Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tpicos
1. DNA 2. PCR
Alvos Denatura !o Primers Anelamento

Ciclos Re"uerimentos

DNA
DNA # um $ci%o nucl#ico composto %e %uas ca%eias antiparalelas complementares. &s nucleot'%eos s!o compostos %e um (rupo )os)ato* uma pentose e uma +ase nitro(ena%a

DNA
, Ac-car %o DNA
.ci%o Deso/irri+onucleico

, A -car %o RNA
.ci%o Ri+onucleico

DNA
& DNA tem "uatro +ases nitro(ena%as. , Duas s!o chama%as purinas
A%enina ( A )* 0uanina ( 0 )

, Duas s!o pirimi%inas

Citosina ( C )* Timina ( T )

DNA
1ssas "uatro +ases s!o li(a%as em um pa%r!o repetitivo por pontes %e hi%ro(2nio entre as +ases nitro(ena%as A li(a !o %e %uas ca%eias complementares # chama%a %e 345R4D46A78&.

DNA
9ma purina sempre se li(a a uma pirimi%ina para manter a estrutura %o DNA. A%enina ( A ) se li(a a timina ( T )* atrav#s %e %uas pontes %e hi%ro(2nio. 0uanina ( 0 ) se li(a a citosina ( C )* atrav#s %e tr2s pontes %e hi%ro(2nio.

DNA
1/amplo %e pa%r!o %e li(a !o. , Pa%r!o prim$rio CC0AAT000AT0C 00CTTACCCTAC0 , Pa%r!o complementar

DNA :olecule
A%enina Timina 0uanina Citosina

PCR
PCR (Rea !o em Ca%eia %a Polimerase) # uma t#cnica "ue ampli)ica uma se"u2ncia espec')ica %e DNA* como o+;etivo %e torn$< la a+un%ante e %ispon'vel para %iversas t#cnicas %e +iolo(ia molecular.

&= Alvos %o PCR

&s alvos a serem consi%era%os no PCR s!o as re(i>es "ue )lan"ueiam a se"u2ncia espec')ica %e DNA a ser ampli)ica%a* a "ual po%e ser um (ene inteiro ou somente uma re(i!o pe"uena.

PCR Tar(ets
& n-mero %e +ases nos alvos po%e variar. TTAA00CTC0A . . . . AATT00TTAA & . . . . Representa o meio %a se"u2ncia %e DNA* e n!o h$ pro+lemas em n!o conhec2< la para po%er ampli)ic$<la.

PCR < Desnatura !o

A %esnatura !o # o primeiro passo %o PCR* no "ual as )itas %e DNA s!o separa%as atrav#s %e a"uecimento a ?@AC.

PCR Primers
&s primers s!o se"u2ncias %e 1@ a BC nucleot'%eos* )ita -nica* "ue s!o usa%as para )lan"uearem as e/tremi%a%es %a re(i!o a ser ampli)ica%a. :arcam o in'cio e o )im %a seu"2ncia<alvo.

PCR Primers
9m primer para ca%a e/tremi%a%e %a sua se"u2ncia alvo %eve ser %esenha%o* para "ue as )itas se;am copia%as simultaneamente em am+as as %ire >es.

PCR Primers
TTAAC00CCTTAA . . . TTTAAACC00TT AATT0CC00AATT . . . . . . . . . .D e E. . . . . . . . . . AAATTT00CCAA TTAAC00CCTTAA . . . TTTAAACC00TT

PCR Primers
&= primers s!o coloca%os em e/cesso na rea !o %e PCR* para "ue eles se li(uem ao DNA alvo* ao inv#s %as %uas )itas se li(arem %e novo uma a outra.

PCR < Anelamento

& anelamento # o processo atrav#s %o "ual %uas se"uencias %e nucleot'%eos s!o li(a%as atrav#s %a )orma !o %e pontes %e hi%ro(2nio. Na rea !o %e PCR* o anelamento se %$ atrav#s %a li(a !o %os primers com o DNA Alvo* a temperatura %e @@AC.

PCR Ta" DNA Polimerase

& nome Ta" vem %e Thermus a"uaticus* a "ual # uma +act#ria encontra%a so+reviven%o a altas temperaturas em (eisers no FelloG =tone National ParH.

PCR Ta" DNA Polimerase

1ssa +act#ria pro%uI uma enIima DNA polimerase* a "ual ampli)ica o DNA a partir %o anelamento com os primers* na presen a %e :0* a altas temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Cycles

PCR Ciclos
, Desnatura !oJ ?KA< ?@AC , AnelamentoJ @@A< L@AC , 1/tens!oJ M2A , N-mero %e ciclosJ 2@<KC

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos
N-mero %e cpias %a Re(i!o alvo %e DNA A N 2n n N n-mero %e ciclos

PCR Re"uerimentos
, Cloreto %e :a(n#sioJ .@<2.@m: , Tamp!oJ p3 O.B<O.O , %NTPsJ 2C<2CCP: , PrimersJ C.1<C.@P: , DNA PolimeraseJ 1<2.@ units , DNA AlvoJ 1 P(

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de No remover a faixa de clulas brancas.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Extrair cuidadosamente 200ul da regio de clulas brancas E separar em tubos identificados

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Adicionar Protease a Cada tubo Adicionar ampo de !ise em cada tubo

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

"eali#ar $omogenei#a%o Criteriosa do material

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

&ncubar os tubos A '(C por pelo )enos *0min.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Centrifugar os tubos para retirar +uais+uer grumos Adicionar etanol para lavagem e centrifugar de novo.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Adicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

ubo com coluna
A coluna vai ser retirada e adaptada em outro tubo no +ual ser, feita a elui%o Coluna.

Esse eluato -flo. t/roug/0 ser, 1escartado.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

A coluna ser, colocada em um novo tubo, aonde ser, !avada mais duas ve#es com tampo, para retirar +uais+uer )olculas +ue no este2am ligadas fortemente a coluna.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

A coluna com o tu+o # ent!o centri)u(a%a :ais uma veI* para remover e/cesso %e Tamp!o %e Qava(em. & pr/imo passo # a%icionar Tamp!o %e 1lui !o , 4ncu+a<se por BC minutos a 2@C , & eluato %a coluna # ent!o (uar%a%o* pois a(ora esse cont#m o DNA Alvo.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Ento pode3se preparar o mix de PC". )ix de PC" *0x 4uffer 3 *0 5l )gCl 3 ( 5l dN Ps3 0.6 5l Primer for.ard 3 2 5l Primer reverse 3 2 5l a+ polimerase 3 0.' 5l $27 estril 3 89.8 5l

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

Adicionar ao mix de PC" a amostra de 1NA em tubos Espec:ficos e colocar em termociclador.

1/tra !o %e DNA %e c#lulas san(u'neas

An,lise do produto de PC".

5i+lio(ra)ia
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