Tecnologa del DNA

recombinante
Curso: Biologa Celular y Molecular Oscar Nolasco Crdenas MSc.
oscarnol@hotmail.com
Diciembre 2013

Tecnologa del DNA recombinante

DNA recombinante: Es el DNA compuesto por
segmentos de DNA de diferentes orgenes

Dos importantes enzimas en la generacin de DNA recombinate Enzimas de restriccin:

Corta el DNA de un organismo en una secuencia especifica.

DNA Ligasas:
Une fragmentos de DNA produciendo DNA recombinates.

Mecanismo para cortar y unir DNA

Enzima de restriccin

Enzima de restriccin: EcoRI

Secuencia de reconocimiento palindrome

5` 3`

GAAT T C C T TAAG
Corte

3` 5`

5` 3`

AAT T C G
Extremos cohesivos

3` 5`

C T TAA

DNA Ligasas
5` 3` OH T T A A 5` P 3`
P Unin por complementaridad P de pares de bases

OH

A A T T T T A A
P OH

3` 5`

+
5` A 3`
B 5`

Fragmentos B y C no apareados

OH T T A A OH C G

DNA ligasas

3`

P 5` A A T T 3`

C 5`

3`

OH T A C G

3`

T T A A

5`

Clonacin
Generar copias idnticas de un organismo, clulas o secuencias de cidos nucleicos de un organismo
La oveja Dolly Genes clonados
Tecnologa desarrollada para clonar genes

Involucra la intervencin humana. Origina una nueva generacin

Elementos necesarios para una clonacin de secuencias

Vector segmento de DNA con propiedad de replicarse y ser funcional dentro de un organismo. Posee un segmento de seleccin (antibitico) y otro de insercin de un DNA forneo Plasmidos, bacteriofagos,adenovirus, baculovirus, El hospedero celular organismo que sirve para albergar al vector y su inserto. E.coli, levadura, celulas humanas, celulas insecto Secuencia a insertar INSERTO segmento de DNA de inters que queremos reproducir y/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen, cDNA, etc.
Vector Plasmido

Fragmento de DNA para ser clonado

ORI

Amp R.

ORI Vector Plasmido

Amp R.

Las clulas que no tienen el plasmido mueren en placas con ampicilina

Fragmento DNA a ser clonado

El vector es cortado y ligado al inserto

Plasmido Transformacin de E.coli Recombinante (CaCl2, electroporacin) Cultivadas en placas Cromosoma conteniendo ampicilina Bacteriano

Las clulas transformadas son las que sobreviven

El plasmido tiene una replicacin independiente

Multiplicacin celular

Plasmidos
Permite insertos menores de 10 kb Existen una gran variedad de plasmidos y son la base del desarrollo de los otros sistemas de clonacin

Bacteriofagos

Permite insertos de 20 30 kb Lambda es el bacteriofago comnmente empleado Presenta mayor eficiencia en transformar clulas en comparacin a los plasmidos

Cosmidos
Permite la insercin de 40 Kb Los cosmidos combinan los elementos esenciales de un plasmido y un bacteriofago BACs permiten la insercin de 300 kbs. El factor F de E.coli es capaz de mantener fragmentos largos de DNA. YACs permiten la insercin de 300-500 kbs. YACs : un centromero de levadura con dos telomeros de levadura. Un origen de replicacion bacteriano marcadores de seleccion. YAC plasmidoCromosoma de levadura

Bacterial Artificial Chromosomes(BACs) Yeast Artificial Chromosomes(YACs)

Multiple cloning site (Polylinker)

Blue/White Seleccin

Bibliotecas de DNA:
Colleccin de secuencias diferentes de DNA de un organismo cada cual ha sido clonada en un vector para su purificacin, almacenamiento y Bibliotecas genomicas analisis
Bibliotecas de DNA
(Hechas a partir de DNA Genomico total o de cromosomas ) Usos secuenciamiento anlisis de secuencias

Bibliotecas de expresin o de cDNA

(Hechas de cDNA- copia de mRNA) Usos anlisis de protenas Expresin de genes, los vectores para esta finalidad tienen que tener un promotor fuerte de expresion

Complejidad del genoma y banco genmico

Genoma completo (23 pares de cromosomas) alrededor de mil libros3,200 millones de letras, 1 milln de pginas.
1 cromosoma promedio, equivalente a 30 libros grandes (30,000 pginas, 100 milllones de letras, 700 genes). Demasiado grande Necesidad de DNA recombinante: Banco genmico: Genoma compilado en coleccin de 30,000 separatas de 30-50 pginas. Cada uno con espacio para uno o pocos genes. Permite anlisis detallado de cualquier lugar del genoma. Facilita identificacin de genes y marcadores.

