los seres vivos estn constituidos mayoritariamente por elementos inorgnicos (agua, sales minerales), las molculas que los caracterizan son las orgnicas. El DNA est contenido en el ncleo de las clulas, salvo aquellas que no poseen tal, como las bacterias. Sin embargo, es menos sabido que no slo hay DNA en el ncleo, sino tambin en al menos dos orgnulos subcelulares: los cloroplastos (slo en plantas) y las mitocondrias.

La utilidad del DNA mitocondrial es enorme, pues su frecuencia de mutacin es diferente al del DNA nuclear, de manera que puede ser utilizado para estudiar de forma ms adecuada el tiempo transcurrido en funcin de las mutaciones acumuladas. As, se asume que la cantidad de mutaciones que se acumulan en el DNA mitocondrial es proporcional al tiempo, con lo cual puede estimarse si dos organismos estn ms o menos emparentados en funcin de dichas acumulaciones de mutaciones, esto es slo relativamente cierto, pues la proporcionalidad entre mutaciones y tiempo transcurrido slo es aplicable a determinados genes

 Los cidos nucleicos y las protenas considerados como cronmetros moleculares o documentos de la historia evolutiva. Asumiendo que los cambios se producen al azar y que aumentan con el tiempo de manera lineal, las diferencias en la secuencia de los monmeros (nucletidos o aminocidos) que integran macromolculas homlogas, presentes en dos formas de vida, reflejan la distancia evolutiva existente entre ellas.
Zuckerkandl y Pauling

IDENTIFICACIN BACTERIANA MEDIANTE SECUENCIACIN

Carl Woese
(Universidad de Illi- nois) a principios de la dcada de 197

El ARN ribosmico (ARNr) 16S

El cido ribonucleico ribosmico se encargan de la sntesis de protenas segn la secuencia de nucletidos del ARN mensajero. Est formado por una sola cadena de nucletidos (aunque presenta regiones de doble hlice intracatenaria). Los ARN ribosmicos se han venido denominando tradicionalmente segn su coeficiente de sedimentacin, medido en svedbergs (S). De esta manera, en organismos procariotas existen tres ARNr distintos (5S, 16S y 23S) y en organismos eucariotas cuatro (5S, 5'8S, 18S, 28S).

*estructuracin del mundo procariota en las relaciones filogenticas establecidas con esta macromolcula*

1. Antigedad.
2. Estructura y funcin constantes.

POR QU SE USA EL RNAr 16S?

3. Lentitud de los cambios y fcil diferenciacin. 4. Tamao largo.

5. Conservacin de estructura secundaria.

6. Fcil secuenciacin.

Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ADNr16

Incluye tres etapas: Amplificacin del gen mediante una muestra apropiada Determinacin de la secuencia de nucletidos del amplio Anlisis de la secuencia

 Se consigue en un termociclador, gracias a la reaccin en cadena de la polimerasa(PCR). Como sustrato se utiliza normalmente ADN purificado a partir de un cultivo puro del agente patgeno.

Amplificacin

Para la extraccin del ADN bacteriano existen protocolos generales Puede conseguirse directamente a partir de una colonia aislada o un cultivo lquido de la bacteria de inters, o incluso a partir de una muestra clnica, simplificando significativamente la identificacin, al evitar el laborioso proceso de extraccin del ADN.

 Se llevan acabo reacciones de secuenciacin y el anlisis de los productos por electroforesis* Actualmente, se emplea la secuenciacin cclica, que utiliza un nico iniciador por reaccin y terminadores marcados con fluorocromos, que interrumpirn la sntesis de manera aleatoria, y facilitarn la deteccin posterior de los fragmentos interrumpidos. Para la secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S completo, ser necessrios de 8 a 4 i n i c i a d ores Podr presentar errores o presentar posiciones ambiguas, la obtencin de la secuencia definitiva requiere la evaluacin de los electroferogramas y la alineacin de la cadena directa con la reversa, para resolver las posibles discrepancias.

Secuenciacin del amplio

La calidad de la secuencia ser ptima cuando la comparacin de ambas cadenas no presente errores.

