4.

2 Efecto del pH y
Temperatura sobre la
Actividad Enzimtica
Dr. Gerardo Saucedo Castaeda
Departamento de Biotecnologa
saucedo@xanum.uam.mx
Colaboradores
Ma. Esmeralda Bibin Len
A. Daniel Martnez Velasco

Efecto del pH
La mayora de las enzimas poseen un pH
caracterstico al cual su actividad es mxima.
Por enzima o por debajo del pH ptimo la actividad
disminuye.
La relacin entre el pH y la actividad de cualquier
enzima depende del comportamiento acido-base de la
enzima y del sustrato, as como de muchos otros
factores.
La forma de la curva de actividad-pH vara con la
concentracin de sustrato, ya que el valor de Km de
muchas enzimas vara con el pH.
Actividad de enzimas con respecto al pH
Como podemos simular este comportamiento ?
Ecuaciones que describen el efecto del pH

Se pueden obtener formas tiles para representar los efectos del
pH en la actividad cataltica de la enzima usando el siguiente
modelo del estado de ionizacin del sitio activo:
En estas reacciones cido-base, E
-
denota la forma activa
de la enzima, mientras que E y E
=
son formas inactivas
obtenidas por protonacin y desprotonacin del sitio activo
de la enzima, respectivamente.
K1 y K2 son las constantes de equilibrio de las reacciones.


Modelos clsicos basados en de reacciones cido-base
Henderson-Hasselback pH = pK + log [cido/base]


La protonacin y desprotonacin son procesos muy rpidos comparados
con la mayora de las reacciones en solucin, por lo tanto, puede asumirse
que la fraccin de la enzima en el estado inico activo es Y
-
siempre que la
enzima este actuando como catalizador.
Consecuentemente . La influencia en la velocidad mxima de reaccin
Vmax se puede obtener al multiplicar la concentracin de enzima total ET
por la fraccin de la forma activa de la enzima Y-:
Usando esta relacin los datos de la actividad de la enzima pueden ser
usados para evaluar los parmetros K1 y K2.
S S
T
S S
S mx
S
C K
Cs Y E kcat
C K
C V
v r
+
=
+
= =

] [
] [ max

= Y E kcat V T
Despus de escribir las relaciones de equilibrio para las dos reacciones:
E
H E
K
H E E
+
+
=
+
1
La enzima total esta dada presente, por:
Donde pK1 y pK2 es definido como
log K1; log K2

+ =
+ =
=
+
E
H E
K
H E E
2
=
+ + = E E E E
TOTAL
=
+ +
=
E E E
E
Y
La fraccin para cada tipo de enzima esta dado por :
=

+ +
=
E E E
E
Y
=
=
=
+ +
=
E E E
E
Y
2
2 1 2
1
] [
+ +

=
+

= =
=
H
K EK
H
K E
E
H
K E
E
2
2 1 1
] [
1
1
+ +
+ +
=
H
K K
H
K
Y
+
+

+ +
=
H
K
K
H
Y
2
1
1
1
2 1
2
2
] [
1
1
K K
H
K
H
Y
+ +
=
+ +
=
) (
2
1
) (
2 1
pK pK ptimo pH + =
S S
T
S S
S mx
S
C K
Cs Y E kcat
C K
C V
v r
+
=
+
= =

] [
] [ max

= Y E kcat V T
Efecto del pH
+
+

+ +
=
H
K
K
H
Y
2
1
1
1
Efecto del pH y pK en la forma activa E
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
0 2 4 6 8 10
pH
Y
,

Y
`
,

Y
`
`
Y
Y
Y`
pK1=4 y pK2=7
pK1=4.5 y pK2=5.5
Efecto del pH y pK en la forma activa E
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
0 2 4 6 8 10
pH
Y
,

Y
`
,

Y
`
`
Y
Y
Y`
Efecto de la Temperatura

La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se
incrementan en general con la temperatura, dentro del
intervalo donde la enzima es estable y permanece totalmente
activa.
Las enzimas, al ser protenas se desnaturalizan por la accin
del calor y se inactivan cuando la elevacin de la temperatura
sobrepasa un cierto punto.
La temperatura ptima de una enzima es el resultado de dos
procesos:
1) El incremento habitual de la velocidad de reaccin con la
temperatura.
2) El incremento de la velocidad de desnaturalizacin trmica de
la enzima al sobrepasar un temperatura crtica.


Para describir el efecto de la temperatura sobre la cintica
enzimtica se recurre a la ecuacin de Arrhenius:

Donde:
Ea= energa de activacin A= Factor frecuencia
R= Constante de los gases 1.987 cal/mol K; 8.314J/molK
T= Temperatura en K
(1)
(

= = =
RT
E
A k V
A
cat exp max max
Actividad
Temperatura
20 30 40
Ecuacin de Arrhenius
limitada a la zona de
activacin
(

= =
RT
E
LnA Lnk Lnv
A
1/T(K)
Ln(k)
Ln(A)
m = -Ea/R
Aplicacin de la ecuacin de Arrhenius en 2 puntos
(

=
1 2 1
2
1 1
T T R
E
k
k
Ln
A
Tomando logaritmos y dividiendo la segunda expresin entre la primera se llega
(

=
1
1
exp
RT
E
A kcat
A
(

=
2
2
exp
RT
E
A k
A
cat
T2 > T1

|
|
.
|

\
|

=
1
2
1 2
1 2
k
k
Ln
T T
T RT
E
A
Que informacin adicional podemos obtener ??
( )
10
1 2
10
Q Ln
T RT
E
A
=

EA |
.
|

\
|
mol
Cal.


Q
10

Difusin 6,000 1.4
Procesos biolgicos 12, 600 2
Qumicos 50, 000 15.5

La estimacin de Q10 ?? Puede dar indicios de limitaciones de transferencia de masa
EJERCICIOS
Efecto de la temperatura
Actividad
Temperatura
20 30 40
Como podemos simular este comportamiento ?
Esener y Roels desarrollaron una ecuacin basada en una reaccin
reversible de la forme actva e inactiva de la enzima en funcin de la
temperatura
E activa E inactiva
|
.
|

\
|
+
|
.
|

\
|

=
RT
E
B
RT
E
A
A
A
2
1
exp 1
exp *
k
Aplicacin a la FMS
de yuca por A. niger
Se podr simular el efecto simultneo de
de la temperatura y del pH ??
Recordemos lo que ya sabemos
S S
T
S S
S mx
S
C K
Cs Y E kcat
C K
C V
v r
+
=
+
= =

] [
+
+

+ +
=
H
K
K
H
Y
2
1
1
1
( )
( ) RT E B
RT E A
kcat
A
A
/ exp 1
/ exp *
2
1
+

=
1
5
.
0
0
2
0
.
0
0
2
5
.
0
0
3
0
.
0
0
3
5
.
0
0
4
0
.
0
0
4
5
.
0
0
5
0
.
0
0
C
1
C
9
C
1
7
C
2
5
C
3
3
C
4
1
C
4
9
C
5
7
C
6
5
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.18-0.20
0.16-0.18
0.14-0.16
0.12-0.14
0.10-0.12
0.08-0.10
0.06-0.08
0.04-0.06
0.02-0.04
0.00-0.02
Efecto del pH
Efecto de la temperatura
Actividad
Temperatura
20 30 40
Actividad
Temperatura
20 30 40