1 pgina 3000 letras 1 libro grande mil pginas 3 millones letras

Clonacin de cromosoma en diferentes clones a diferentes escalas segn su tamao

33,000 clones BAC por juego haploide (entre 57X veces el tamao completo de DNA) para cubrir 95-98% genoma

BAC plsmido secuencia

Separatas pginas prrafos

Digestin Parcial

Digestion Incompleta Baja concentracin de la enzima

EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I

Digestin Completa Alta concentracin de la enzima

EcoR I Digestion Parcial

Celulas infectadas

Biblioteca Genomica

Miles de clones BACs en placas Petri

Trasladadas a placas de microarreglos (microarrays) 4 arreglos de 384 (16X24) BACs

Bibliotecas de expresin Aislacin de mRNA

Porque expresar? Cuando el producto de la secuencia clonada es una protena. La identificacin de un gen en una libreria o biblioteca requiere de su expresin. Para sobreproducir una protena y purificarla. Para estudios in vivo de la protena.

La mayora de mRNAs eucariotes son poliadenilados en el 3

5 cap

AAAAAAAAAAn

Oligo (dT) pueden enlazarse a poli(A) y pueden usarse para recuperar mRNA.

Sintesis de cDNA :

Sintesis de la primera hebra:

transcriptasa reversa
Screening por Expresin
Identificacin del producto proteico del gen de interes

1. Actividad de la protena 2. Western blotting empleando un anticuerpo especifico

Screening o buscado una clona recombinante en una biblioteca de cDNA con un anticuerpo como sonda

Algunas protenas recombinantes en salud humana

Insulina Interfern Alfa Interleukinas Factores VIII, IX de coagulacin Activador tisular del plasmingeno Hormona del crecimiento HGH Vacunas (anticuerpos y antgenos) Diabetis Cancer Cancer

Dwarfism Estatura corta Herpes, Hepatitis B vacuna Malaria AIDS

Animales transgnicos
Animales que portan genes o secuencias de DNAexgeno, introducidos por intervencin humana (Ejm. ratones con insulina humana). Procedimiento: microinyeccin de ovocitos (lento e ineficaz para incorporar el DNA) Son utilizados para generar Modelos animales: comportamiento de un gen in vivo Son utilizados como animales bioreactores: Como produccin de leche con proteinas adicionales. Posibilidad de uso en xenotransplantes Mas difcil que procariotes pero expresin mas correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal, etc.

Mtodos de transferencia de genes Microinyeccion directa Mediada por virus Embrionica stem cells Transferencia Nuclear Sperm-mediated gene transfer Transferencia de genes mediante cromosomas artificiales

Transgenesis in Mice Microinjection

Transgenesis in Mice Retroviral Vector

 Embrionicas stem cells Derivada del embrion en estado de blastocito

Dividida in vitro indefinidamente sin diferenciacion Pueden ser transfectados con transgenes o con remosion de genes (knockout)

 Transferencia nuclear Dolly 1997

Las clulas somticas pueden ser transfectadas o geneticamente alteradas antes de la transferencia nuclear

Biorreactores de protenas humanas (No en bacterias porque no realizan modificaciones postranscripcionales ni postraduccionales)

Cabra transgnica con TPA humano (tissue plasminogen activator) en leche

Transgnico con lactoferrina humana

Biofortificacin GOLDEN RICE

Arroz fuente de alimento para mayor parte de pases pobres de Asia y frica Falta Vitam. A: Ceguera y problemas corneales hasta 40% poblacin Vitamina A se encuentra en cscara y partes verdes ; pero no en grano Golden rice: arroz transgnico con Vit A en granos, meta dosis diaria de Vit A en un plato: conseguida (150ug/100g arroz) Profesores Peter Beyer (U. Freiburg, Alemania) e Ingo Portrykus (Inst Tec. Fed Suiza), con compaa Syngenta (patentado), donacin a pases en desarrollo.

Genoma Humano
46 cromosomas: 22 pares autosomas + XX/XY 3.2 X 109 pares de bases (bp) haploide Menos de 25,000 genes traducidos a protenas (vs 120,000 a 70,000 inicial). Drosophila 14,000, C. elegans 18,000 Humanos: ms de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicing alternativo: 1 gen varias protenas segn el tejido Catlogo de genes humanos y sus secuencias para genes candidatos a enfermedades. Inmensas cantidades de secuencias repetidas (40% del total), muchas polimrficas. Ejm. Alu (cicatriz de transposones), microsatlites. Desarrollo de databases genmicas y de expresin en otras especies, acceso libre Internet. Logros Genmica => transcriptoma, protema, metaboloma. Evolucion entre organismos Modelos: bacterias, levaduras, Arabidopsis, drosophila, ratn. Correlacin de SNPs con los estados de salud y enfermedad Susceptibilidad y prediccin de enfermedades

Genoma Mitocondrial
Mitocondrial:
1 cromosoma circular X 100s 16, 569 bp 37 genes: 13 prot, tRNAs Enfermedades raras neurodegenerativas, musculares y pticas Enfermedades degenerativas comunes: diabetes, Alzheimer, cncer