*Electroforesis: tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico

 Comparacin de la secuencia del ADNr 16S con las depositadas en bases de datos.

Anlisis de la secuencia

La eleccin de la base de datos es importante, siendo recomendable la utilizacin de ms de una de ellas, para comprobar si conducen al mismo resultado. Finalmente, se podr construir un rbol filogentico, que refleja, de forma esquemtica, el grado de parentesco gentico entre las bacterias comparadas.

Proceso

TECNICA DE LA PCR (REACCION EN CADENA DE POLIMERASA)

Tras unos procesos de extraccin y purificacin relativamente sencillos, se obtiene DNA parcialmente puro, aunque en muy pequea cantidad, y por tanto imposible de analizar, al margen de contener decenas de miles de genes. Por tanto, el siguiente paso es amplificar de forma selectiva uno solo de estos genes, que ser habitualmente alguno de los contenidos en el DNA mitocondrial o ribosomal.

Esta tcnica se basa en el uso de unos enzimas (polimerasas)aislados de bacterias termfilas, que pueden trabajar a temperaturas de casi 100 C, a diferencia de la mayora de enzimas.

Entonces slo hay que poner en un tubo de ensayo, en las condiciones adecuadas, la mezcla de los diferentes DNAs aislados del organismo, los cebadores, el enzima que replica el DNA (polimerasa) y suficientes nucletidos como sustratos de la reaccin.

De esta manera, la polimerasa slo copiar el DNA para el que disponga de cebador (sta es una caracterstica del enzima), as que slo el gen de inters ser amplificado.

Una vez amplificado y purificado, existen diferentes opciones en funcin del tipo de estudio a realizar.

Una posibilidad muy evidente es determinar toda o parte de la secuencia, proceso relativamente sencillo hoy en da al emplearse mquinas automticas, pero bastante caro y no siempre eficaz por su complejidad. Una opcin mucho ms sencilla es el empleo de enzimas restriccin. Los enzimas de restriccin son unos enzimas aislados bacterias que cortan el DNA de manera selectiva, mediante reconocimiento de nicamente una secuencia muy especfica apenas 5-10 nucletidos. de de el de

La ventaja del uso de estos enzimas es que, al cortar por secuencias muy especficas, permiten comparar si dos DNAs de diferentes organismos presentan cambios en su secuencia, aunque no la conozcamos. As, puede suceder que un individuo de una poblacin. A presente la secuencia reconocida por el enzima X, pero en una poblacin B alejada evolutivamente esta secuencia se haya modificado por una sola mutacin. Por tanto, este enzima ya no reconocer la secuencia y no cortar el DNA por ese punto. Si se corta con este tipo de enzimas, el DNA da lugar a fragmentos que pueden identificarse por su tamao mediante una electroforesis.

La tcnica de la PCR permite, pues, amplificar selectivamente fragmentos de DNA. Por tanto, es posible extraer y amplificar material gentico de individuos pertenecientes a grupos taxonmicos distintos. As, cada grupo taxonmico debera tener un DNA con caractersticas propias por el efecto acumulativo de las mutaciones durante su evolucin, y grupos diferentes presentaran secuencias diferenciables. De esta manera, es posible realizar comparaciones entre individuos muy alejados filogenticamente, y comparar si cada grupo (filo, orden, familia, etc.) puede caracterizarse molecularmente.

Una de las grandes utilidades de estas tcnicas consiste en diferenciar y caracterizar especies cuando los habituales criterios anatmicos o morfolgicos no son suficientes de por s (sea por la variabilidad intraespecfica de los mismos, por la existencia de similaridades interespecficas, por el reducido tamao de los organismos, por la existencia de dimorfismo sexual, etc.). Precisamente, estas tcnicas han sido empleadas exhaustivamente en la caracterizacin de organismos microscpicos o de reducido tamao, especialmente en el mbito de la Microbiologa y la Parasitologa. Entre los organismos superiores, su uso es todava bastante ms restringido, aunque seguramente se extender exponencialmente en los prximos aos.