Variabilidad del Genoma Humano

Identidad 99.9% => 0.1% variabilidad (3 millones de bases) Variabilidad en casi todos los genes y regiones -5 millones de mutaciones puntuales polimrficas (SNPs) hasta ahora. Miles de marcadores genticos en todas las regiones cromosmicas (facilita estudio de mapeo de genes y diagnstico en familias y en poblaciones) Algunos genes inactivos o ausentes en individuos normales: CCR5 Otros genes duplicados: CYP2D6 (40% de frmacos) Inters por poblaciones no estudiadas previamente (ejm. Sudamericanas)

Aplicacin Prctica
Identificacin de genes causales de enfermedades 3, 500 - 5, 000 enfermedades hereditarias, estados previos asintomticos, intermedios, alternativos Conocimiento de procesos normales y enfermedades. Reconsideracin conceptual de enfermedades raras, comunes, propensiones Tests de diagnstico (comparacin de genes normales vs afectados) Anlisis del material gentico para factores de riesgo Prevencin (multifactoriales) Conocimiento de protenas Protenas recombinantes Farmacoterapia molecular Farmacogentica Terapia gnica

Diagnstico Molecular
Caracterizacin de mutaciones causales en genes o marcadores asociados a enfermedades. Diagnstico en pacientes, prenatal (microvillosidades corinicas 8-11 sem, amniocentesis 12-18 sem), presintomtico, preimplantacional. Sirve para determinar la enfermedad: pronstico, prevencin, tratamiento, terapia, consejo gentico en posibles portadores, etc.

 TECNOLOGIAS DE DIAGNOSTICO
Tecnologas de diagnostico basadas en cidos nucleicos (NAT) Tecnologas de diagnostico NO basadas en NAT

 Tecnologas de diagnostico basadas en cidos nucleicos (NAT)

PCR: Mtodos basados en amplificacin FISH : Mtodos basados en hibridacin

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tcnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis Basada en el descubrimiento de la actividad biolgica a altas temperaturas de las DNA polimerasas encontradas en bacterias termfilas.

Kary Mullis 1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullisautobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

PCR - Aplicaciones
La tcnica de PCR es una herramienta esencial dentro de la biologa molecular:

clonacin secuenciacin diagnstico Mutagnesis sitio-dirigida Anlisis de mutaciones Cuantificacin de diferencias en expresin gnica (RTPCR) Pruebas de paternidad Anlisis forense Control de calidad a nivel industrial

 PCR: Mtodos basados en amplificacin

Pruebas de amplio rango genes altamente conservados y polimrficos: Genes Ribosomales Pruebas mltiples que permiten la deteccin paralela de especies

 De PCR clsico a PCR en tiempo real basado en la deteccin de fluorescencia. Mayor robustez del sistema, menos laboriosa, menos contaminacin. Cuantificacin relativa y absoluta PCR en tiempo real son mas costosas y los sistemas todava no alcanzan su desarrollado para su masificacin. Presencia de inhibidores en la muestra

Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp. Kathy A. Mangold,1,2 Rebecca U. Manson,2 Evelyn S. C. Koay,3,4 Lindsey Stephens,1
MaryAnn Regner,1 Richard B. Thomson, Jr.,1,2 Lance R. Peterson,1,2 and Karen L. Kaul1,2* JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 24352440 Vol. 43, No. 5

Xpert MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance. Stephen D Lawn and Mark P Nicol

Mtodos basados en hibridacin

PNA FISH Evolucin de una sonda de nucletidos a una sonda de acido nucleico peptdico PNA es un oligomero sinttico que imita la estructura del DNA o el RNA, la carga negativa del esqueleto azcar fosfato es remplazada por una molcula sin carga N-(2 aminoetil) glicina al cual se une la base nitrogenada por un enlace metilen carbonil Son menos susceptibles de inhibicin por impurezas en diferentes muestras clnicas a comparacin de los mtodos basados en amplificacin

 Tecnologas de diagnostico NO basadas en NAT

Uso de anticuerpos Uso de bacteriofagos (MicroPhage) Herramientas de proteomica: matrix-assisted laser desorptionionization time-offlight mass spectrometry (MALDITOF MS)

SECUENCIAMIENTO DE ADN
Determinar el ordenamiento de los nucletidos en un fragmento de ADN

Dos Mtodos desarrollados a fines de los 70s:

Mtodo Qumico Maxam y Gilbert Mtodo Enzimtico Sanger de anlisis post reaccin
Ambos basados en la obtencin de molculas con terminaciones en A, G, C y T; para separar estos fragmentos en geles de poliacrilamida denaturantes.

Radioactividad reemplazado a partir de 1987 Dideoxinucleotidos marcados fluorescentemente

Diciembre 2000
Un consorcio internacional completa el secuenciamiento del genoma de la primera planta Arabidopsis thaliana de125 Mb. Febrero 2001 El consorcio HGP publica su borrador en Nature (15 Febrero), y Celera lo publica en Science (16 Febrero)

Nuevos mtodos de secuenciamiento Pirosecuenciamiento

Secuenciamiento Masivo permite obtener genomas en menor tiempo

Load beads into PicoTiterPlate
Load Enzyme Beads

Centrifuge Step

44 m

MICROARRAYS